Tant sur le plan humain que scientifique, je le remercie de m'avoir formé, soutenu et surtout cru en moi dans les moments difficiles. À ce footballeur passionné, Frédéric Laporte, je le remercie pour sa gentillesse, sa présence, ses plaisanteries et son amitié.
Introduction
Les trichomes glandulaires A. Données anatomiques
- Initiation des trichomes
- Morphogenèse des trichomes
- Inhibition latérale de la formation des trichomes
- Phase demi-sécrétoire
- Phase sécrétoire et post sécrétoire
Spatialement, l'initiation commence préférentiellement dans la partie proximale de la feuille (Schnittger et al., 1999). En effet, Glover et al. (1998) ont montré que la surexpression du gène MIXTA chez N. tabacum provoque le développement de trichomes glandulaires dans les carpelles et les pétales.
Les trichomes glandulaires : siège de synthèse de produits de sécrétion Le lien entre la présence des trichomes glandulaires et l’accumulation des huiles essentielles a
- Les dérivés d’acide gras
- Les dérivés d’acides aminés
- Les terpènes
- La biosynthèse des précurseurs, l’IPP et le DMAPP
- Condensation : naissance des terpènes
- Rôle physique
- Les TGSs et les animaux
Cette voie alternative pour la biosynthèse de l'IPP a été découverte pour la première fois par Rohmer et al., en 1993 chez E. Cette molécule est produite par l'action d'une alcool benzylique benzoyl-CoA transférase (D'Auria et al., 2002) (Figure 8D).
Librophyt a réussi à faire taire l'expression de la Cembrantriene-ol synthase chez N.sylvestris par l'ARNi en épingle à cheveux d'intron (ihp). En effet, l’inactivation de l’expression du gène CBT-ol synthase entraîne une réduction de la synthèse du CBT-diol dans les trichomes de N.sylvestris (WO A1).
Expression spécifique des gènes de terpènes synthases dans le trichome La partie promotrice des gènes est responsable en grande partie de leur profil d’expression
Le promoteur du gène LTP6 permettra également une expression spécifique dans les trichomes du tabac. La couleur bleue n'est observée que dans les trichomes glandulaires sécrétoires de N. tabacum (Shangguan et al., 2008).
Amélioration de la production de composés organiques
- Amélioration de la qualité de l’huile essentielle de la menthe
- Transgenèse hétérologue dans Nicotiana
Dans une autre expérience, Mahmoud et al. 2004) ont transformé indépendamment des plantes de Mentha x piperita avec des ADNc de menthe limonène synthase et de limonène 3-hydroxylase. La surexpression de la limonène 3-hydroxylase conduit à une co-répression du gène endogène chez de nombreuses plantes.
Ainsi, l'introduction dans le tabac du gène de la taxadiène synthase sous le contrôle du promoteur CBTS-diol synthase a permis la synthèse du taxadiène dans les trichomes de N. L'un des promoteurs spécifiques des trichomes caractérisés par Librophyt est celui de la Cembratriène-diol synthase (NsTPSO2a ).
RESULTATS
Analyse fonctionnelle de P 1.1NsTPSO2a
- Expression spécifique dans les têtes des trichomes glandulaires (TGSs) Pour vérifier la spécificité d’expression du trichome et identifier les régions impliquées dans
- Analyse bioinformatique des promoteurs de terpènes synthases de TGSs Librophyt a caractérisé quatre autres promoteurs trichomes spécifiques notamment chez
- Analyse fonctionnelle du promoteur 1.1NsTPSO2a in planta
- Fonctionnalité du fragment 4c
- Fonctionnalité de la région 400c
- Conclusion
La figure 18A montre l'expression spécifique de P1.7NsTPSO2a::GUS dans les têtes des TGS (A) (photo Alain Tissier). Les observations montrent que l'expression du gène rapporteur est bien localisée dans les trichomes lorsque le gène GUS est présent (Figure 23). En revanche, la suppression totale du promoteur (∆5s :: GUS) n'entraîne aucune coloration. Pour toutes les autres constructions, on note que l'expression du gène rapporteur est présente dans les trichomes.
