Tout au long de ce manuscrit, nous avons détaillé les propriétés et singularités de la bactérie en termes d’adaptation de réponse aux modifications de son environnement. Comme tout doit en permanence adapter sa physiologie aux fluctuations physico-
fait preuve d’originialité et que la caractérisation des mécanismes mis en jeu lors de son adaptation à son environnement est vite limitée par des contraintes d’ordre technique qui rendent toutes tentatives
l’activité du répresseur transcriptionnel CtsR chez
L’un des objectifs principaux de ces travaux de thèse était d’étudier le(s) mécanisme(s) de dans la réponse aux stress environnementaux. Afin d’appréhender les mécanismes de régulation de l’activité de comme plateforme d’étude. Notre stratégie reposait inductible par le en fusion transcriptionnelle avec la réprimer l’expression du gène a ainsi été quantifiée par dosage enzymatique. Dans cette étude, nous avons montré que finement régulée par la sé, nous avons mesuré le taux montré que CtsR se fixe sur son site opérateur préférentiellement à des B. subtilis, L.
est donc un capteur intrinsèque de enant clair dissocation du régulateur CtsR avec son site opérateur est , la région responsable de ce caractère thermosensible
. utilisent une technique de mutagenèse aléatoire par traitement pour étudier la . Toutes les mutations donnant lieu à une
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modification de l’activité de CtsR (perte de l’activité de répression à basse température ou maintien de la répression à haute température) concernent des résidus hautement conservés au niveau du domaine HTH, de la région riche en glycine ou de l’extrémité amino-terminale de la séquence peptidique de CtsR (Derré et al. 2000). Les auteurs identifient deux points de mutations empêchant l’inactivation à haute température de CtsR, l’une dans l’extrémité amino-terminale (V16M) et l’autre au niveau de la région centrale riche en glycine (G65S) de CtsR (Derré et al.
2000). Cependant les travaux de Elsholz portant sur la substitution du gène cstR de l’opéron clpC par une copie portant les mutations V16M et G16S n’ont pas montré de modification de l’activité de CtsR (Elsholz et al. 2010). Ces même travaux montrent que la substitution du résidu 64 (G64P), localisé au sommet du motif tige-boucle formé par le domaine riche en glycine, augmente la thermostabilité de CtsR et empêche l’inactivation du répresseur à haute température chez B. subtilis, L. lactis et G. stearothermophilus (Fuhrmann et al. 2009; Elsholz et al. 2010). De même, la délétion d’un acide aminé dans la région conservée riche en glycine de CtsR confère à une souche piézotolérante de L. monocytogenes une résistance à des traitements thermique, acide et oxydatif ( and Bennik 2002; Karatzas et al. 2003).
La conservation du résidu Glycine n° 64 dans la séquence peptidique de CtsR peut expliquer le caractère thermosensible du régulateur mais en aucun cas les différences de températures seuils variant en fonction de la bactérie. En effet, bien que le domaine riche en glycine semble être responsable de la thermosensibilité de CtsR, il ne semble pas être le déterminant de la température seuil espèce-dépendante du régulateur. En raison de la parfaite conservation des motifs dans la séquence peptidique de CtsR à travers le phylum des firmicutes, il est difficile d'expliquer ce phénomène de la sensibilité à la température espèce-dépendante (Figure 22).
L’implication du domaine de dimérisation dans ce phénomène semble, elle aussi, peu probable, étant donnée la haute conservation du domaine chez les firmicutes. De plus, Elsholz et al.
indiquent que le décrochement de CtsR de son site opérateur n’est pas accompagné d’une dissociation du dimère. En revanche, les auteurs considèrent que le bon positionnement du régulateur sur son site opérateur serait affecté par la hausse de température (Elsholz et al. 2010).
