Chapitre II Procédures expérimentales
II. Procédures expérimentales
II.4. Souches bactériennes, milieux de culture et conservation
II.4.1. Souches bactériennes utilisées
Toutes les souches types et Escherichia coli décrites ci-dessous ont été utilisées comme souches témoins positifs lors des PCR sur des gènes d’intérêt. Escherichia coli a aussi été utilisée comme cellule hôte de clonage. Leurs caractéristiques génotypiques sont présentées dans le tableau 7.
Tableau 7 : Récapitulatif des souches bactériennes et de leurs caractéristiques génotypiques.
Souches Génotypes Références
Escherishia coli (TOP 10)
F-, mcrA, t(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZtM15, tlacX74, deoR, recA1, araD139, t(ara-leu)7697 galU,
galK, rpsL (StrR), endA1, nupG
Invitrogen
Desulfobacter postgatei Sauvage DSM 2034
Desulfosarcina variabilis Sauvage DSM 2060
Desulfovibrio desulfuricans
subsp. Desulfuricans Sauvage DSM 642
Desulfotomaculum nigrificans Sauvage DSM 574
AR2107
Rhodospirillum centenum-like Sauvage
AR 2107 Souche isolée au laboratoire
II.4.2. Milieux et conditions de cultures II.4.2.1. Culture d’Escherichia coli
La souche de E. coli (TOP 10) a été cultivée sous agitation en milieu liquide riche Luria Bertani (LB : Tryptone 10 g.l-1, NaCl 5 g.l-1, extrait de levure 10 g.l-1) à 37°C. Les isolements de colonies, après transformation, ont été réalisés sur des boites de Pétri en milieu LB additionné d’agar à 15 g.l-1. L’ampicilline (Sigma) à 100 µg.l-1 de concentration finale, a été utilisée comme agent de sélection du plasmide pCR2.1, le X-Gal (30 µg.l-1) comme substrat de la -galactosidase, et l’IPTG (isopropylthio- -D-galactoside 30 µg.ml-1) comme inducteur du promoteur Plac.
Au cours du clonage, l’expression phénotypique du gène de résistance à l’ampicilline au sein de E. coli transformé, est effectuée en milieu riche liquide agité SOC (2 % Tryptone ; 0,5 % extrait de levure ; 10 mM NaCl ; 2,5 mM KCl ; 10 mM MgCl2 ; 10 mM MgSO4 ; 20 mM glucose) à 37°C.
II.4.2.2. Culture des bactéries anaérobies
Les bases minérales sont préparées dans une fiole conique (Figure 22) et stérilisées à l’autoclave pendant 20 min à 121°C sous une pression de 1 bar. Après stérilisation, la fiole est refroidie sous atmosphère N2/CO2 (90/100, v/v) jusqu’à température ambiante.
Figure 22 : Fiole conique utilisée pour la préparation des milieux de culture, d'après Widdel (1980).
Bactéries anoxygéniques phototrophes
Le milieu de culture utilisé est préparé à partir d'un milieu de base synthétique dont la composition est la suivante :
KH2PO4 0.25 g.l-1
NH4Cl 0.50 g.l-1
CaCl2.2H2O 0.05 g.l-1
Solution SL12 sans EDTA* 1 ml.l-1
NaCl** 0 g.l-1 20 g.l-1 50 g.l-1 100 g.l-1 MgSO4.7H2O** 0.4 g.l-1 0.8 g.l-1 1.5 g.l-1 3 g.l-1 MgCl2.6H2O** 1 g.l-1 2 g.l-1 3 g.l-1 6 g.l-1
La base minérale est stérilisée, puis refroidie comme précédemment décrit. Les solutions suivantes sont alors additionnées stérilement :
* cf II.1.3.1 Maintien de tapis microbien en microcosme / Eau de mer synthétique (Camargue et Guérande)
**
• Solution de NaHCO3 : 1,5 g de NaHCO3 dans 30 ml d'eau distillée, préparée dans un tube fermé hermétiquement par un bouchon en butyl sous atmosphère de N2/CO2 (9/1 en volume) et stérilisée à l'autoclave (20 min, 121°C).
• Solution de Na2S.9H2O : 0,5 g (2 mM) de Na2S.9H2O dans 10 ml d'eau distillée, préparée dans un tube fermé hermétiquement par un bouchon en butyl sous atmosphère d'argon ou d'azote et stérilisée à l'autoclave (20 min, 121°C).