Conséquences des délétions de P1.1NsTPSO2a sur son profil d'expression par transformation stable dans le tabac transgénique. Ainsi, la fusion du fragment 4c en amont du promoteur P35Smin permet de restaurer la spécificité d'expression dans les trichomes. De plus, nous avons confirmé expérimentalement l’activité spécifique de P1.1NsTPSO2a dans les cellules N sécrétant du TGS.
Recherche d’un facteur trans-régulateur du P 1.1NsTPSO2a
Les plasmides ont été purifiés et retransformés en E coli (XL1blue), puis extraits et digérés par Smal pour vérifier la taille des inserts. Les conditions de criblage ont été fixées à 75 mM de 3-AT et 3 jours de croissance sur milieu SD-Leu-Trp-His. Les inserts ont été digérés à partir du vecteur pGADT7RecAB par SfiI et vérifiés sur gel.
Les CADN des 13 clones ont été séquencés puis alignés sur les bases de données nucléiques et protéiques NCBI et TAIR. La présence de ce domaine GATA-zincFinger au sein de la protéine NsZnf permet de le classer dans la famille des protéines GATA-zinc Finger (Shikata et al., 2003). Cependant, d'autres similitudes ont été observées avec les protéines TIFY2A et ZIM-LIKE 2, cette dernière étant considérée comme un facteur de transcription chez Arabidopsis thaliana (Vanholme et al., 2007).
Motif TIFY
La comparaison des séquences dans NCBI et TAIR a montré que l'homologie la plus élevée a été observée avec des séquences de protéines ZIM (protéine à doigt de zinc exprimée dans le méristème de l'inflorescence), en particulier ZIM-LIKE 1. Un ORF similaire a également été détecté chez Oryza sativa, Populus trichocarpa et Ricinus communis, mais aucune protéine similaire n'est présente chez les animaux (Figures 37 et 38). Cette observation suggère que nous sommes en présence d'une protéine spécifique à la plante (Shikita et al., 2003). Les signatures répertoriées dans les bases de données sont des motifs protéiques conservés auxquels une fonction a été attribuée.
L'analyse prédictive bioinformatique de NsZnf suggère la présence de 3 motifs protéiques dont un doigt de zinc (Figures 36A et 36B).
Motif CCT
La présence de ce domaine GATA-zincFinger au sein de la protéine NsZnf permet de la classer dans la famille des protéines GATA.
Motif ZINC-FINGER
Analyse fonctionnelle de la protéine NsZnf
- Surexpression de la protéine NsZnf recombinante
Le rôle potentiel de NsZnf comme facteur de transcription implique une localisation nucléaire de la protéine. Dans le test hybride unique, la protéine NsZnf stimule l'activation du gène rapporteur uniquement en présence de la séquence 400c chez la levure. Il facilite la purification et la détection de la protéine recombinante à l'aide d'un anticorps anti-His-Tag.
Ces sondes comprenant le fragment 400c sont utilisées pour des tests de retard sur gel avec la protéine NsZnf. A : Autoradiographie à retardement sur gel réalisée avec la protéine NsZnf dénaturée et la sonde 2cb. B : Autoradiographie à retardement sur gel réalisée avec la protéine NsZnf dénaturée et la sonde 3cb.
Discussion
- Les élements cis régulateurs dans le promoteur P 1.1NsTPSO2a
- Eléments cis régulateurs et facteurs de transcriptions
- Spécificité d’interaction entre NsZnf et 400c
- NsZnf un facteur de transcription de type GATA-zinc Finger ?
Ceci a été confirmé par l'observation d'une restauration d'expression dans les TGS des plantes transformées par la fusion 4c::P35Smin::GUS. En fait, des taches ont été observées à la base des trichomes et dans les cellules épidermiques. Nous avons réalisé la transgenèse de 400c :: P35Smin :: GUS dans le LS de N.sylvestris, mais nous n'avons observé aucune coloration ni dans les TGS ni dans les cellules épidermiques.