L’alignement des séquences peptidiques de CtsR de différents représentants du phylum des firmicutes tend à classer les espèces bactériennes selon leur ordre ou selon leur famille mais pas en fonction de leur température optimale de croissance (Figure 22). Contrairement à l’extrémité amino-terminale hautement conservée, l’extrémité carboxy-terminale est une région faiblement
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conservée qui présente une importante variabilité (Figure 22) (Derré et al. 2000). Le rôle de cette région reste inconnu, mais il semblerait qu’elle soit impliquée dans la stabilité de la protéine in vivo. En effet suite à un traitement de la protéine CtsR à la trypsine l’extrémité carboxy-terminale se maintien sous forme d’un fragment compact de 9 kDa résistant aux protéases, tandis que la déletion de cette région (aa 53, 72, 76 ou 124 à aa 154/154) entraine une dégradation très rapide de CtsR in vivo (Derré et al. 2000).
Chez O. oeni, l’identification des résidus amino-acides impliqués dans la fonction de thermomètre moléculaire de CtsR pourrait être abordée par la mise en place d’une stratégie similaire à celle utilisée chez B. subtilis de mutagenèse aléatoire par un traitement à l’hydroxylamine par Derré et al. (2000) ou par déstabilisation du ratio purine:pyrimidine dans le mélange réactionnel de la PCR (Derré et al. 1999b). Cependant, il y a fort à parier que nous identifierons les mêmes résidus d’acides aminés essentiels à la fonction de CtsR.
Afin de poursuivre l’étude par l’identification des acteurs moléculaires impliqués dans la régulation de CtsR de O. oeni, nous pourrions donc envisager de construire une souche de B. subtilis pour laquelle les gènes ctsR-mscA-mscB de l’opéron ctsR sont remplacés par le seul gène ctsR de O. oeni (Figure 34 (1)). Le phénotype de cette souche, analysé via la fusion transcriptionnelle phsp18’-bgaB, pourrait confirmer l’hypothèse selon laquelle des gènes homologues à mcsA et mcsB ne sont pas impliqués dans la régulation de CtsR chez O. oeni. En poursuivant cette démarche jusqu’à remplacer l’ensemble de l’opéron ctsR de B. subtilis (ctsR- mscA-mscB-clpC) par l’opéron ctsR-clpL2 (Figure 34 (2)) ou ctsR-clpL1 (Figure 34 (3)) de O. oeni, nous pourrions ainsi valider le rôle des clpL dans la régulation de CtsR.
Figure 34 gène ctsR
des 600pb en amont de l’opéron, du gène bases du gène
L’identification des partenaires de CtsR est maintenant incontournable et passe par une étude approfondie des interactions protéine
construction de mutants chez
nous avons récemment entrepris d’étudier les interactions protéine
protéines candidates par un système d’expression hétérologue basée sur une technique de double hybride bactérien. L’absence dans le génome de
de l’activité de CtsR décrits chez
interroger sur le mode de régulation mis en œuvre par la bactérie pour réguler l’activité de son répresseur.
en doigt de zinc (McsA et ClpE), le mécanisme chez ClpX (Derré et al.
ClpL chez
prévention de l’aggrégation de CtsR nous laisse supposer l’implication d’un ou des deux gènes clpL de
l’interruption du gène
n’est pas impliquée dans la régulation de l’activité de CtsR chez les bactéries lactiques (Varmanen et al. 2003)
dérépression partielle des gènes du régulon
Le double hybride bactérien permet la détection d’interactions physiques de deux protéines par le biais de la reconstitution d’une voie de transduction du signal dont le phénotype est facilement observable sur milieu gélosé approprié ou facilement quantifi
colorimétrique
: Stratégie de double recombinaison homologue envisagée pour remplacer l’opéron CtsR de ctsR de O. oeni (1), par l’opéron
des 600pb en amont de l’opéron, du gène bases du gène clpC de B. subtilis.
