Les premières applications de la microfluidique (qui n'ont pas encore prétendu faire partie de cette discipline) ont été les techniques d'électrophorèse capillaire de l'ADN (CE), de chromatographie liquide (HPLC) et gazeuse (GPC). ). Nous développerons les bases essentielles de la microfluidique et décrirons les billes magnétiques et leurs applications à la biologie.
La microfluidique : Technologies, Physique et Applications
Technologies de microfabrication des microsyst`emes fluidiques 7
La résine sous l'influence de la lumière change sa propriété de solubilité dans un solvant. Les vannes microfluidiques ont acquis une grande importance dans le développement de la microfluidique.
Les billes magn´etiques et leurs applications
Description des billes magn´etiques
Schématiquement, on peut considérer les billes magnétiques comme une émulsion d’un liquide magnétique dans un solvant aqueux. Les billes magnétiques se caractérisent par leur dispersion qui reflète une homogénéité en taille et par leur capacité d'aimantation.
Propri´et´es magn´etiques des billes
Les sphères magnétiques ne seront alors exposées à une force magnétique que si le champ externe présente un gradient de champ. Si le champ extérieur est uniforme, la sphère sera soumise à un couple qui alignera son moment magnétique total avec celui de l'aimantation externe, mais en aucun cas elle n'aura de mouvement de translation.
Propri´et´e d’auto-organisation des billes
Les boules magnétiques sans l'influence d'un champ magnétique externe sont soumises à un mouvement brownien. Dans un deuxième temps, nous avons présenté les propriétés des billes magnétiques.
Enjeux du tri cellulaire dans le diagnostic de cancer
Au-delà de la séparation et de la caractérisation des cellules triées, quelle est la signification clinique des CTC et DTC ? Il y a deux étapes majeures dans la séparation des CTC : (i) l’enrichissement des cellules tumorales circulantes et (ii) la caractérisation des cellules triées.
Microsyst`emes pour le tri cellulaire
L'absorption cellulaire dans ces systèmes est très sensible au cisaillement [Sin et al., 2005]. L’enrichissement des cellules sur une plateforme microfluidique semble éviter les problèmes des techniques conventionnelles de séparation CTC.
S´eparer des cellules `a l’aide de colonnes magn´etiques auto-
L'utilisation de billes magnétiques pour le tri cellulaire nécessite donc une « fixation » des billes à la surface. Les billes magnétiques sont injectées dans un canal microfluidique dont la base est recouverte de plots magnétiques.
Auto-organisation des billes magn´etiques et puce microfluidique
Une dernière étape de cuisson à 150°C fixe le ferrofluide à la surface de la lame. B) Agrandissement au niveau de la croix où l'on voit les différentes valves et le dépôt de ferrofluide.
S´eparation de populations mod`eles
- D´eroulement d’une exp´erience de s´eparation cellulaire
- Evaluation des performances de s´eparation
- Organisation des cellules dans le r´eseau de colonnes
- Culture cellulaire dans la puce microfluidique
- Caract´erisation ph´enotypique et morphologique des cellules
- D´etachement des cellules des colonnes
- Conclusion
Premièrement, nous injectons les billes magnétiques, et deuxièmement, nous injectons les cellules. En supposant que les cellules entrent dans le canal une par une, nous avons l’itération suivante. Une autre méthode plus ambitieuse consiste à démontrer que les cellules peuvent être remises en culture.
Cette méthode est largement utilisée pour récupérer des cellules dans les chromatographies d'affinité de cellules à tubes ouverts [Sin et al., 2005]. En l’état actuel, nous avons déjà démontré que les protocoles classiques de biologie cellulaire pouvaient être utilisés sur des cellules isolées. De plus, la viabilité cellulaire a également été vérifiée par remise en culture des cellules.
Mise en place Exp´erimentale
Nous observons généralement un photoblanchiment de l’échantillon lors de l’imagerie sur l’axe z. Il faut alors trouver un moyen de « transporter » l’expérience réalisée sur le montage habituel vers le microscope confocal. Il faut imaginer un moyen de figer toute l’expérience et de la transporter au microscope.
Un détail très important pour la suite de l'expérience ne manquera pas d'être vérifié. À la fin de l’expérience, nous utiliserons de l’agarose à faible point de fusion pour masser la puce. Etape n°5 : Mise en masse de la puce microfluidique Nous préparons une solution d'agarose à bas point de fusion 1% p/v dans du PBS.
R´esultats Exp´erimentaux
Ph´enotypage de sujets sains
La figure 3.6 (page 91) présente une comparaison des données de quantification pour des sujets sains par cytométrie et microscopie. En cytométrie, on distingue que CD10 est au niveau de fluorescence le plus bas. Comme pour la cytométrie, les cellules peuvent être considérées sans équivoque comme négatives pour CD10 et majoritairement négatives pour CD5, avec une population confondue entre négative et positive.
Figure 3.4 – Caractérisation au microscope confocal des cellules du sujet sain n°1. Les images représentent 1 plan de pile d’images. Figure 3.5 – Caractérisation au microscope confocal des cellules du sujet sain n°2. Les images représentent 1 plan de pile d’images. Figure 3.6 – Quantification de l'expression des antigènes CD5 et CD10 par cytométrie et microscopie confocale chez des sujets sains. Les données de cytométrie ont été obtenues à l'hôpital de l'Institut Curie.
Ph´enotypage de la lign´ee cellulaire DoHH2
Figure 3.8 – Quantification de l'expression des antigènes CD10 et CD5 pour la lignée cellulaire DoHH2.