• Solution de vitamine V7 stérilisée par filtration (0,2 µm) : 1 ml.
Le milieu est ensuite ajusté à pH 7,0 – 7,4 à l'aide de solutions stériles de H2SO4 et/ou NaOH (2 M). Le milieu est distribué dans des flacons stériles munis de capsules en aluminium vissées avec un joint en caoutchouc. Les flacons sont complètement remplis afin d'éviter la contamination par l'oxygène de l'air et stockés à l'obscurité. Un léger précipité noir de sulfure de fer doit apparaître dans les 24 heures suivant la préparation du milieu.
Remarque : Dans le cas des bactéries photohétérotrophes, 5mM de succinate de sodium et 0,5 g.l-1 d’extrait de levure sont ajoutés à la base minérale avant stérilisation à l'autoclave.
La composition de la solution de vitamines V7 est réalisée selon (Pfennig and Trüper, 1992) : biotine, 2 mg.l-1 ; p-aminobenzoate, 10 mg.l-1 ; thiamine, 10 mg.l-1 ; pantothénate, 5 mg.l-1 ; pyridoxamine, 50 mg.l-1 ; vitamine B12, 20 mg.l-1 ; nicotinate, 20 mg.l-1.
Bactéries sulfato-réductrices (BSR)
Un milieu riche synthétique pour les BSR a été utilisé, adapté d’après (Widdel and Bak, 1992), dont la base minérale est décrite ci-dessous.
La base minérale est ensuite stérilisée, et refroidie comme précédemment décrit. La solution suivante est alors additionnées stérilement :
• Solution de vitamine V7 stérilisée par filtration (0.2 µm) : 1 ml.
Le milieu est ensuite ajusté à pH 7,4 à l'aide de solutions stériles de Na2CO3 (2 M) ou H2SO4 (1 M). Le milieu est distribué dans des flacons pénicilline de 60 ou 100 ml, fermés par des bouchons en butyl, sous atmosphère N2/CO2 (90/100, v/v), et stockés à l’obscurité.
Eau saumâtre Eau de mer
NaCl 7 g.l-1 20 g.l-1
MgCl2.6H2O 1,2 g.l-1 3 g.l-1
CaCl2.2H2O 0,1 g.l-1 0,15 g.l-1
Na2SO4 4 g.l-1 4 g.l-1
NH4Cl 0,25 g.l-1 0,25 g.l-1
KH2PO4 0,2 g.l-1 0,2 g.l-1
KCl 0,5 g.l-1 0,2 g.l-1
CH3 COO Na.3H2O 10 mM 10 mM
CH3CHOHCOOH 10 mM 10 mM
Extrait de levure 0,5 g.l-1 0,5 g.l-1 Na2 S.9H2O 0,1 g.l-1 0,1 g.l-1
NaHCO3 2,5 g.l-1 2,5 g.l-1
Solution d’oligo-éléments SL12 1 ml.l-1 1 ml.l-1
II.4.3. Conservation des souches
Les souches d’E. coli et sulfato-réductrices sont conservées à -80°C, à partir d’une culture dense en phase exponentielle, avec ajout de glycérol stérile à une concentration finale de 20 % (v/v).
Pour la conservation des bactéries sulfato-réductrices, le glycérol stérile employé a été au préalable dégazé sous atmosphère N2/CO2 (90/100, v/v). De même, les flacons de culture (tubes Ungate) sont de nouveau dégazés, après addition de glycérol, sous atmosphère N2/CO2
(90/100, v/v) avant stockage à -80°C.
Les Bactéries phototrophes anoxygéniques (BPA) sont conservées au froid (4°C) et à l’obscurité dans les flacons de leurs cultures liquides en phase exponentielle de croissance.
Les souches peuvent ainsi être gardées plusieurs mois, après quoi, il est nécessaire de les repiquer. Pour cela un flacon est replacé à température ambiante, et exposé à une faible intensité lumineuse (100 lux) pendant 2 à 3 h. Une solution neutre de sulfure et de carbonate (Siefert and Pfennig, 1984) est ensuite additionnée à la culture. La culture peut alors être replacée à une intensité lumineuse plus forte (500 à 1000 lux) puis servir de base pour l’ensemencement d’autres flacons, qui seront de nouveau stockés au froid.
II.5. Techniques de biologie moléculaire