L’identification des partenaires de CtsR est maintenant incontournable et passe par une étude approfondie des interactions protéine
construction de mutants chez
nous avons récemment entrepris d’étudier les interactions protéine
protéines candidates par un système d’expression hétérologue basée sur une technique de double hybride bactérien. L’absence dans le génome de
de l’activité de CtsR décrits chez
interroger sur le mode de régulation mis en œuvre par la bactérie pour réguler l’activité de son répresseur. Si comme décrits chez
en doigt de zinc (McsA et ClpE), le mécanisme chez (Derré et al. 1999b; Varmanen et al. 2003) ClpL chez S. mutans
prévention de l’aggrégation de CtsR nous laisse supposer l’implication d’un ou des deux gènes de O. oeni dans le mécanisme de régulation de l’activité de CtsR.
l’interruption du gène
n’est pas impliquée dans la régulation de l’activité de CtsR chez les bactéries lactiques (Varmanen et al. 2003)
dérépression partielle des gènes du régulon
Le double hybride bactérien permet la détection d’interactions physiques de deux protéines par le biais de la reconstitution d’une voie de transduction du signal dont le phénotype est facilement observable sur milieu gélosé approprié ou facilement quantifi
colorimétrique (Karimova et al. 1998; Karimova et al. 2000; Karimova et al. 2005; Falord et al.
: Stratégie de double recombinaison homologue envisagée pour remplacer l’opéron CtsR de (1), par l’opéron ctsR
des 600pb en amont de l’opéron, du gène B. subtilis.
L’identification des partenaires de CtsR est maintenant incontournable et passe par une étude approfondie des interactions protéine
construction de mutants chez
nous avons récemment entrepris d’étudier les interactions protéine
protéines candidates par un système d’expression hétérologue basée sur une technique de double hybride bactérien. L’absence dans le génome de
de l’activité de CtsR décrits chez
interroger sur le mode de régulation mis en œuvre par la bactérie pour réguler l’activité de son Si comme décrits chez
en doigt de zinc (McsA et ClpE), le mécanisme chez 1999b; Varmanen et al. 2003) S. mutans (Tao and Biswas 2013a)
prévention de l’aggrégation de CtsR nous laisse supposer l’implication d’un ou des deux gènes dans le mécanisme de régulation de l’activité de CtsR.
l’interruption du gène clpC n’a aucun effet sur l’activité de CtsR ce qui laisse supposer que ClpC n’est pas impliquée dans la régulation de l’activité de CtsR chez les bactéries lactiques (Varmanen et al. 2003) tandis que chez
dérépression partielle des gènes du régulon
Le double hybride bactérien permet la détection d’interactions physiques de deux protéines par le biais de la reconstitution d’une voie de transduction du signal dont le phénotype est facilement observable sur milieu gélosé approprié ou facilement quantifi
(Karimova et al. 1998; Karimova et al. 2000; Karimova et al. 2005; Falord et al.
: Stratégie de double recombinaison homologue envisagée pour remplacer l’opéron CtsR de ctsR-clpL2 (2) ou l’opéron
des 600pb en amont de l’opéron, du gène apha3 (résistance à la kanamycine), du gène
L’identification des partenaires de CtsR est maintenant incontournable et passe par une étude approfondie des interactions protéine-protéine de CtsR avec ses éventuels partenaires. La construction de mutants chez O. oeni relevant davantage d’une utopie que
nous avons récemment entrepris d’étudier les interactions protéine
protéines candidates par un système d’expression hétérologue basée sur une technique de double hybride bactérien. L’absence dans le génome de
de l’activité de CtsR décrits chez B. subtilis
interroger sur le mode de régulation mis en œuvre par la bactérie pour réguler l’activité de son Si comme décrits chez B. subtilis
en doigt de zinc (McsA et ClpE), le mécanisme chez 1999b; Varmanen et al. 2003)
(Tao and Biswas 2013a)
prévention de l’aggrégation de CtsR nous laisse supposer l’implication d’un ou des deux gènes dans le mécanisme de régulation de l’activité de CtsR.
