(1)

ΕΘΝΙΚΟ & ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

«ΚΛΙΝΙΚΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ-ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ»

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ

ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΣΕ ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ, ΜΕΣΩ ΜΗ ΚΩΔΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ RNA (ncRNAs), ΝΕΩΝ ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΩΝ

ΜΕΤΑΓΡΑΦΩΝ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ PRMT1 ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣ ΝΕΑΣ ΓΕΝΙΑΣ

ΜΑΥΡΟΓΙΑΝΝΗΣ ΑΔΑΜΑΝΤΙΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ

ΑΘΗΝΑ 2016

(2)

ΕΘΝΙΚΟ & ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

«ΚΛΙΝΙΚΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ-ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ»

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ

ΑΘΗΝΑ 2016

(3)

ΕΘΝΙΚΟ & ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ & ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΜΟΝΑΔΑ IV

ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΜΕΛΟΣ ΔΕΠ: Ανδρέας Σκορίλας, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ

 Δημήτριος Γουργιώτης, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

 Διαμάντης Σίδερης, Αναπλ. Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

 Ανδρέας Σκορίλας, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

ΑΘΗΝΑ 2016

(4)

i ΠΡΟΛΟΓΟΣ

Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στον Τομέα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας του Βιολογικού του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, στα πλαίσια του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακής Ειδίκευσης με τίτλο Κλινική Βιοχημεία - Μοριακή Διαγνωστική, υπό την επίβλεψη του καθηγητή Σκορίλα Ανδρέα.

Αρχικά, θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες προς τον επιβλέπων καθηγητή μου, για την επιλογή μου στο θέμα διπλωματικής του. Έπειτα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον υποψήφιο διδάκτωρ Αδαμόπουλο Παναγιώτη για την καθοδήγησή και τις συμβουλές του που έπαιξαν καθοριστικό ρόλο στην ολοκλήρωση της εργασίας αυτής. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον μεταδιδάκτωρ Κοντό Χρήστο για τη βοήθειά του σε προβλήματα που αντιμετώπισα. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλο το ανθρώπινο δυναμικό του τομέα για το αρμονικό κλίμα συνεργασίας που υπήρχε.

Αθήνα, 2016

(5)

ii

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ………...……….1

1.1 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣ……….…………1

1.2 ΒΑΣΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣ………..…...…………5

1.2.1 Αλληλούχιση Maxam-Gilbert………5

1.2.2 Αλληλούχιση Sanger………..………….6

1.2.3 Προηγμένες μέθοδοι………...……….7

1.3 ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΝΕΑΣ ΓΕΝΙΑΣ……….………..9

1.3.1 Πυροαλληλούχιση………..………10

1.3.2 Αλληλούχιση με ημιαγωγό………..…………..11

1.3.3 Αλληλούχιση με «reversible terminators»……..………15

1.3.4 Αλληλούχιση με «ligation»………..………….19

1.4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ……….…………21

1.4.1 Προετοιμασία του δείγματος………..………..21

1.4.2 Προκλήσεις στην ανάλυση………..………..21

1.5 ΜΕΛΕΤΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ………22

1.5.1 Μέθοδοι………..23

1.5.2 Συναρμολόγηση του μεταγραφώματος………...……….25

1.5.3 Πλεονεκτήματα και περιορισμοί………..……27

1.5.4 Ανάλυση………..28

1.6 ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΟ ΜΑΤΙΣΜΑ………...……….31

1.7 ΓΟΝΙΔΙΟ PRMT1………33

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ………..……….39

2.1 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ……39

2.2 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣ…………..…..40

2.3 ΕΠΙΚYΡΩΣΗ ΤΩΝ ΕΥΡΗΜΑΤΩΝ……….…….51

2.3.1 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης……..……….51

2.3.2 Ηλεκτροφόρηση προϊόντος της PCR………...53

2.4 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ PRMTs ΜΕΣΩ ncRNAs……...54

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ……….………..55

3.1 ΝΕΕΣ ΘΕΣΕΙΣ ΣΥΡΡΑΦΗΣ ΕΞΩΝΙΩΝ………...……..55

3.2 ΝΕΟ ΕΞΩΝΙΟ……….……….59

(6)

iii

3.3 ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΩΝ ΕΥΡΗΜΑΤΩΝ ΜΕ PCR……….60

