L E REPRESSEUR DE L ’ OPERON LACTOSE
L A FORMAMIDOPYRIDINE -DNA GLYCOSYLASE
Parmi les enzymes impliquées dans ce type de réparation, les photolyases vont réparer les lésions induites par les UV [Carell et al., 2001]. Certains cancers du côlon, de l'endomètre et de l'ovaire ont également été associés à des mutations de gènes impliqués dans le ROR chez l'homme [Fisher et al., 1993]. Il convient de noter que cette structure de domaine ainsi que la flexibilité de la boucle permettent à la protéine de changer de conformation lorsqu'elle est liée à l'ADN [Fedorova et al., 2002] et de s'adapter à une large gamme de substrats [Fromme &.
Les flèches et les rectangles représentent respectivement les feuillets et les hélices de la structure LlFpg [d'après Serre et al., 2002]. Il a été démontré que la modification chimique des résidus de cystéine impliqués dans le doigt de zinc inhibe les activités glycosylase et AP lyase du Fpg [O'Connor et al., 1993]. D'autre part, des études de mutagenèse dirigée sur site ont démontré que les mutations de ces résidus de cystéine, bien que n'altérant pas de manière significative la structure secondaire de la protéine, avaient des effets dramatiques sur la liaison de l'ADN endommagé et sur l'activité Fpg [O'Connor et al. . al., 1993 ; Tchou et al., 1993].
Chez E.coli, la protéine Fpg comprend deux résidus cystéine supplémentaires situés à l'extérieur du doigt de zinc (Cys147 et Cys195), mais les mutations de ces résidus n'altèrent pas l'activité enzymatique de Fpg [O'Connor et al., 1993]. Il possède également une activité désoxyribo-phosphodiestérase (dRPase), ce qui lui permet d'éliminer les phosphates des désoxyriboses à l'extrémité 5' de l'ADN qui ont été préalablement clivés par des enzymes hydrolytiques telles que les endonucléases AP Xth (ExoIII) et Nfo (EndoIV) d'Escherichia. bactéries coli. [Graves et coll., 1992]. Une fois la lésion localisée, Fpg insère trois résidus N-terminaux via un petit sillon (M75-R109-F111 pour L. lactis Fpg [Serre et al., 2002]) au niveau de la lésion et excise la base endommagée du double hélice à travers le sillon principal.
L'interaction du Fpg avec l'ADN se produit principalement par le biais d'interactions multiples entre les résidus de la protéine et le squelette phosphodiester du brin d'ADN porteur de la lésion [Serre et al., 2002 ; Fromme & Verdine, 2002] : Arg260, Tyr238 et Lys57 coopèrent pour forcer l'ADN à se plier. Parmi les lésions Fpg connues, certaines n'ont pas été retirées [Perlow-Poehnelt et al., 2004] ; c'est le cas de la 8-oxonébularine, de la 6-O-méthyl-8-oxoguanine et de la 8-oxoadénine. Il apparaît également que la nature de la base opposée à la lésion module fortement la liaison du Fpg à l'ADN et donc la catalyse enzymatique : les couples 8-oxodG:T et 8-oxodG:G sont ainsi mieux reconnus qu'un 8-oxodG:C. , 8-oxodG:A est le substrat le plus pauvre [Castaing et al., 1993; Tchou et al., 1994].
Structures des sites substrats AP et analogues du substrat Fpg [d'après Castaing et al., 1999. Représentation des sites actifs de L.lactis Fpg et B.stearothermophilus Fpg attachés à l'ADN contenant un résidu cFapydG et 8-CoxsteodG, respectivement., 2004] .
Expression et purification des protéines
La colonne est lavée longuement avec du tampon SP1 puis la protéine est éluée avec un gradient de tampon SP1/SP29. Le culot protéique est repris dans 4 ml de tampon AcA10 et l'échantillon est placé sur une colonne de gel filtration (Ultrogel® AcA 54). Après élution avec le tampon AcA, les fractions contenant la protéine sont réunies puis précipitées avec du sulfate d'ammonium et la tête est enfin reprise dans le tampon de conservation11 avant d'être congelée à –20°C.
