Introduction
V. Amélioration de la production de composés organiques
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GhAT1 est impliqué dans la régulation transcriptionnelle de plusieurs promoteurs dans les plantes (Tjaden et Coruzzi 1994, Reisdorf-Cren et al., 2002, Matsushita et al., 2007). La surexpression de 35S::GhAT1 dans les lignées FSltp4 ::GUS montre une absence de coloration dans la plupart des trichomes. Par ailleurs, ceci s’accompagne d’une baisse du niveau de la protéine FSltp4 dans les plantes de tabac transgéniques (Figure 15C).
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Verberne et al. (1998) ont introduit deux gènes microbiens dans le tabac, un codant l’isochorismate synthase (E.coli) et un autre codant l’isochorismate pyruvate lyase (P.fluorescence). Sous le contrôle d’un promoteur 35S et couplés à une séquence d’adressage chloroplastique, les deux enzymes ont été exprimées dans la culture de cellules de tabac. Ces cellules se sont mises à produire de l’acide salicylique de façon constitutive(Verberne et al., 1998).
B. Culture de microorganismes et production de terpénoïdes
Une alternative à la culture cellulaire est l’utilisation des bactéries ou des levures pour assurer la production des molécules pharmaceutiques (Figure 16). Dans cette approche, l’ensemble des gènes impliqués dans une voie de biosynthèse (plante) sont transférés dans E.coli ou S.cerevisiae. L’étape initiale est de construire une souche E.coli ou S.cerevisae capable de générer le précurseur IPP. Il est important de considérer que cela apporte une voie IPP en plus de la voie endogène. Aussi une solution serait de rediriger le flux interne au profit de la voie hétérologue. Cette stratégie implique toujours des contraintes comme la toxicité due à une forte concentration en molécules ou encore une mauvais conformation des enzymes (absence de modification post transcriptionnelle, absence de compartimentation). Par ailleurs, l’hôte bactérien n’offre pas un environnement métabolique favorable aux nombreuses modifications du squelette terpénique comme les hydroxylations par les cytochromes P450 (Khlosla et al., 2003). Cependant des essais prometteurs ont permis la production de sesquiterpènes dans E.coli et de caroténoïdes dans S.cerevisae (Shimada et al., 1998).
Transfert de la voie métabolique
Plante d’intérêt
Microorganisme hôte Source de carbone
Fermentation
Molécule d’intérêt ou précurseur
Figure 16 : Transplantation d’une voie de biosynthèse d’une plante vers un microorganisme.
Les gènes des enzymes de la voie sont importés dans l’hôte unicelluaire. Une culture à forte concentration de carbone permet de produire la molécule d’intérêt par fermentation (Chang et Keasling, 2006).
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C. Les méthodes de transgenèse visant les TGS
1. Amélioration de la qualité de l’huile essentielle de la menthe
L’huile essentielle de la menthe contient en plus du menthol un composé indésirable, le menthofurane, qui contribue à en déprécier la flaveur. Chez des plantes soumises à un stress, le menthofurane peut atteindre des quantités importantes rendant l’huile inexploitable.
Mahmoud et Croteau (2001) ont d’une part surexprimé le gène DXR (enzyme de la voie de biosynthèse de l’IPP et du DMAPP chloroplastique) et d’autre part supprimé l’expression du gène de la menthofurane synthase (MFS ou Cytochrome P450 responsable de la conversion du pulegone en menthofurane en aval de l’IPP : voie cytoplasmique) chez la menthe poivrée.
Dans les plantes obtenues, trois phénotypes ont été observés. L’un, majoritaire qui se caractérise par une augmentation de 50% d’huile produite mais la composition reste la même que celle de la plante sauvage. Le deuxième phénotype rassemble des plantes ayant une altération de la pigmentation, due à la cosuppression du gène DXR interne. Enfin, le troisième répond aux attentes avec une diminution du menthofurane et une augmentation du menthol.
Dans une autre expérience, Mahmoud et al. (2004) ont transformé des plantes de Mentha x piperita indépendamment avec les ADNc de la limonène synthase et de la limonène 3- hydroxylase de menthe. Bien que les deux ADNc soient surexprimés de façon constitutive dans les plantes transgéniques obtenues, aucun changement n’est observé dans le rendement ou la qualité de l’huile. Les auteurs concluent que la limonène synthase n’est pas surexprimée de façon suffisante dans les cellules des trichomes sécréteurs.
La surexpression de la limonène 3-hydroxylase, entraîne une cosuppression du gène endogène dans de nombreuses plantes. En conséquence, dans ces plantes cosupprimées, le limonène s’accumule dans l’huile essentielle des trichomes sécréteurs. Ces expériences d’ingénierie chez la menthe montrent qu’il est possible de modifier la quantité et la qualité des composés volatiles produits par les cellules sécrétrices. Les résultats obtenus sont utiles et montrent que les trichomes sécréteurs sont une alternative intéressante aux cultures cellulaires et bactériennes pour la production des molécules d’intérêt.
2. Transgenèse hétérologue dans Nicotiana
L’introduction d’un gène unique impliqué dans les voies de biosynthèse des composés volatils a été rapportée plusieurs fois (Lewinsohn et al., 2001 ; Lücker et al., 2001 ; Lavy et al., 2002).
Chez le tabac, trois enzymes utilisant le même substrat ont été introduites dans la même plante : la limonène synthase, la terpinène synthase et la pinène synthase.
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Ces trois monoterpènes synthases du citron, adressées aux plastes, ont été utilisées seules ou en combinaison. L’introduction de ces trois enzymes dans des plantes transgéniques de tabac entraîne une production de monoterpènes en quantités 10 à 20 fois plus importantes que chez les plantes non transformées, avec de nombreux monoterpènes absents des tabacs non transformés (limonène, γ-terpinène, ß-pinène…) (Lücker et al., 2004a). Le profil des composés émis par les fleurs et par les feuilles de tabac a donc été modifié et ce changement est détectable par l’odorat humain (Lücker et al., 2004a). Parallèlement, la limonène 3- hydroxylase de Mentha spicata, adressée au réticulum endoplasmique (RE), a été introduite dans la lignée de tabac TERLIMPIN exprimant les trois monoterpènes synthases de citron (Lücker et al., 2004a). L’analyse des composés volatils émis par les fleurs des plantes obtenues révèle que, malgré une localisation différente des enzymes impliquées (plastes et RE), les fleurs produisent du (+)-trans-isopipériténol à partir du limonène, contrairement aux fleurs de la lignée TERLIMPIN témoin (Lücker et al., 2004b). Ceci implique que certains monoterpènes sont transportés, activement ou passivement, des plastes au RE.
Ces expériences montrent qu’il est possible de faire produire à certaines espèces végétales des composés volatils hétérologues, à condition que le substrat soit disponible (Lücker et al., 2004b). Le tabac semble être adapté aux expériences de bioingénierie pour augmenter les quantités de composés volatiles que ce soit via les fleurs ou via les trichomes. Ainsi il est facilement imaginable de produire et d’augmenter des composés volatiles d’intérêt que ce soit des fragrances ou des molécules pharmaceutiques. Les connaissances sur les gènes de terpènes synthases et sur les métabolismes terpéniques sont des atouts majeurs dans les avancées biotechnologiques futures.