3.4 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΝΕΩΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΩΝ………..……66

3.5 ΔΙΚΤΥΟ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ miRNAs-ΓΟΝΙΔΙΩΝ……….69

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ………...………....………72

5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ………..………..77

ΠΕΡΙΛΗΨΗ………92

ABSTRACT………...……….93

(7)

1 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1.1 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣ

Το δεοξυριβονουκλεικό οξύ (DNA) ανακαλύφθηκε και απομονώθηκε πρώτη φορά από τον Friedrich Miescher, ωστόσο δεν μελετήθηκε εκτενώς για μερικές δεκαετίες λόγω της τότε αντίληψης ότι οι πρωτεΐνες περιέχουν τη γενετική πληροφορία. Αυτή η αντίληψη άλλαξε με τα πειράματα των Oswald Avery, Colin MacLeod και Maclyn McCarty που απέδειξαν ότι το απομονωμένο DNA μπορεί να μετασχηματίσει βακτήρια. Ήταν η πρώτη φορά που φάνηκε ότι το DNA έχει τη δυνατότητα μετασχηματισμού των κυττάρων. Το 1953 οι James Watson και Francis Crick ανακάλυψαν τη δομή του DNA, το οποίο αποτελείται από δύο αλυσίδες νουκλεοτιδίων με ελικοειδή τρισδιάστατη δομή, σχηματίζοντας δίκλωνη έλικα (Σχήμα 1.1.). Οι δύο αλυσίδες εμφανίζουν συμπληρωματικότητα μεταξύ τους και συγκρατούνται με δεσμούς υδρογόνου (διπλός δεσμός υδρογόνου μεταξύ ΑΤ και τριπλός δεσμός μεταξύ GC). Επίσης, λόγω του ημισυντηρητικού μηχανισμού αντιγραφής του το DNA έχει τη δυνατότητα κληρονόμησης από κύτταρο σε κύτταρο, και σε επίπεδο οργανισμού από γενιά σε γενιά [1].

Σχήμα 1.1. Η δομή της διπλής έλικας του DNA. Οι δύο αλυσίδες συγκρατούνται με διπλούς δεσμός υδρογόνου μεταξύ ΑΤ και τριπλούς δεσμός μεταξύ GC.

(8)

2

Ο Fred Sanger μέσα από τη δουλειά του, που ολοκλήρωσε την αμινοξική ακολουθία της ινσουλίνης (μία μικρή πρωτεΐνη που εκκρίνεται από το πάγκρεας), παρείχε στοιχεία ότι οι πρωτεΐνες έχουν προκαθορισμένη ακολουθία. Μετά την επιτυχία του Sanger, οι Watson και Crick προσπάθησαν να κατανοήσουν πώς το DNA επηρεάζει άμεσα τον σχηματισμό των πρωτεϊνών στο κύτταρο. Έτσι αναπτύχθηκε από τον Crick η θεωρεία ότι το DNA καθορίζει την αλληλουχία αμινοξέων των πρωτεϊνών και κατ’ επέκταση τη λειτουργία τους. Αλληλούχιση DNA είναι ο προσδιορισμός της ακριβής σειράς των νουκλεοτιδίων ενός μορίου DNA.

Περιλαμβάνει οποιαδήποτε μέθοδο και τεχνολογία χρησιμοποιείται για τον καθορισμό της σειράς των τεσσάρων βάσεων, αδενίνη (Α), γουανίνη (G), κυτοσίνη (C) και θυμίνη (Τ), σε μια αλυσίδα DNA [2]. Ωστόσο, υπάρχουν και άλλες βάσεις που μπορεί να βρίσκονται σε ένα μόριο. Σε μερικούς ιούς για παράδειγμα (ειδικά βακτηριοφάγους) η κυτοσίνη μπορεί να αντικαθίσταται με υδροξυ-μεθυλ ή υδροξυ- μεθυλ γλυκοκυτοσίνη. Στο DNA των θηλαστικών, μπορεί να βρεθούν εναλλακτικές βάσεις, όπως μεθυλιωμένες. Ανάλογα με την τεχνική αλληλούχισης που χρησιμοποιείται, μπορούν να ανιχνευτούν συγκεκριμένες τροποποιήσεις. Το βασικό ορόσημο στην αλληλούχιση νουκλεϊκών οξέων ήταν η ολοκλήρωση της ακολουθίας του RNA γονιδιώματος του βακτηριοφάγου MS2 [3].