Le tampon de conservation contenant 20% de glycérol, ce tampon doit être changé avant utilisation. Le changement de tampon est réalisé par élution de la protéine sur une minicolonne Sephadex G-25 préalablement équilibrée avec le tampon approprié. La concentration finale de la tête est mesurée par spectrométrie d'absorption (coefficient d'extinction molaire ε280 nm = 4800 M-1 cm-1).
La protéine mutante P1G-Fpg de Lactococcus lactis a été préparée par Bertrand Castaing comme décrit par Serre et al. 2002) et la protéine Fpg de type sauvage d'Escherichia coli (EcFpg-wt) ont été préparées comme décrit par Boiteux et al.
Préparation des fragments d’ADN
Cette réaction comprend une dénaturation à 95°C pendant 2 minutes suivie de 31 cycles de 3 étapes : 95°C (dénaturation) pendant 1 minute, 53°C (recuit) pendant 1 minute, 72°C (extension) pendant 1 minute. Le produit PCR ainsi obtenu est soumis à une extraction phénol-chloroforme puis précipité à l'éthanol avant d'être purifié sur un gel préparatif acrylamide/bisacrylamide 6% (19/1). Après migration de 3 heures à 1230 V m-1, le gel est déposé sur une plaque de silice fluorescente et la position de la bande correspondant au fragment de 199 pb est révélée par exposition aux rayons ultraviolets.
Cette bandelette est découpée puis incubée une nuit à 54°C dans un tampon à faible force ionique12. L'ADN élué est ensuite purifié sur une mini colonne échangeuse d'ions (ELUTIP®, Schleicher & Schuell) : les colonnes sont lavées avec le tampon de faible force ionique, après quoi l'échantillon est chargé sur la colonne à l'aide d'une aiguille ; les contaminants sont éliminés par lavage, toujours avec le tampon de faible force ionique, et l'ADN est finalement récupéré par élution avec un tampon de haute force ionique13. Le fragment de 80 pb, sur lequel est centrée la séquence opérateur, est obtenu par digestion du fragment de 199 pb.
Le fragment de 199 pb est marqué (voir protocole de marquage) puis digéré par l'enzyme de restriction HpaII (Eurogentec) pendant 2 h à 37°C. Les fragments de 80 pb et 120 pb issus de cette digestion sont séparés sur un gel préparatif à 7%. Le gel est ensuite autoradiographié (film KODAK) pendant 30 minutes à température ambiante pour identifier les positions respectives des différentes bandes (199 pb non digérées, 80 pb et 120 pb).
La bande correspondant au fragment de 80 pb est excisée et incubée une nuit à 54 °C dans un tampon de faible force ionique puis l'ADN est purifié sur une minicolonne ELUTIP (voir plus haut). Des fragments double brin de 23 pb et 60 pb centrés sur la séquence opérateur ont été obtenus à partir d'oligonucléotides synthétisés par Eurogentec. Dans un premier temps, les brins d'ADN repris dans du tampon de charge dénaturant (50% TE, 50% formamide, bleu de bromophénol), puis chauffés 3 minutes à 95°C, sont purifiés sur gel.
Après migration de 5 heures à 2860 Vm-1, les bandes correspondant aux oligonucléotides sont identifiées et clivées comme précédemment (voir 199 pb). Les fragments double brin porteurs d'endommagement (Pr : site 1,3-propanediol) ont été obtenus à partir d'oligonucléotides synthétisés par Eurogentec, à l'exception du brin portant une 8-oxoguanine synthétisée par Didier Gasparutto du Laboratoire des Lésions des Acides Nucléiques (CEA). , Grenoble).
Marquage radioactif des fragments d’ADN
Les fragments marqués sont récupérés dans 80 µl d'eau ultra pure en retournant les filtres (centrifugation 5 min à 2500 g). b) Colonne SEPHADEX G-50. La colonne est préparée en introduisant la résine Sephadex G50 préalablement hydratée dans une seringue de 1 ml.
