Carlo Petosa et le Dr Thibaut Crépin pour leur patience, leur gentillesse et le partage de leurs grandes connaissances en cristallographie. Darren Hart pour notre collaboration et l'obtention de constructions solubles de protéine IIIa, au Pr.
INTRODUCTION
H ISTOIRE ET C LASSIFICATION
Dans le modèle actuel, cette position est attribuée au domaine C-terminal de la protéine IX (Saban et al., 2006). Les densités jaune (protéine IX) et orange (protéine IIIa) sont absentes dans le virus sans protéine IX.
E PIDEMIOLOGIE
M ORPHOLOGIE ET S TRUCTURE D ’A DENOVIRUS
- Vue d’Ensemble du Virus
- Les Protéines Structurales Majeures
- Les Protéines Structurales Mineures
- Les Protéines du core
- La Protéase de l’Adénovirus
- Structure et Organisation du Génome d’Adénovirus
L E C YCLE V IRAL
- Les Récepteurs Primaires des Adénovirus
- Fixation au Récepteur Secondaire et Internalisation
- La Phase Précoce d’Infection
- La Phase Tardive d’Infection
Détection du domaine C-terminal de la protéine IX fusionnée à la GFP à la surface de l'adénovirus canin par TEM. Le domaine C-terminal de la protéine IX est un domaine hélicoïdal riche en leucine.
L’I NTERET DES A DENOVIRUS POUR LA T HERAPIE G ENIQUE
MATERIELS ET METHODES
S OUS C LONAGE
Durant ces trois années nous avons tenté de déterminer la structure atomique de la protéine IX par différentes méthodes. Le fragment C-terminal de la protéine IX étudié est trimérique et contient au total 56 acides aminés. Détection du domaine C-terminal de la protéine IX à l'aide d'anticorps spécifiques à la surface de l'adénovirus humain par TEM.
Le mutant IX-∆SYL-∆ala de la protéine IX est supprimé de la région centrale riche en alanine (63–70 aa). Ces observations confirment la localisation du domaine C-terminal de la protéine IX entre deux hexons à l'interface entre deux facettes de l'icosaèdre. L'alignement des séquences de la protéine HAd5 IX et celle de CAV-2 indique : 1- Conservation du domaine N-terminal.
Cependant, des ambiguïtés persistaient quant à la localisation de la protéine IX à la surface de la capside. La comparaison de la structure 3D de HAd5 et de CAV-2 a permis la localisation de la protéine IX dans la capside. D'après la figure ci-dessus, les régions N et C-terminales de la protéine IIIa sont désordonnées.
S UREXPRESSION DANS LE S YSTEME B ACTERIEN
S UREXPRESSION DANS LE S YSTEME B ACULOVIRUS
D ETERMINATION DE L ’E TAT D ’O LIGOMERISATION
- MALLS-SEC
- Pontage Chimique
L A C RISTALLOGRAPHIE AUX R AYONS X
- La Cristallogenèse
- Principe de la Diffraction aux Rayons X
- Traitement des Données
- Facteur de Structure et Densité Electronique
- Obtention des Phases
- Construction et Affinement du Modèle
Cette dernière densité a récemment été attribuée au domaine C-terminal de la protéine IX par les travaux de Saban et al.
LA PROTEINE IX
L A S OLUBILITE DE LA P ROTEINE IX
E SSAI DE D ETERMINATION DE LA S TRUCTURE DE LA P ROTEINE IX
L OCALISATION DE LA P ROTEINE IX
- Etats d’Oligomérisation de la Protéine IX
- Localisation du Domaine C-terminal de la Protéine IX dans la capside d’HAd5
- Localisation de la Partie C-terminale de la Protéine IX dans la Capside du CAV-2
- Discussion
LA PROTEINE IIIA
I NTRODUCTION
La protéine IIIa est présente en 60 exemplaires sous forme de monomère associé à la base penton à l'intérieur de la capside (Fig. 1.12). Identification de fragments protéiques susceptibles d'être solubles sur la base de données bioinformatiques. Nous avons conclu que la région N-terminale est probablement essentielle au bon repliement de la protéine.