Η πρώτη μέθοδος εύρεσης της ακολουθίας του DNA βασιζόταν στην επιμήκυνση εκκινητών για συγκεκριμένες περιοχές του DNA. Για την αλληλούχιση των άκρων του DNA του φάγου λ, χρησιμοποιήθηκε η καταλυτική ενεργότητα της DNA πολυμεράσης και η σήμανση νουκλεοτιδίων, οι οποίες χρησιμοποιούνται και σήμερα για την αλληλούχιση. Η μέθοδος αυτή φάνηκε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τον προσδιορισμό οποιασδήποτε ακολουθίας DNA χρησιμοποιώντας συνθετικούς εκκινητές ειδικούς για περιοχές του DNA. Ο Frederick Sanger χρησιμοποίησε αυτή τη στρατηγική της επιμήκυνσης των εκκινητών για να αναπτύξει πιο γρήγορες μεθόδους αλληλούχισης, όπως για παράδειγμα «αλληλούχιση DNA μέσω χημικής αποδόμησης» [4]. Το 1973, οι Walter Gilbert και Allan Maxam ανέφεραν την ακολουθία 24 ζευγών βάσεων χρησιμοποιώντας μία μέθοδο γνωστή ως ανάλυση μέσω περιπλάνησης-εύρεσης (wandering-spot). Η αλληλούχιση ευνοήθηκε και με την ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA, επιτρέποντας την απομόνωση δειγμάτων DNA από άλλες πηγές εκτός των ιών. Η πρώτη αλληλούχιση ολόκληρου DNA γονιδιώματος έγινε στον βακτηριοφάγο φΧ174 [5]. Αργότερα,

(9)

3

ολοκληρώθηκε η αλληλούχιση του γονιδιώματος του ιού Epstein-Barr, που αποτελείται από 172.282 νουκλεοτίδια [6].

Έπειτα, αλληλουχήθηκε το χρωμόσωμα 2 της ζύμης S. cerevisiae και μέχρι το 1990 το National Institutes of Health των Η.Π.Α. είχε ξεκινήσει πειράματα αλληλούχισης μεγάλης κλίμακας στα Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans και Saccharomyces cerevisiae με κόστος 0,75 δολάρια ανά βάση. Κατόπιν έγινε προσπάθεια αλληλούχισης cDNA ανθρώπου (Expressed Sequence Tags, ESTs), στην προσπάθεια μελέτης του κωδικού μέρους του γονιδιώματος [7]. Το 1995 ολοκληρώθηκε η αλληλούχιση του γονιδιώματος του βακτηρίου Haemophilus influenzae. Το κυκλικό του χρωμόσωμα αποτελείται από 1.830.137 βάσεις και η αλληλούχιση έγινε με whole-genome shotgun sequencing [8].

Η αλληλούχιση «shotgun» είναι μία μέθοδος που σχεδιάστηκε για την ανάλυση τμημάτων αλληλουχιών DNA μεγαλύτερες των 1000Kb, μέχρι και ολόκληρων χρωμοσωμάτων. Αρχικά, το DNA κατακερματίζεται, ακολουθεί αλληλούχιση των ξεχωριστών θραυσμάτων και τέλος συναρμολογείται ολόκληρη η ακολουθία με βάση τα αλληλεπικαλυπτόμενα τμήματά της. Μέθοδοι αλληλούχισης «shotgun»

χρησιμοποιήθηκαν και στο ανθρώπινο γονιδίωμα [9]. Τον Οκτώβριο του 2006, ο μη κερδοσκοπικός οργανισμός X-PRIZE, στα πλαίσια της προώθησης της ανάπτυξης των τεχνολογιών αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος, ανακοίνωσε το βραβείο των 10.000.000 δολαρίων στην πρώτη ερευνητική ομάδα που θα αλληλουχούσε 100 ανθρώπινα γονιδιώματα σε 10 μέρες ή λιγότερο, με κάλυψη τουλάχιστον 98% του γονιδιώματος, με όχι περισσότερα από ένα λάθος ανά 100.000 βάσεις και με κόστος όχι μεγαλύτερο των 10.000 ανά γονιδίωμα. Το κόστος εμφανίζει ραγδαία καθοδική πορεία με την πάροδο του χρόνου (Σχήμα 1.2.).