Ph´enotypage de Leuc´emies Lympho¨ıdes Chroniques
La chromatine apparaît très ronde et homogène sur toute la surface du noyau. On distingue clairement l'autofluorescence des billes magnétiques en jaune. CD5 est très clairement positif ; apparaît dans la couronne de la cellule de manière très homogène.
Les images de microcopie confocale (Fig. 3.12, page 101) montrent des cellules en champ clair d'un très petit diamètre de 6,8 ± 0,6 µm avec un noyau très rond et homogène sur toute sa surface. ; une légère diminution de la fluorescence au centre de la cellule. L'expression du CD5 est très homogène à travers la membrane cellulaire. Les images de microscopie confocale montrent des cellules très rondes d'un diamètre de 7,3 ± 0,5 µm, des noyaux aux contours très réguliers et une chromatine uniformément répartie au sein de la cellule.
Ph´enotypage de Leuc´emies Aigu¨es Lymphoblastiques
Ph´enotypage du Lymphome du Manteau
Figure 3.19 - Caractérisation de l'expression des antigènes CD10 et CD5 chez un patient atteint d'un lymphome de Manteau.
Discussions des R´esultats
M´ethodes courantes de purification d’ADN
Mis en présence d'une phase organique (mélange de phénol et de chloroforme), l'ADN reste en phase aqueuse tandis que les protéines3 passent en phase organique. Cette méthode publiée par [Boom et al., 1990] consiste à déposer de l'ADN sur des billes de silice en présence de fortes concentrations de sels chaotropiques qui précipitent l'ADN sur les billes. Enfin, l’ADN est libéré des billes dans un solvant aqueux à très faible concentration en sel.
Les méthodes de purification de l'ADN par modification du pH jouent sur la présence d'une fonction amine dans la matrice solide, positive à faible pH et neutre lorsque le pH augmente, libérant ainsi l'ADN. Il existe d’autres méthodes de purification de l’ADN, mais par souci de clarté nous n’entrerons pas dans leur description. Des méthodes ont été démontrées pour la purification de l'ADN sur des billes magnétiques de carboxyle [Hawkins et al., 1994] ou par précipitation en présence de PEG [Lis et Schleif, 1975].
M´ethodes microfluidiques pour la purification d’ADN
Une fois l’ADN capturé sur une colonne de billes de silice, l’ADN est élué et mesuré par fractions de 2 µL. Ces fractions sont soumises à une amplification PCR et l'ADN obtenu par amplification est testé (inserts). En fait, les rendements réels des microsystèmes permettant de capturer l’ADN des billes de silice sont très faibles.
Une approche très prometteuse consiste à utiliser des systèmes de capture d’ADN à pH variable. De tous les microsystèmes de capture d'ADN, cette puce présente les meilleures performances de séparation [Wen et al., 2008]. Le tableau 4.1 montre les capacités actuelles des systèmes microfluidiques pour la purification de l'ADN.
Mat´eriel et M´ethodes
Nous démontrerons deux stratégies différentes basées sur deux billes différentes pour la capture de l'ADN : la première consiste à fonctionnaliser des billes avec une fonctionnalité diamannine, et la seconde consiste à utiliser des billes commerciales. Un volume de 50 µL de solution d'EDC ((chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide) dans un tampon MES froid avec au moins une concentration de 20 mg/mg de billes est ajouté aux billes. Volume 50 µL de SNHS (sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide) est ajoutée aux billes dans un tampon MES froid à une concentration d'au moins 20 mg/mg de billes.
Les billes sont lavées deux fois dans du tampon MES, suivi de 10 lavages dans de l'eau MilliQ.
R´esultats
Parallèlement à cette étude de la fonctionnalité des billes, nous avons également évolué vers une voie plus simple utilisant des billes magnétiques disponibles dans le commerce avec capture de l'ADN par interaction électrostatique et élution par modification du pH. Les billes magnétiques Charge Switch (Invitrogen) ont un diamètre de 1 µm et permettent la capture et l'élution de l'ADN en modifiant le pH. Des expériences par lots montrent que les billes ont un taux de capture supérieur à 95 % et un taux d'élution d'environ 60 % pour l'ADN-λ.
Après avoir formé le bouchon de billes magnétiques, l’ADN est injecté dans la puce microfluidique à différents débits. Dans la puce microfluidique, nous constatons une dépendance du taux de capture sur le taux d’injection d’ADN. L’étape de lavage ne provoque pas de blocage de l’ADN, sauf en fin d’étape où tampon de lavage et tampon d’élution se mélangent dans la puce microfluique, expliquant qu’une partie de la fraction d’élution se retrouve dans la fraction de lavage7.
Conclusion
Les résultats obtenus lors de la thèse sur la séparation cellulaire ont ouvert la voie à deux projets : un projet européen (Caminems) et un projet ANR (Micad). Au cours de la thèse nous avons démontré la possibilité de séparer les cellules par des colonnes magnétiques auto-organisées. La reconnaissance de l'antigène se fait au niveau de la partie variable des chaînes légères et lourdes.
Au cours de la thèse nous avons utilisé deux grandes familles de résines : une résine positive AZ 9260 (Microchemicals, Allemagne) et une résine négative SU8 2075 (Microchem, France). Durant la thèse nous avons utilisé des masques imprimés sur des films plastiques. Toutes les lithographies que nous avons réalisées avec la résine AZ9260 durant la thèse ont été réalisées sur un substrat de verre.
Dans le cadre de la thèse, nous utilisons uniquement des cellules qui poussent en suspension. C’est très classique et ne diffère pas pour les cellules utilisées lors de la thèse.
