Je tiens à remercier chaleureusement mes deux encadrants, David et Marie-Hélène Macherel, pour leur disponibilité, leurs conseils, leur envie de faire de la science, qu'ils ont su me transmettre. 84 Figure 31 : Protection des liposomes contre les effets de la déshydratation (visualisation par taille)..86 Figure 32 : Protection des liposomes contre les effets de la déshydratation (visualisation par fuite de fluorophore)..88 Figure 33 : Protection des liposomes contre les effets de gelé. visualisation par fuites de fluorophores)..90 Figure 34 : Interaction avec les phospholipides visualisés en DSC.
Avant propos
L'objectif de notre laboratoire est de mieux comprendre la biologie des graines lors de la germination et de la levée, dans le but d'améliorer leur qualité physiologique. L'équipe MITOSTRESS, dirigée par David Macherel, se concentre sur les propriétés spécifiques des mitochondries des graines (principalement de pois) en relation avec la tolérance aux stress abiotiques (tels que la dessiccation et la température).
Les mitochondries de semences
Des travaux récents utilisant la microscopie électronique ont permis d'observer une augmentation significative de la taille des mitochondries après seulement 24 h d'imbibition (Howell et al., 2006). Les protéines du cycle de Krebs ne s'accumulent qu'aux derniers stades de la germination (Howell et al., 2006).
High level of stress tolerance
Les protéines LEA (Late Embryogenesis Abundant)
De même, les protéines LEA du groupe 1 ne semblent pas interagir avec les phospholipides des liposomes unilamellaires ( Soulages et al., 2002 ). De plus, les protéines LEA peuvent également jouer un rôle de chaperons (Goyal et al., 2005).
Modifications post-traductionnelles
Spectres de fragmentation du peptide NSSMDWAYNSTSK modifié
Le profil de fragmentation montre clairement la perte d'un acide aminé (a.a.) de 190,1 Da correspondant à la perte d'un résidu kynurénine. La désamidation est une modification post-traductionnelle courante qui entraîne la conversion d'un résidu d'asparagine en un mélange d'isoaspartate et d'aspartate.
Réactions chimiques impliquées dans les modifications post- traductionnelles affectant la LEAM
10 µg de protéine recombinante ont été chargés sur un gel de Polyacrylamide à 13,5 % (en l'absence de SDS), séparés par électrophorèse et détectés par coloration au bleu colloïdal (Invitrogen). Une ligne de corrélation linéaire entre le temps d'élution et la masse moléculaire est obtenue avec un coefficient de corrélation (R²) supérieur à 0,98.
Structure quaternaire de la LEAM
Prédictions de structures secondaires à partir de la séquence primaire par les programmes Gor4 et PSIPRED
Prédictions de structures désordonnées à partir de la séquence primaire par les programmes FOLDINDEX et PONDR. La protéine a été dissoute jusqu'à une concentration finale de 1,2 mg/ml dans un tampon phosphate de sodium 5 mM, pH 7,5. Spectre déconvolué normalisé dans la région amide I du LEAM en solution obtenu par spectroscopie FTIR-ATR (Fourier Transform InfraRed - Attenuated Total Reflectance).
Structure secondaire de la LEAM
Jusqu'à 0,01% de SDS, le spectre du LEAM reste typique de celui d'une protéine non structurée. L'ellipticité moléculaire à 191nm permet de suivre la structuration en hélice α du LEAM en fonction de la concentration en TFE et SDS (Figure 21). Ainsi, le TFE et le SDS pourraient induire le repliement du LEAM par différents mécanismes, ce qui expliquerait donc les effets de concentration observés (Figure 21).
0,05% SDS 0,5% SDS 70%
Pour confirmer la structuration hélicoïdale du LEAM lors de sa déshydratation, des spectres FTIR et FTIR-ATR ont été obtenus à sec. Une vue est présentée avec uniquement les résidus chargés en mode sphérique (a), l'autre avec tous les résidus en mode sphérique (c). Les codes couleurs sont les suivants : Les résidus chargés sont respectivement rouges et bleus pour le positif et le négatif.
Modèle structural de la LEAM
Placement proposé des apolipoprotéines de classe a dans la membrane : le modèle Snorkel montrant une interaction des résidus chargés positivement de la protéine avec les groupes phosphate des phospholipides, et des résidus chargés négativement avec les têtes polaires potentiellement positives. La simulation des modifications post-traductionnelles (présentées précédemment) sur le modèle structurel LEAM permet de mettre en évidence leur impact sur les distributions de charges et donc leurs éventuels intérêts fonctionnels. Toutes ses modifications, intrinsèques et spontanées, peuvent donc contribuer au maintien des propriétés structurales du LEAM.