(10)

4

Σχήμα 1.2. Συνολικό κόστος αλληλούχισης του ανθρώπινου γονιδιώματος τα τελευταία χρόνια (σύμφωνα με το NHGRI).

Η γνώση της αλληλουχίας του DNA είναι πλέον απαραίτητη στη βασική βιολογική έρευνα, τη διαγνωστική, τη βιοτεχνολογία, την ιατροδικαστική και τη συστημική βιολογία. Κάθε χρόνο το National Human Genome Reasearch Institute προωθεί επιδοτήσεις για νέα έρευνα και ανάπτυξη στη γονιδιωματική. Αυτή τη στιγμή, υπάρχουν εξελιγμένες τεχνολογίες αλληλούχισης του DNA που επιτρέπουν την αλληλούχιση ακόμα και ολόκληρων γονιδιωμάτων διαφόρων ειδών, όπως το πρόγραμμα αλληλούχισης του ανθρώπινου γονιδιώματος (Human Genome Project) και η αλληλούχιση γονιδιωμάτων διαφόρων ζώων, φυτών και μικροβίων. Με τη χρήση ταχέων μεθόδων αλληλούχισης DNA έχει επιταχυνθεί σημαντικά η βιολογική και ιατρική έρευνα [10]. Σήμερα, η αλληλούχιση DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εύρεση της ακολουθίας ολόκληρων γονιδίων, συγκεκριμένων γενετικών περιοχών (για παράδειγμα συμπλέγματα γονιδίων ή οπερόνια), ολόκληρων χρωμοσωμάτων ή ολόκληρων γονιδιωμάτων. Με την αλληλούχιση προσδιορίζεται η σειρά των νουκλεοτιδίων στα μόρια DNA/RNA που απομονώνονται από ζώα, φυτά, βακτήρια, αρχαία ή οποιαδήποτε άλλη πηγή γενετικής πληροφορίας [11]. Αυτή η πληροφορία είναι χρήσιμη σε πολλά πεδία της βιολογίας και σε άλλες επιστήμες, όπως την ιατρική, την ιατροδικαστική και αλλού.

(11)

5

Η αλληλούχιση χρησιμοποιείται στη μοριακή βιολογία για τη μελέτη των γονιδιωμάτων και των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν. Η πληροφορία που παρέχεται επιτρέπει τον εντοπισμό αλλαγών σε γονίδια, συσχετίσεων με ασθένειες και φαινοτύπους και τον εντοπισμό νέων στόχων φαρμάκων [12]. Από τη στιγμή που το DNA είναι ένα πληροφοριακό μακρομόριο αφού κληρονομείται από γενιά σε γενιά, η αλληλούχιση χρησιμοποιείται στην εξελικτική βιολογία για τη μελέτη του πώς διαφορετικοί οργανισμοί σχετίζονται και πώς εξελίχθηκαν [13]. Το πεδίο της μεταγονιδιωματικής περιλαμβάνει τον χαρακτηρισμό των μικροοργανισμών που βρίσκονται στη φυσιολογική μικροχλωρίδα του εντέρου. Σε πιο ευρεία κλίμακα, η γνώση του ποιοί οργανισμοί βρίσκονται σε ένα συγκεκριμένο περιβάλλον, έχει μεγάλη σημασία για την έρευνα στην οικολογία, την επιδημιολογία, τη μικροβιολογία και άλλα πεδία. Είναι εφικτή η αλληλούχιση γονιδίων (ή θεωρητικά ολόκληρων γονιδιωμάτων) ασθενών για την ανίχνευση προδιάθεσης για γενετικές ασθένειες.

Αυτό είναι μία μορφή γενετικού τεστ αν και ορισμένα γενετικά τεστ μπορεί να μην περιλαμβάνουν αλληλούχιση DNA [14]. Η αλληλούχιση του DNA μπορεί τέλος να χρησιμοποιηθεί μαζί με μεθόδους DNA profiling κατά το τεστ πατρότητας και στην ιατροδικαστική [13].