L'intention est d'utiliser cette méthode pour rechercher d'autres domaines solubles de la protéine IIIa. Nous considérons la résolution de structure par remplacement moléculaire en utilisant la structure de base penton de HAd2 comme modèle (Zubieta et al., 2005). La structure de la base penton HAd2 a également été obtenue en utilisant des protéines présentant un clivage dans la boucle RGD.
Il est donc possible que la tête de la fibre courte CELO n'interagisse pas avec l'acide sialique.
S OLUBILISATION A PARTIR DE CORPS D ’ INCLUSION
R ECHERCHE DE FRAGMENTS SOLUBLES
Les résultats obtenus par ces différents algorithmes sont cohérents entre eux : la protéine IIIa est visiblement désordonnée du côté N-terminal (20 premiers acides aminés) et également du côté C-terminal (180 derniers acides aminés), comme le montre l'exemple. de la figure 4.3. Au total, douze constructions protéiques IIIa différentes (Figure 4.4) ont été construites sur la base des résultats de prédiction obtenus précédemment. Nous concluons que la région C-terminale désordonnée était probablement responsable de la formation de corps d'inclusion lors de l'expression de la protéine de type sauvage.
La protéine recombinante a d'abord été purifiée par chromatographie d'affinité à l'aide du marqueur poly-histidine puis sur une colonne d'exclusion de taille. La pureté de l'échantillon, révélée par le gel de la figure 4.5, permet son utilisation directe pour les tests de cristallogenèse. Les tests de cristallisation de la protéine IIIa sont effectués dans des nanogouttelettes à l’aide de la plateforme robotique PSB.
Après les résultats peu concluants de la cristallisation de la construction 1-430 de la protéine IIIa, nous nous sommes intéressés à des constructions plus petites de cette protéine et notamment aux constructions 20-410.
C ONCLUSION ET PERSPECTIVES
Nous nous intéressons à la structure du dodécaèdre de HAd3 car nous espérons révéler le repliement des régions manquantes dans la structure réelle de la base du penton de HAd2. Quant à la protéine complète précédemment décrite par Fender et al. 1997), le fragment basique HAd3 de 38 à 544 aa penton a été cloné dans un vecteur d'expression du système baculovirus. Dans les trois gels B, C et D, les deux bandes à 25 et 30 kDa indiquées par un astérisque correspondent à deux fragments de la base penton dégradée.
Cette division ne se produit généralement pas lors de la production de base de penton, donc le Dr. Fender a fourni un échantillon du dodécaèdre non divisé au niveau de la boucle RGD (Figure 5.7). Deux étapes permettent l'internalisation de l'adénovirus : premièrement, la fibre se fixe à un récepteur primaire à la surface de la cellule hôte.
Récemment, une structure 3D de l'adénovirus humain, à une résolution de 6 Å par TEM, a permis une attribution détaillée de la position de la protéine IX à la surface de la capside.
LA BASE DE PENTON DE L’ADENOVIRUS HUMAIN DE SEROTYPE 3
I NTRODUCTION
Dans certains sérotypes d’adénovirus, lors de l’infection, les bases penton s’assemblent en sous-unités virales hautement symétriques appelées dodécaèdres. Il convient néanmoins de noter que la base penton de l'adénovirus de sérotype 2 cristallise sous forme dodécaédrique (Zubieta et al., 2005) en présence de dioxane. D'un point de vue biologique et structural, les plus étudiées sont les particules dodécaédriques de HAd3.
La séquence de bases penton est hautement conservée parmi les sérotypes humains, ayant généralement une identité de séquence de 70 % entre celles de HAd2 et 3. La base penton de HAd3 a 34 résidus de moins dans la boucle RGD et 9 résidus de plus dans la boucle variable par rapport à celle de HAd2. Nous espérons notamment résoudre les structures de la boucle RGD et une partie des acides aminés qui composent l’extrémité N-terminale de la base.
Des tests de cristallisation avaient déjà été réalisés ces dernières années par plusieurs personnes de l'EMBL sur les dodécaèdres HAdV3.
