Matériels et méthodes

I.2.1 Activation de zones du système nerveux central en réponse à des repas protéiques chez le rat

24 rats Wistar mâles sont habitués à un protocole alimentaire séparé en deux parties : un repas calibré de 3g (1:2 poudre pour eau) pendant 30’ suivi d’une période ad libitum de P14 (1:1) 90’ après le début de l’ingestion de la charge. Les rats sont divisés en 4 groupes et

alimentés pendant 2 (groupes aigus P14A et P55A) ou 21 jours (groupes chroniques P14C et P55C). Chaque jour, les rats reçoivent la charge qui correspond à leur groupe, et la consommation de la première heure de consommation ad libitum de P14 est mesurée. Les groupes P14A et P55A sont sacrifiés 90’ après le début de l’ingestion de la charge à J2, et les groupes P14C et P55C dans les mêmes conditions à J21. Les rats sont alors perfusés avec du paraformaldéhyde 4% avec de l’acide picrique et les cerveaux sont prélevés (pour détails voir article 1). Les cerveaux sont ensuite congelés et découpés dans un cryostat à 20µm et les coupes montées sur lames. Les régions prélevées couvrent la partie du NTS commune avec l’area postrema ainsi qu’une partie du NTS caudal (de -14.5mm à -13.3mm), la région hypothalamique au niveau de l’ARC (de -4.5mm à -2.1mm), et l’AccSh (de +1.2 mm à + 3.0 mm par rapport au Bregma). Un double marquage est alors effectué pour chaque coupe pour révéler la protéine Fos (marqueur de l’activité neuronale) et le phénotype étudié (noradrénergique ou GLP-1 dans le NTS, POMC dans l’ARC, GABA et récepteur µ-opioides dans l’AccSh). Ces marquages sont effectués par immunohistochimie avec une révélation enzymatique (pour détails voir article 1). Concernant les marquages dans l’AccSh, les anticorps primaires utilisés sont un anti-GABA, fait chez la chèvre, dilué au 1:1000 et un anti µ-MOR1 (AB1774, Chemicon), fait chez le cobaye, dilué au 1:2000.

I.2.2 Hypothèse du cortex pyriforme antérieur comme chimio-senseur des acides aminés indispensables chez le rat

Des lésions bilatérales de trois types ont été réalisées sur des groupes de rats séparés, à des coordonnées stéréotaxiques identiques (AP +3.0mm par rapport au Bregma, L ±3.1mm, D - 6.3mm sous cortex), identifiées grâce à l’atlas de Paxinos et Watson, et qui couvrent la région connue pour être impliquée dans la détection des régimes déficients en AAI. Une première expérience a été menée en pratiquant des lésions à l’acide iboténique, analogue du glutamate, qui surexcite et entraîne ainsi la mort cellulaire des neurones glutamatergiques (spécifiquement ceux portant des récepteurs NMDA) (Jarrard, 1991, Inglis & Semba, 1997). Une deuxième série a été lésée à l’acide kainique, un autre analogue du glutamate (qui lèse spécifiquement les neurones portant les récepteurs AMPA et kainate). Enfin, dans une troisième expérience, des lésions électrolytiques ont été réalisées. Dans chaque expérience, les rats lésés sont comparés à un groupe témoin (aucune opération) et à un groupe sham (la solution injectée ne contient que

le véhicule utilisé dans le cas des lésions chimiques et l’électrode est descendue et laissée en place durant la même durée que les rats lésés dans le cas des électrolytiques).

Dans les trois expériences, les rats suivent un protocole alimentaire strictement identique : 5 jours de Thr-Dev (régime déficient en thréonine), suivi de 5 jours de P14, puis 2 jours de Thr-Cor (régime Thr-Dev supplémenté en thréonine), suivis de 3 jours de P14, et enfin 3 jours de P55. Les journées de P14 servent à calculer une consommation basale qui permet d’exprimer les résultats en consommation relative par rat. A la suite des trois expériences, les rats sont perfusés au formol 10% (PAF 4% dans le cas des lésions à l’acide kainique), les cerveaux sont prélevés, découpés et colorés au violet de crésyl afin de révéler les structures cellulaires. Cette coloration permet de constater l’étendue des lésions et d’exclure les animaux qui n’auraient pas été correctement et bilatéralement lésés. Pour le groupe lésé à l’acide kainique, un marquage supplémentaire sur un autre jeu de coupes est réalisé, visant à révéler le récepteur Glu-R1 par immunofluorescence (voir article pour détails).

Pour l’étude de l’activation Fos des neurones du CPA^vii, les rats (n=24) ont été soumis au même protocole alimentaire que celui décrit pour les études similaires dans les articles 1 et 3. Les rats ont été divisés en 4 groupes selon la nature de la charge reçue durant le repas calibré (3g) : Thr-Dev, Thr-Cor, P14 et P55. Les comparaisons concernent deux à deux les groupes Thr-Dev et Thr-Cor puis les groupes P14 et P55. Les rats des groupes Thr-Dev et Thr-Cor sont sacrifiés le premier jour suivant la période d’habituation, alors que les rats P14 et P55 sont sacrifiés le deuxième jour, selon le protocole déjà présenté dans les études précédentes. Les cerveaux des rats sont prélevés au niveau du CPA (+ 3.6mm jusqu’à – 0.2 mm).

Les coupes sont ensuite techniquées pour révéler la protéine Fos (sur la totalité de la structure) et le transporteur au glutamate EAAC1 (de +3.6mm jusqu’à +1.8mm). Une fois la révélation de la protéine Fos achevée, les coupes sont incubées pendant 72h (à +4°C) dans l’anticorps anti-EAAC1. Après l’incubation dans l’anticorps secondaire et dans le complexe PAP (1/400^ème), les peroxydases sont révélées par le complexe DAB-nickel, qui colore les cytoplasmes des neurones en gris foncé. Ainsi, les neurones doublement marqués présentent un noyau brun et un cytoplasme gris.

vii Cette étude a été réalisée en collaboration avec Mme Sylvette Gougis.