1.2 ΒΑΣΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣ

1.2.1 Αλληλούχιση Maxam-Gilbert

Οι Allan-Maxam και Walter-Gilbert ανακάλυψαν μια μέθοδο αλληλούχισης DNA η οποία βασιζόταν στη χημική τροποποίηση του DNA και επακόλουθη διάσπαση σε συγκεκριμένες βάσεις [15]. Γνωστή και ως χημική αλληλούχιση, αυτή η μέθοδος επέτρεπε τη χρήση απομονωμένου δείγματος δίκλωνου DNA χωρίς την περαιτέρω κλωνοποίηση. Λόγω της πολυπλοκότητας και λόγω του ότι απαιτούσε χρήση ραδιενεργούς σήμανσης, περιορίστηκε η χρήση της ειδικά μετά την πρόοδο της μεθόδου αλληλούχισης Sanger [16]. H αλληλούχιση Maxam-Gilbert απαιτεί ραδιενεργό σήμανση στο 5’ άκρο του DNA και απομόνωση των DNA θραυσμάτων προς αλληλούχιση. Κατόπιν η χημική κατεργασία δημιουργεί ρήξεις σε μικρό ποσοστό μιας ή δύο εκ των τεσσάρων νουκλεοτιδικών βάσεων σε κάθε μία από τις τέσσερις αντιδράσεις (G, A+G, C, C+T). Η συγκέντρωση των χημικών που

(12)

6

χρησιμοποιούνται ελέγχεται για να εισάγει κατά μέσο όρο μία τροποποίηση ανά μόριο DNA. Έτσι, δημιουργείται μία σειρά από σημασμένα θραύσματα από το ραδιοσημασμένο άκρο ως το πρώτο σημείο κοπής σε κάθε μόριο. Τα θραύσματα στις τέσσερις αντιδράσεις ηλεκτροφορούνται για διαχωρισμό με βάση το μέγεθος. Για να είναι εμφανείς οι ζώνες η πηκτή εκτίθεται σε ακτίνες Χ. Κάθε μία από τις ζώνες αντιπροσωπεύει ένα ραδιοσημασμένο θραύσμα DNA. Με αυτόν τον τρόπο γίνεται τελικά ο προσδιορισμός της ακολουθίας [17].

1.2.2 Αλληλούχιση Sanger

Η μέθοδος τερματισμού αλυσίδας αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger και τους συνεργάτες και σύντομα έγινε δημοφιλής λόγω της σχετικής της ευκολίας και αξιοπιστίας. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιούσε λιγότερα τοξικά χημικά και μικρότερες ποσότητες ραδιενέργειας από ότι η μέθοδος αλληλούχισης Maxam-Gilbert [18].

Λόγω της ευκολίας της σε σχέση με τη μέθοδο Maxam-Gilbert, η μέθοδος Sanger σύντομα αυτοματοποιήθηκε και είναι η μέθοδος που χρησιμοποιούσαν οι πρώτης γενιάς αλληλουχιτές DNA [19]. Χρησιμοποιούνται τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις που η κάθε μια περιλαμβάνει ένα διδεοξυ-ανάλογο των τεσσάρων νουκλεοτιδίων G, A, C, και Τ αναμιγμένα σε καθορισμένη ποσότητα με κανονικά νουκλεοτίδια για να τερματίζονται περίπου 0,5% των αυξανόμενων αλληλουχιών [20]. Δηλαδή, με τη βοήθεια των διδεοξυ-αναλόγων των τεσσάρων νουκλεοτιδίων οι αντιδράσεις επιμήκυνσης σταματούν τυχαία τη στιγμή που η DNA πολυμεράση προσθέτει το διδεοξυ-ανάλογο αντί του κανονικού νουκλεοτιδίου. Για την επισήμανση των τεσσάρων αντιδράσεων χρησιμοποιούνται τέσσερις διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές συνδεδεμένες με τα διδεοξυ-νουκλεοτίδια [21]. Οι τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις με τα κομμάτια διαφορετικών μεγεθών (που έχουν προκύψει από το τυχαίο σταμάτημα των αντιδράσεων) ομαδοποιούνται και ηλεκτροφορούνται μαζί σε μια στήλη ή τριχοειδές. Οι ηλεκτροφορητικές συνθήκες επιτρέπουν το διαχωρισμό τμημάτων DNA που διαφέρουν σε μέγεθος ενός νουκλεοτιδίου (Σχήμα 1.3.) [22].