Les interactions de la LEAM avec les membranes et leurs conséquences
La mesure de la taille des liposomes avec le Nanosizer montre une distribution gaussienne centrée à 250 nm (Figure 30C). Effet du LEAM sur la taille des liposomes lors d'un stress de déshydratation/réhydratation. Il aurait été intéressant d'introduire du LEAM dans les liposomes pour évaluer l'importance de l'effet de courbure concave ou convexe de la membrane.
LEAMa
On dispose alors d'informations qualitatives (caractérisation des groupements chimiques présents) et quantitatives (l'intensité de l'absorption à la longueur d'onde caractéristique est liée à la concentration du groupe chimique responsable de l'absorption. Par exemple, la bande d'absorption amide d'absorption I cm -1) est sensible à la force des liaisons hydrogène et représente donc un bien.
Sans LEAM
Avec LEAM
Ces expériences ont permis de démontrer l'existence d'interactions à l'état sec du LEAM avec les groupements phosphate des phospholipides. Lors de la phase de déshydratation de la graine, le LEAM passe à sa conformation amphiphile hélicoïdale, ce qui lui permet de réagir avec les phospholipides. Lorsque la graine est absorbée, LEAM reprend sa forme non structurée, retournant ainsi à la matrice.
Conclusion
Introduction
La prédiction de la localisation subcellulaire a été réalisée à l'aide de TargetP (//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ ; Emanuelsson et al. Cependant, le programme TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) sur le pois a été mis en place par l'INRA. (URLEG Dijon, URGV Evry), ce qui nous a permis de sélectionner plusieurs mutants affectés dans le gène LEAM. La protéine LEAM la plus proche est Q1S7M8 de Medicago truncatula (pourcentage d'identité 59% et similarité 71%).
Les surexpresseurs chez Arabidopsis thaliana
Résultats obtenus par Agrisera sur un extrait total d'Arabidopsis (1) (200µg) et sur une fraction enrichie en mitochondries (2) avec l'anticorps IDH et une révélation ECL (GE Healthcare)
La germination des graines en présence de PEG (-0,5 et -1,2 MPa) n'est pas significativement affectée par la présence de LEAM. Il apparaît donc que dans les cas extrêmes la présence de LEAM est défavorable à la germination des graines. Il convient de noter que les gènes des orthologues LEAM chez Arabidopsis sont fortement exprimés lors de la formation des graines (Macherel et al. 2006).
Mutants de pois sélectionnés par TILLING
La séquence de la protéine mature est donnée avec la position des acides aminés mutés en bleu. Pour chaque mutant, le gène LEAM a été séquencé afin de confirmer la mutation et de déterminer sa présence éventuelle sur les deux brins d'ADN. Par conséquent, il devient impossible de distinguer l’effet de la mutation du gène d’intérêt des autres mutations.
Mutants d’insertion chez Arabidopsis thaliana
DNA For
Le gel issu de l'analyse PCR réalisée simultanément avec ces trois amorces est présenté en B. Nous avons initié plusieurs approches de génétique inverse (surexpression de LEAM chez A.th, mutant KO chez A.th, TILLING sur pois) pour explorer le rôle physiologique de LEAM. Malgré l’hétérogénéité observée dans plusieurs de nos expériences, un bénéfice de la surexpression de LEAM en cas de stress dû au gel semble prometteur.
Discussion
Dans le cas de la matrice mitochondriale, la protection efficace de nombreuses protéines par le LEAM nécessitera sans doute des quantités très importantes. L’intervention du LEAM dans la protection des membranes apparaît donc comme un scénario plus pertinent. Le problème du mécanisme d’importation du LEAM dans les mitochondries est un autre aspect de grande importance.
Perspectives
Ainsi, parmi les nombreuses protéines putatives associées au LEAM et présentant probablement des structures en hélice alpha de classe A, certaines pourraient avoir une localisation plastidienne, dans le réticulum ou même dans le cytosol, dans le cas de la protéine C. Ceci suggère que la fonction Le mécanisme du LEAM pourrait être utilisé dans d’autres compartiments cellulaires et dans des organismes évolutifs très éloignés. Puisque les mitochondries des graines se distinguent par la présence simultanée de LEAM et de HSP22, nous avons construit des lignées d'Arabidopsis surexprimant les deux protéines, que nous analyserons prochainement.