Le promoteur chimérique ainsi obtenu serait un outil d'expression spécifique dans les trichomes glandulaires. Dans les cellules animales, la protéine ARF stabilise le facteur p53 en séquestrant la protéine mdm2 dans les nucléoles (Weber et al., 1999). Nos travaux ont permis de délimiter deux régions cis qui régulent l'expression du gène NsTPSO2 dans les trichomes sécrétoires de N.sylvestris, remplissant ainsi notre premier objectif. De plus, nous avons identifié le facteur grâce à un doigt de zinc CX2CX20CX2 appelé NsZnF.
Conclusion générale
Ce profil racinaire suggère que ce fragment serait également impliqué dans la répression de P1.1NsTPSO2a dans certaines zones de la racine. Cette protéine est capable d'activer la transcription du gène HIS3 uniquement en présence du fragment 400c chez la levure. Cette protéine nucléaire est la première à être identifiée et caractérisée dans les trichomes nocturnes.
Cette protéine possède également un domaine de localisation nucléaire et un domaine TIFY qui est sans doute impliqué dans l'homodimérisation. Enfin, la présence d'un domaine TIFY suggère qu'il appartient également à la famille des protéines ZIM (selon la nomenclature de Niishi et al.). A plus long terme, l'objectif sera d'utiliser les éléments 4c et 400c pour construire un promoteur spécifique de la glande à trichome.
Matériels et Méthodes
Matériels biologiques et conditions de culture
- Variétés de tabac
- Milieux et conditions de culture a) Culture en terre
- Génotypes des souches utilisées
- Milieux et conditions de cultures bactériennes
- Souche de Saccharomyces cereviseae utilisée
- Milieux et conditions de culture
- Transformation par régénération de cals
- Sélection des transformants
- Préparation ex-temporannée des microbilles
- Adsorption de l’ADN
- Préparation des disques foliaires
- Bombardements
- Détection de l’expression transitoire du gène rapporteur GUS Après la transformation, les boites sont placées 24h à l’obscurité puis transférées en chambre
Après transformation par Agrobacterium tumefaciens, les disques foliaires sont déposés sur un milieu de coculture CCM1 (CoCulture Medium 1) [sels de Murashige et Skoog (Sigma, 4,4 g/L) ; saccharose (30 g/L) ; 6-Benzylaminopurine (BA, Sigma) 1 mg/L dissous dans un volume minimum de NaOH 1N ; Acide α-naphtalèneacétique (BA, Sigma) 1mg/L, préalablement dissous dans de l'éthanol à 95°C ; pH 5,7 ; Phytagel (2,5g/L)] pendant 48 heures en journées longues à 23°C avec un éclairement de 70µM.S-1 cm-2. En milieu liquide, le volume de la culture bactérienne correspond à 1/5 du volume de l'ErlenMeyer utilisé, pour une oxygénation optimale de la culture. La sélection des bactéries d'intérêt est réalisée en supplémentant le milieu avec un ou plusieurs antibiotiques en fonction du vecteur et de la résistance de la souche bactérienne utilisée, aux concentrations décrites dans le tableau IV.
L'expression de la protéine glucoronidase, contrôlée par l'ensemble du promoteur P1.1NsTPSO2a ou modifiée par diverses délétions, peut être visualisée dans les cellules épidermiques de N.benthamiana. Le lendemain, 1 ml de préculture est ajouté à 4 ml de milieu frais et placé sous agitation à 28°C. L'extrémité de la seringue est plaquée contre la face abaxiale de la feuille, entre les nervures, tandis que l'autre face est maintenue par l'index.