(13)

7

Σχήμα 1.3. Σχηματική απεικόνιση αποτελέσματος της αλληλούχισης Sanger.

1.2.3 Προηγμένες μέθοδοι

Η αλληλούχιση μεγάλης κλίμακας στοχεύει στον προσδιορισμό της ακολουθίας μεγάλων κομματιών DNA, όπως για παράδειγμα ολόκληρων χρωμοσωμάτων [23].

Πρώτα γίνεται κοπή των μεγάλων τμημάτων DNA σε μικρότερα με τη χρήση περιοριστικών ενζύμων ή με υπερήχους. Τα τμήματα αυτά κλωνοποιούνται σε φορείς DNA και ενισχύονται σε ένα βακτηριακό ξενιστή, όπως το E. Coli. Τα μικρά τμήματα DNA που απομονώνονται από ξεχωριστές βακτηριακές αποικίες αλληλουχούνται και συναρμολογούνται με τη βοήθεια βιοπληροφορικής σε μία συνεχή ακολουθία (Σχήμα 1.4.) [24].

(14)

8

Σχήμα 1.4. Κατακερματίζεται το DNA και τα θραύσματα κλωνοποιούνται σε φορείς που θα μετασχηματίσουν ένα βακτηριακό ξενιστή. Τα τμήματα DNA που απομονώνονται από διαφορετικές βακτηριακές αποικίες αλληλουχούνται και συναρμολογούνται με τη βοήθεια βιοπληροφορικής σε μία συνεχή ακολουθία.

Ο όρος «de novo» αλληλούχιση αναφέρεται σε μεθόδους προσδιορισμού της ακολουθίας του DNA χωρίς καμία προϋπάρχουσα γνώση της. Τα κενά που υπάρχουν μετά τη συναρμολόγηση μπορούν να καλυφθούν με χρήση εκκινητών πειραματικά.

Οι διάφορες στρατηγικές που μπορούν να ακολουθηθούν εμφανίζουν πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα, ενώ διαφέρουν ως προς την ταχύτητα και την ακρίβεια [25]. Οι μέθοδοι «shotgun» χρησιμοποιούνται συνήθως για την αλληλούχιση μεγάλων γονιδιωμάτων αλλά το στάδιο της συναρμολόγησης είναι σύνθετο και δύσκολο, ειδικά σε περιοχές με επαναλαμβανόμενες ακολουθίες που συχνά αφήνουν κενά κατά

(15)

9

τη συναρμολόγηση [26]. Οι περισσότερες προσεγγίσεις περιλαμβάνουν ένα στάδιο in vitro κλωνοποίησης για την ενίσχυση του κάθε μορίου DNA, διότι οι μέθοδοι μοριακής ανίχνευσης που χρησιμοποιούν δεν είναι αρκετά ευαίσθητοι για την αλληλούχιση ενός μόνο μορίου. Κατά την PCR σε γαλάκτωμα (emulsion PCR) απομονώνονται ξεχωριστά τα μόρια DNA σε υδατικά σταγονίδια με σφαιρίδια επικαλυμμένα με εκκινητές, σε ένα ελαιώδες περιβάλλον [27]. Κατόπιν μέσω PCR κάθε σφαιρίδιο καλύπτεται με πανομοιότυπα αντίγραφα του μορίου DNA ακινητοποιημένα για τη μετέπειτα αλληλούχιση [28]. Μια άλλη μέθοδος in vitro κλωνικής ενίσχυσης είναι η bridge PCR, στην οποία τα τμήματα ενισχύονται με εκκινητές προσκολλημένους σε στερεή επιφάνεια, σχηματίζοντας «αποικίες» DNA ή

«συμπλέγματα» DNA [29].