n’a aucun effet sur l’activité de CtsR ce qui laisse supposer que ClpC n’est pas impliquée dans la régulation de l’activité de CtsR chez les bactéries lactiques
tandis que chez dérépression partielle des gènes du régulon
Le double hybride bactérien permet la détection d’interactions physiques de deux protéines par le biais de la reconstitution d’une voie de transduction du signal dont le phénotype est facilement observable sur milieu gélosé approprié ou facilement quantifi
(Karimova et al. 1998; Karimova et al. 2000; Karimova et al. 2005; Falord et al.
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: Stratégie de double recombinaison homologue envisagée pour remplacer l’opéron CtsR de (2) ou l’opéron ctsR
(résistance à la kanamycine), du gène
L’identification des partenaires de CtsR est maintenant incontournable et passe par une étude protéine de CtsR avec ses éventuels partenaires. La relevant davantage d’une utopie que
nous avons récemment entrepris d’étudier les interactions protéine
protéines candidates par un système d’expression hétérologue basée sur une technique de double hybride bactérien. L’absence dans le génome de O. oeni
B. subtilis et L. lactis
interroger sur le mode de régulation mis en œuvre par la bactérie pour réguler l’activité de son B. subtilis et L. lactis
en doigt de zinc (McsA et ClpE), le mécanisme chez
1999b; Varmanen et al. 2003). En outre, l’implication du domaine D2 (Tao and Biswas 2013a)Tao 2013) et le rôle de cette
prévention de l’aggrégation de CtsR nous laisse supposer l’implication d’un ou des deux gènes dans le mécanisme de régulation de l’activité de CtsR.
n’a aucun effet sur l’activité de CtsR ce qui laisse supposer que ClpC n’est pas impliquée dans la régulation de l’activité de CtsR chez les bactéries lactiques
tandis que chez B. subtilis
dérépression partielle des gènes du régulon ctsR (Derré et al. 2000)
Le double hybride bactérien permet la détection d’interactions physiques de deux protéines par le biais de la reconstitution d’une voie de transduction du signal dont le phénotype est facilement observable sur milieu gélosé approprié ou facilement quantifi
(Karimova et al. 1998; Karimova et al. 2000; Karimova et al. 2005; Falord et al.
: Stratégie de double recombinaison homologue envisagée pour remplacer l’opéron CtsR de ctsR-clpL1 (3). Construction par PCR d’u (résistance à la kanamycine), du gène
L’identification des partenaires de CtsR est maintenant incontournable et passe par une étude protéine de CtsR avec ses éventuels partenaires. La relevant davantage d’une utopie que
nous avons récemment entrepris d’étudier les interactions protéine
protéines candidates par un système d’expression hétérologue basée sur une technique de double oeni, des principaux acteurs de la régulation L. lactis (clpE, mcsA
interroger sur le mode de régulation mis en œuvre par la bactérie pour réguler l’activité de son L. lactis, le mode d’action fait intervenir un motif en doigt de zinc (McsA et ClpE), le mécanisme chez O. oeni pourait faire intervenir les protéines
. En outre, l’implication du domaine D2 Tao 2013) et le rôle de cette
prévention de l’aggrégation de CtsR nous laisse supposer l’implication d’un ou des deux gènes dans le mécanisme de régulation de l’activité de CtsR.
n’a aucun effet sur l’activité de CtsR ce qui laisse supposer que ClpC n’est pas impliquée dans la régulation de l’activité de CtsR chez les bactéries lactiques
B. subtilis, l’inactivation de (Derré et al. 2000)
Le double hybride bactérien permet la détection d’interactions physiques de deux protéines par le biais de la reconstitution d’une voie de transduction du signal dont le phénotype est facilement observable sur milieu gélosé approprié ou facilement quantifi
(Karimova et al. 1998; Karimova et al. 2000; Karimova et al. 2005; Falord et al.