E XPRESSION ET P URIFICATION
Les cristaux obtenus sont très fragiles, se cassant facilement lors de l'ajout de la solution cryoprotectrice et des manipulations mécaniques avec l'anse. L'affinement de l'état de cristallisation initial donnant des cristaux de dodécaèdre a donc permis d'obtenir des cristaux tridimensionnels diffractant jusqu'à une résolution de 3,5 Å. La protéine a été purifiée comme décrit précédemment et les tests de cristallisation ont été réalisés dans des conditions proches de la condition de départ a.
Nous avons observé lors de la collecte de données sur les cristaux de dodécaèdre de HAd3 que le clivage au niveau de la boucle RGD permet une augmentation significative des limites de diffraction. Pour révéler les propriétés de la fibre courte de l’adénovirus aviaire, nous avons résolu sa structure atomique par cristallographie. Pour mesurer l'interaction entre la tête de fibre courte et l'acide sialique, du GP biotinylé a été immobilisé sur une surface Biacore recouverte de strépatavidine.
La structure cristallographique de la tête de fibre courte que nous avons déterminée n’apporte pas de réponse quant à son rôle dans l’internalisation des particules virales.
C OLLECTE ET TRAITEMENT DES DONNEES
C ONCLUSION ET P ERSPECTIVE
The subgenus-specific C-terminal region of protein IX is located on the surface of the adenovirus capsid. Functional complementation of the adenovirus E1B 19-kilodalton protein with Bcl-2 in the inhibition of apoptosis in infected cells. Identification of contact residues and definition of the CAR binding site of adenovirus type 5 fiber protein.
Characterization of sialic acid binding activity of transmissible gastroenteritis coronavirus by analysis of hemagglutination-deficient mutants. Comparison between soluble components of adenovirus types 3 and 16 and intermediate strain 3-16 (San Carlos facility). The coiled-coil domain of adenovirus type 5 protein IX is not required for capsid incorporation and thermostability.
Interaction of the adenovirus major core protein precursor, pVII, with the viral DNA packaging machinery.
LA FIBRE COURTE DE L’ADENOVIRUS AVIAIRE DE SEROTYPE 1
I NTRODUCTION
La base penton se lie ensuite aux intégrines via la boucle RGD conduisant à l'internalisation du virus. Pour connaître le rôle respectif de chaque fibre dans cette interaction, des mutations ont été introduites dans le génome pour perturber soit la fibre longue, soit la fibre courte (Tan et al., 2001). Le virus CELO, dont le génome est dépourvu de la fibre courte, est incapable de générer des particules virales, la fibre courte est donc indispensable à la propagation du virus.
Le virus dépourvu de fibres longues est produit et capable d'infecter les cellules de poulet, mais il perd sa capacité à infecter les cellules humaines exprimant le CAR (Tan et al., 2001). La fibre longue est donc responsable de l'interaction avec le CAR à la surface des cellules humaines (Tan et al., 2001). Il est possible que lors de l'infection la fibre longue s'attache à la surface de la cellule via le CAR et que la fibre courte interagisse avec le récepteur secondaire et provoque une endocytose (cette seconde interaction remplacera l'interaction entre le motif RGD et les intégrines).
Cette hypothèse peut s'appliquer aux HAd40 et 41, qui possèdent également deux fibres : courte et longue, la fibre longue pourrait interagir avec CAR, alors que le récepteur de la fibre courte reste inconnu, leur base penton ne contient aucun motif RGD (Favier et. al., 2004).
ARTICLE II: S TRUCTURE OF THE C- TERMINAL HEAD DOMAIN OF THE FOWL ADENOVIRUS TYPE 1
C ONCLUSION
Multimerization of the adenovirus DNA-binding protein drives ATP-independent DNA unwinding during strand displacement synthesis. Distinct roles of the adenovirus E4 ORF3 protein in viral DNA replication and inhibition of genome concatenation. Gene transfer to the central nervous system: current status of the viral vectors.
Fluorescent virions: dynamically tracking the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Specific interactions of the adenovirus proteinase with the viral DNA, a viral peptide of 11 amino acids and the cellular protein actin. Adenovirus protein-protein interactions: molecular parameters determining protein VI binding to hexon and activation of the adenovirus 23K protease.
Identification of CAR as a cellular receptor for CELO avian adenovirus using genetic analysis of two viral fiber proteins.