1.3 ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΝΕΑΣ ΓΕΝΙΑΣ

Η αλληλούχιση νέας γενιάς χρησιμοποιείται στην αλληλούχιση του γονιδιώματος, στην επαναλληλούχιση, στη μελέτη μεταγραφώματος (RNA-Seq), στη μελέτη αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών-νουκλεικών οξέων (ChiP-seq) και στην επιγονιδιωματική μελέτη (epigenomics). Η επαναλληλούχιση είναι απαραίτητη επειδή το γονιδίωμα ενός ατόμου του δεν αποτυπώνει όλη την ποικιλομορφία που υπάρχει μεταξύ ατόμων του ίδιου είδους [30]. Η υψηλή απαίτηση για αλληλούχιση με όσο το δυνατόν χαμηλότερο κόστος έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη τεχνολογιών αλληλούχισης υψηλής απόδοσης (high-throughput) που προσδιορίζουν την ακολουθία πολλών αλυσίδων DNA παράλληλα, «διαβάζοντας» χιλιάδες ή εκατομμύρια αλληλουχίες ταυτόχρονα. Οι τεχνολογίες που υπάρχουν σήμερα συγκριτικά με τις βασικές μεθόδους αλληλούχισης, έχουν καταφέρει να μειώσουν δραματικά το κόστος [31]. Σε εξαιρετικά υψηλής απόδοσης τεχνολογίες μπορούν να αλληλουχούνται μέχρι και εκατομμύρια ακολουθίες παράλληλα [32].

(16)

10 1.3.1 Πυροαλληλούχιση

Η πυροαλληλούχιση είναι μία μέθοδος αλληλούχισης μέσω σύνθεσης, η οποία διαφέρει από τη μέθοδο αλληλούχισης Sanger στο ότι βασίζεται στην ανίχνευση πυροφωσφορικού κατά την ενσωμάτωση νουκλεοτιδίου, παρά στον τερματισμό αλυσίδας με διδεοξυνουκλεοτίδια [33]. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας του DNA γίνεται μέσω εκπομπής φωτός κατά την ενσωμάτωση του επόμενου συμπληρωματικού νουκλεοτιδίου με την προϋπόθεση ότι μόνο ένα από τα 4 νουκλεοτίδια προστίθεται, με κυκλικό τρόπο. Η ένταση της εκπομπής φωτός καθορίζει το εάν υπάρχουν περισσότερες από μία συγκεκριμένη βάση στη σειρά. Το προηγούμενο νουκλεοτίδιο που προστέθηκε αποικοδομείται πριν την προσθήκη του επόμενου για τη συνέχιση της σύνθεσης, επιτρέποντας την αποκάλυψη του επόμενου νουκλεοτιδίου/ων μέσω καταγραφής της έντασης του εκπεμπόμενου φωτός (εάν το νουκλεοτίδιο που προστέθηκε ήταν το επόμενο συμπληρωματικό της αλληλουχίας).

Η διαδικασία επαναλαμβάνεται για καθένα από τα 4 νουκλεοτίδια μέχρι που γίνεται ο προσδιορισμός ολόκληρης της ακολουθίας [34].

Η αλληλούχιση μέσω σύνθεσης περιλαμβάνει την ενζυμική σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας μιας αλυσίδας DNA που επιθυμούμε να αλληλουχίσουμε. Η μέθοδος πυροαλληλούχισης βασίζεται στην ανίχνευση της δράσης της DNA πολυμεράσης με ένα άλλο χημειοφθορίζον ένζυμο. Φυσικά η σύνθεση του συμπληρωματικού κλώνου γίνεται με μία βάση κάθε φορά, ανιχνεύοντας αν η βάση προστέθηκε κάθε φορά. Το εκμαγείο DNA είναι ακινητοποιημένο και διαλύματα των 4 νουκλεοτιδίων προστίθενται διαδοχικά και ξεπλένεται από το σημείο αντίδρασης. Φως εκπέμπεται μόνο όταν το συμπληρωματικό νουκλεοτίδιο προστέθηκε στο 3’ συντιθέμενο άκρο, και με την προϋπόθεση ότι οι βάσεις προστίθενται με κυκλικό τρόπο, είναι εφικτός τελικά ο προσδιορισμός της ακολουθίας [35]. Το μονόκλωνο DNA εκμαγείο υβριδοποιείται σε έναν εκκινητή και επωάζεται με τα ένζυμα DNA πολυμεράση, ΑΤP σουλφουριλάση, λουσιφεράση και απυράση και με τα υποστρώματα APS (adenosine 5´

phosphosulfate) και λουσιφερίνη. Η προσθήκη του ενός εκ των 4 dNTPs γίνεται στο επόμενο βήμα. Η DNA πολυμεράση προσθέτει το σωστό συμπληρωματικό dNTP στο εκμαγείο. Κατά την ενσωμάτωση απελευθερώνεται πυροφωσφορικό (PPi). H ATP σουλφουριλάση μετατρέπει το PPi σε ATP παρουσία APS. Αυτό το ATP δρα ως υπόστρωμα για τη μετατροπή της λουσιφερίνης σε οξυλουσιφερίνη (η αντίδραση