Biologie moléculaire
- Clonage d’un produit PCR par T/A cloning
- Clonage GATEWAY TM
- Vecteurs utilisés et constructions réalisées
- Transformation bactérienne, amplification de plasmide et séquençage
- Construction d’une banque d’ADNc de trichomes de N.sylvestris a) Extraction et préparation d’ARN totaux de trichomes de
- Crible simple hybride de la banque d’ADNc de trichomes de N.sylvestris
- Détection de protéines étiquetées
La concentration du gel d'agarose varie de 0,8% à 3%, selon la taille de la bande d'ADN à détecter. Au cours de la première, l'ADN d'intérêt est amplifié par PCR en utilisant une paire d'amorces contenant chacune une extension attB 5'. 26 µg d'ARN total ont été expédiés sous glace carbonique à Clontech (USA) pour la production de la bibliothèque d'ADNc.
La lyse des bactéries a été réalisée à la French Press dans le tampon de lyse du Kit (NaH2PO4 100 mM, Tris-Cl 10 mM, Urée 8 M). La purification de la protéine candidate est réalisée dans des conditions dénaturantes sur une colonne Ni-NTA en utilisant une concentration d'imidazole 500 mM (QIAexpressionistTM Kit (QIAGEN)). La purification de la protéine candidate est réalisée en conditions natives sur une colonne Ni-NTA en utilisant une concentration d'imidazole 250 mM à 4°C (QIAexpressionistTM Kit (QIAGEN)).
Etude de l’interaction NsZnf/400c par EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
Les complexes séparés par électrophorèse ont été électrotransférés sur une membrane de nitrocellulose N+ à l'aide d'un dispositif de transfert de liquide réfrigéré (BioRad). Une fois le transfert terminé, la membrane est posée sur du papier Wattman imbibé de TBE et enveloppée de Saran. Deuxièmement, la membrane est incubée dans une solution 1/1000 TBS-tween-Streptavidine-HRP pendant 1 heure.
Biologie Cellulaire
- Coloration des noyaux au DAPI
- Microscopie à épifluorescence
- Loupe binoculaire à épifluorescence
L'observation s'effectue au microscope (Eclipse E-600, Nikon) en lumière transmise ou en fond sombre ou sous une loupe binoculaire (SZX12, Olympus). La couche épidermique de l'échantillon à colorer est décollée à l'aide d'une pince fine puis déposée sur une lame. Il est ensuite recouvert d'une lamelle d'une solution de coloration (DAPI (molécule fluorescente interférant avec l'ADN, 1 µg/ml), p-phénylène diamine (protection contre la fluorescence, 100 µg/ml), en solution dans du PBS-Tween) puis infiltré pendant 5 minutes sous vide. pour augmenter la pénétration de la solution.
L'observation des noyaux des cellules épidermiques des feuilles a été réalisée au microscope optique à fluorescence vertical (Eclipse E-600, Nikon). Les images ont été prises avec un appareil photo Olympus DP70, qui permet une observation en temps réel ainsi que l'enregistrement d'images. Cette loupe a été utilisée pour prendre des images de semis colorés au GUS en lumière blanche à l'aide de la caméra DP70.
Bio-Informatique et analyses statistiques
Deux filtres différents sont utilisés pour visualiser les signaux GFP et DAPI, la co-localisation n'est donc activée qu'en superposant deux images.
Bibliographie
16 Bouwmeester H, Gershenzon J, Konings M, Croteau R: Biosynthesis of the monoterpenes limonene and carvone in the fruit of caraway. 48 Guo Z, Severson RF, Wagner GJ: Biosynthesis of the diterpene cis-abienol in cell-free extracts of tobacco trichomes. 67 Julliard JH, Douce R: Biosynthesis of the thiazole group of thiamine (vitamin B1) in chloroplasts of higher plants.
137 Rodriguez-Concepcion M, Boronat A: Elucidation of the methylerythritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria and plastids. 186 Wang E, Gan S, Wagner GJ: Isolation and characterization of the CYP71D16 trichome-specific promoter from Nicotiana tabacum L. 192 Wu A, Liu J: Isolation of the promoter of a cotton beta-galactosidase gene (GhGal1) and the expression of it in transgenic tobacco plants.
Annexes
