Le fragment [31- ue ous a o s p oduit est ie to i ue lo s u il est i oi je t à l i t ieu de la ellule. Cepe da t, de ou elles s ies de micro-injections, réalisées par Ned La Mo tpellie , o t t essai es pou ua tifie l a ti it toto i ue du peptide et préciser son action sur les mitochondries.
C.2.2.1 Un peptide actif sur différents types cellulaires.
Nous a o s test l a ti it toto i ue du peptide sur trois types de cellules humaines : des fibroblastes (cellules du tissu conjonctif), des myoblastes (cellules souches qui conduisent à la formation des muscles) et des cellules de type U2OS (cellules humaines d ost osa o e . A noter que les fibroblastes et myoblastes viennent de tissus sains, contrairement aux cellules de type U2OS ui so t des ellules d ost osa o es.
En parallèle du fragment [31-53] de la mitogaligine, nous avons également microinjecté le fragment [70-89] de la cytogaligine, qui sert de témoin négatif non toxique.
Etude st u tu ale et fo tio elle du f ag e t d’ad essage.
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Figure 51 - Micro-injection des fragments de mitogaligine et cytogaligine à différentes concentrations. Les expériences ont été réalisées en triplicates, sur chaque type de cellules : U2OS (gauche), myoblastes (milieu) et fibroblastes (droite). Le peptide est microinjecté dans 10 cellules pour le fragment de mitogaligine et 50 cellules
pour le fragment de cytogaligine, puis les cellules mortes sont comptées après une nuit passée à 37°C.
Quel que soit le t pe ellulai e, le f ag e t d ad essage de la itogaligi e est d jà t s actif à 40 nM. A cette concentration, son effet est immédiatement visible sur certaines cellules et on dénombre, heu es ap s l i je tio , 50 à 60% de cellules mortes.
Contrairement au fragment de mitogaligine, le fragment de cytogaligine est très peu actif : il est pas to i ue jus u à M Figure 51).
C.2.2.2 Un peptide cytotoxique dans le cytoplasme.
Nous a o s o pa la to i it du peptide lo s u il est i oi je t da s le noyau et dans le cytoplasme (Figure 52). Pour vérifier et visualiser la micro-injection, de l i u oglo uli e de lapin est injectée en même temps que le peptide : cette protéine est inoffensive pour les cellules testées et peut être facilement visualisée à travers un marquage par des anticorps fluorescents.
Cytoplasme Noyau
Figure 52 - Micro-injection des fragments de mitogaligine et cytogaligine dans le cytoplasme ou le noyau.
Visualisation des cellules 60 min après la micro-injection du fragment [31-53] de mitogaligine : dans le cytoplasme (gauche) ou dans le noyau (droite). Les o au so t olo s pa du leu de Hoe kst haut et l i u oglo uli e injectée avec le peptide est marquée par un anticorps vert (bas). Chaque peptide est microinjecté à 40nM dans
3x25 fibroblastes, puis les cellules mortes sont comptées après une nuit passée à 37°C.
0 20 40 60 80 100
Microinjection dans le cytoplasme
Microinjection dans le noyau
% de cellules mortes
Cytogaligine [70-89]
Mitogaligine [31-53]
Etude st u tu ale et fo tio elle du f ag e t d’ad essage.
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Le fragment de cytogaligine ne présente pas de toxicité quel que soit le compartiment cellulaire microinjecté. Le fragment de mitogaligine par contre entraîne significativement oi s d apoptose lo s u il est i oi je t da s le o au. Le f ag e t d ad essage de la mitogaligine doit donc être localisé dans le cytoplasme pour avoir une activité optimale.
C.2.2.3 Intégrité de la membrane mitochondriale.
Comme le fragment [35-53] (Duneau et al., 2005), le f ag e t d ad essage ito ho d ial [31-53] est apa le de d le he l apoptose ellulai e, p o a le e t e p o o ua t le relargage de molécules pro-apoptotiques situées dans les mitochondries.
Pour vérifier cette hypoth se, ous a o s sui i le ela gage d u e aut e p ot i e contenue dans les mitochondries, la CTMP (Carboxyl-Terminal Modulator Protein).
No ale e t lo alis e da s l espa e i te -membranaire et au niveau de la membrane interne de la mitochondrie, la CTMP est relarguée dans le cytoplasme lors du déclenchement de l apoptose ito ho d iale (Parcellier et al., 2009).
Le a uage de la CTMP ous pe et de ifie l i t g it de la ito ho d ie a a t et après la micro-injection du fragment [31-53] (Figure 53). Avant la micro-injection, la CTMP est localisée dans le cytoplasme de la cellule et au niveau des mitochondries. Si la micro-injection du fragment [70-89] de la cytogaligine ne modifie pas cette répartition, le fragment [31-53] de la mitogaligine en revanche entraîne une perte de signal au niveau des mitochondries.
ADN Immunoglobuline mCherry-CTMP
Cytogaligine [70-89] Mitogaligine [31-53]
Figure 53 – Intégrité de la membrane mitochondriale après la microinjection des fragments de mitogaligine et cytogaligine dans le cytoplasme. Visualisation des cellules 40 min après la micro-injection du fragment
[70-89] de cytogaligine (haut) ou du fragment [31-53] de mitogaligine (bas). Les noyaux sont colorés par du bleu de Hoeckst (gauche), l i u oglo uli e i je t e a e le peptide est marquée par
un anticorps vert (milieu) et la mCherry-CTMP est colorée en rouge (droite).
Cette observation indique que la présence du fragment de mitogaligine provoque le relargage de la CTMP mitochondriale : le fragment [31-53] entraîne bien une perte d i t g it de la membrane des mitochondries.
10 µm
Etude st u tu ale et fo tio elle du f ag e t d’ad essage.
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C.2.2.4 Suivi du peptide par un marquage à la rhodamine.
Pou pou oi isualise le he i e e t du peptide, ous l a o s a u à l aide d u fluorophore placé en position N-terminale. Malheureusement la rhodamine que nous avons utilisée pour le marquage a tendance à entraîner le peptide vers le noyau, que ce soit le fragment de mitogaligine ou celui de cytogaligine.
Il faudra donc se tourner vers un autre type de fluorophore pour pouvoir suivre le peptide microinjecté et visualiser de manière directe sa colocalisation avec les mitochondries.