Formation des complexes ADN-protéine
Irradiations des échantillons
Electrophorèse en gel retard
Electrophorèse en gel de séquence
Avant l'électrophorèse, les échantillons ont été séchés et placés dans un tampon de chargement (formamide à 98 %, EDTA 10 mM, bromophénol à 0,025 %), puis chauffés pendant 5 minutes à 95 °C. Pour identifier les différentes bandes, les fragments sont séquencés selon la méthode Maxam-Gilbert [Sambrook et al., 1989] et déposés sur le gel. Les échantillons sont déposés sur un gel dénaturant d'acrylamide/bisacrylamide (Murée dans TBE) de 0,4 mm d'épaisseur et 40 cm de longueur.
Electrophorèse en gel d’agarose
Les fractions correspondantes sont de forme linéaire (molécules contenant du CDB), circulaire détendue (plus de CSB et pas de CDB) et superenroulée (ni CSB ni CDB). Plasmides dégradés, c'est-à-dire représentant plus de CDB ne sont pas détectés sur le gel, donc les fractions de molécules détectables sont L', C' et S'.
Electrophorèse en gel SDS-PAGE
Affinité répresseur- inducteur
Fluorescence
Dichroïsme circulaire
Spectrométrie de masse
Comparaison des fractions d'ADN complexe en fonction de la dose d'irradiation du complexe (cercles), du répresseur libre (triangles) et de l'ADN libre (losanges). Lors de l'irradiation, une diminution de la proportion de bobine intacte est observée (voir Figure 55). Intégrité de la chaîne peptidique versus réduction de l'intensité relative du dichroïsme circulaire (à 220 nm) d'une solution de casque pendant l'irradiation (moyenne de 3 expériences pour DC).
L'intégrité de la chaîne peptidique et l'intensité des DC évoluent ensemble lors de l'irradiation. L'intensité de fluorescence de la tête diminue sous irradiation sans aucune modification de la forme du spectre. Des changements dans la conformation du casque pendant l’irradiation pourraient également expliquer les changements observés dans l’intensité de la fluorescence.
Diminution de l'intensité relative de fluorescence de l'écouteur en fonction de la dose (moyenne de 3 expériences). Augmentation de l'intensité relative de fluorescence des dityrosines en fonction de la dose en conditions natives (moyenne de 3 expériences). Résultats et discussion Etude des têtes b) Analyse par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) de la tête irradiée et digérée.
Les résidus indiqués en vert sont ceux situés à moins de 0,45 nm de la molécule IPTG. Diminution de l'intensité relative de fluorescence du répresseur en fonction de la dose dans des conditions natives (carrés noirs) et dénaturantes (carrés blancs) (moyenne de 3 expériences). Proportion de protomères inductibles en fonction de la dose après irradiation du répresseur en absence (carrés) et en présence d'IPTG 10 µM (cercles) (moyenne de 3 expériences).
Fraction de protomères actifs en fonction de la dose après irradiation du répresseur en l'absence (carrés) et en présence d'IPTG 10 µM (cercles). Fraction d'ADN complexée à la protéine Fpg après irradiation des protéines libres (triangles), des complexes (cercles) et de l'ADN libre (carrés) telle que déterminée par analyse de gels retardés (moyenne de 3 expériences pour chaque cas). Il a été montré [Serre et al., 2002] que la conformation de la protéine Fpg ne change pas après fixation de l'ADN.
Résultats et discussion Étude Fpg 2. 2. 2. Activité et liaison de la protéine irradiée à l'ADN porteur de la lésion. Comparaison de fractions d'ADN complexé (cercles noirs) et d'ADN clivé (losanges blancs) avec wtFpg en fonction de la dose d'irradiation des protéines. L'analyse par dichroïsme circulaire de la conformation de la partie de tête a révélé une dégradation du peptide pendant l'irradiation.
L E REPRESSEUR DE L ’ OPERON LACTOSE
L A PROTEINE F PG