Matériel végétal et conditions de culture
Stress salin : après quatre jours à 22°C et à la lumière, le papier Whatman avec les jeunes pousses est transféré dans des boîtes de gélose 1/2MS contenant différents sels. Après quatre jours à 22°C et à la lumière, les jeunes plants sont transférés dans une boîte ½ MS Agar pré-incubée une nuit avec 30 ml d'une solution PEG 8000 pour obtenir des potentiels hydriques de -0,5 et -1,2 MPa (voir paragraphe Germination épreuves) . Le papier Whatman contenant les plants âgés de quatre jours est retiré de la boîte et laissé sécher à l'air.
Surexpression de la LEAM
La ségrégation des graines T2 par autofécondation des plantes T1 est analysée pour sélectionner les plantes T1 homozygotes pour l'insertion de GFP-LEAM. De plus, les plantes homozygotes pour LEAM ont été transformées avec un vecteur pFluar101, aimablement fourni par le Dr. Toon Stuitje (Département de génétique, Institut de biologie cellulaire moléculaire, Amsterdam, Pays-Bas). Des plantes homozygotes pour LEAM et HSP22 ont été obtenues en utilisant le même protocole de sélection que celui décrit précédemment.
Préparation d’organites
Le culot est repris dans du tampon Tris 0,1 M pH 9,3 contenant du βmercaptoéthanol 0,5 M et la suspension est incubée pendant 10 minutes à 30°C sous agitation douce. Le culot final est repris dans un volume minimal (200 µL) de milieu de lavage sans BSA. Le culot final de mitochondries est repris dans 0,5 mL de milieu de lavage sans BSA.
Techniques biochimiques
Après transfert, la membrane est colorée par immersion dans une solution de Rouge Ponceau-S 1% (p/v) et d'acide acétique 5% (v/v) qui colore les protéines de manière réversible. Après deux rinçages rapides, la membrane est incubée 1 heure ou toute la nuit à 4°C avec l'anticorps primaire dirigé contre LEAM dilué au 1/20 000. Afin de révéler la marque immunologique, la membrane est incubée pendant 2 à 5 minutes dans une solution de NBT/BCIP -Blue liquid substrat System for membrane (Sigma-Aldrich, St Louis, USA).
POPC
PLPE
Structure chimique des phospholipides utilisés
Les protéines fixées sur la colonne ont été éluées dans un tampon TE pH 7,4 avec une concentration de NaCl (mM) progressivement croissante. Les fractions contenant du LEAM purifié sont identifiées par SDS-PAGE suivie d'une coloration au bleu de Coomassie. La composition chimique et la structure spatiale des différents phospholipides utilisés sont répertoriées dans l’encadré 4.
Techniques de biologie moléculaire
Le gène LEAM a été amplifié avec les amorces GenLEAMfor et rev (voir section Amplification de l'ADN génomique) à partir de pools d'ADN génomiques extraits de mutants de pois (mutagenèse EMS). Les produits de PCR sont chauffés à 95°C pendant 5 minutes pour séparer les brins d'ADN, puis refroidis lentement pour réparer les brins d'ADN de manière aléatoire. Les fragments d'ADN sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (LI-COR 4300) et la fluorescence (verte et rouge) est détectée lors de la migration (Figure 46).
Techniques biophysiques
1996 ) Constitutive expression of the cold-regulated Arabidopsis thaliana COR15a gene affects both chloroplast and protoplast freezing tolerance. 1991). 1992b) DNA sequence analysis of a complementary DNA for cold-regulated Arabidopsis gene cor15 and characterization of the COR15 polypeptide. An active ribonucleotide reductase from Arabidopsis thaliana cloning, expression and characterization of the large subunit. 2004).
Benamar A., Tolleter D., Grelet J., Borovskii
2005) Solution structure of late embryogenesis abundant protein (LEA14) from Arabidopsis thaliana, a cellular stress-related protein. 2000). Evidence for the structure of type II poly(L-proline). 2002) Temperature-induced extended-helix/random-coil transitions in late embryogenesis group 1-rich soybean protein. Xu D, Duan X, Wang B, Hong B, Ho THD, Wu R (1996) Expression of a late embryogenesis-rich protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice.