(17)

11

καταλύεται με το ένζυμο λουσιφεράση) με αποτέλεσμα να εκπέμπεται φως με ένταση ανάλογη της ποσότητας του ATP. Το φως που παράγεται κατά την αντίδραση που καταλύει η λουσιφεράση ανιχνεύεται με κάμερα και αναλύεται σε ένα πυρόγραμμα (pyrogram) [36]. Τα νουκλεοτίδια που δεν ενσωματώθηκαν καθώς και το ATP αποικοδομούνται με τη δράση της απυράσης και έτσι η διαδικασία μπορεί να επαναληφθεί με το επόμενο νουκλεοτίδιο (Σχήμα 1.5.).

Σχήμα 1.5. Η πυροαλληλούχιση βασίζεται στην ανίχνευση πυροφωσφορικού κατά την ενσωμάτωση ενός νουκλεοτιδίου.

Η 454 πυροαλληλούχιση χρησιμοποιεί ένα μεγάλης κλίμακας σύστημα παράλληλης πυροαλληλούχισης, που είναι ικανό να αλληλουχεί περίπου 400-600 Μbp σε 10 ώρες στο Genome Sequencer FLX System. Το μήκος των reads είναι 400- 500 bp [30].

1.3.2 Αλληλούχιση με ημιαγωγό

Η αλληλούχιση με ημιαγωγό βασίζεται στην ανίχνευση ιόντων υδρογόνου που απελευθερώνονται κατά τον πολυμερισμό του DNA. Είναι και αυτή μία μέθοδος αλληλούχισης μέσω σύνθεσης, όπου συντίθεται η συμπληρωματική αλυσίδα ενός DNA εκμαγείου. Σε ένα microwell που περιέχει το εκμαγείο προστίθεται ένα από τα 4 dNTPs. Εάν το dNTP που προστέθηκε είναι συμπληρωματικό με το απέναντι του 3’

συντιθέμενου άκρου, ενσωματώνεται απελευθερώνοντας ένα ιόν υδρογόνου. Αυτό διεγείρει έναν ISFET αισθητήρα ιόντων που ανιχνεύει την αντίδραση [37]. Εάν υπάρχουν ομοπολυμερή στην ακολουθία εκμαγείο τότε προστίθενται περισσότερα

(18)

12

μόρια dNTPs σε έναν κύκλο. Αυτό οδηγεί σε ακόμα μεγαλύτερη απελευθέρωση υδρογόνων και συνεπώς το σήμα που παράγεται είναι πιο έντονο (Σχήμα 1.6.) [38].

Σχήμα 1.6. Η αλληλούχιση με ημιαγωγό βασίζεται στην ανίχνευση ιόντων υδρογόνου που απελευθερώνονται κατά τον πολυμερισμό του DNA.

Αυτή η τεχνολογία διαφέρει από άλλες τεχνολογίες αλληλούχισης στο ότι δε χρησιμοποιούνται τροποποιημένα νουκλεοτίδια ούτε οπτικά μέσα ανίχνευσης σήματος [39]. Στη φύση η ενσωμάτωση ενός dNTP σε μία συντιθέμενη αλυσίδα DNA περιλαμβάνει το σχηματισμό ομοιοπολικού δεσμού και την απελευθέρωση πυροφωσφορικού και ενός θετικά φορτισμένου ιόντος υδρογόνου. Ένα dNTP ενσωματώνεται μόνο εάν είναι συμπληρωματικό με το εκμαγείο στο ελεύθερο 3’

άκρο της συντιθέμενης αλυσίδας [40]. Με βάση αυτά, στην αλληλούχιση με ημιαγωγό γίνεται ανίχνευση της απελευθέρωσης ιόντων υδρογόνου μετά από προσθήκη ενός dNTP (Σχήμα 1.7.).

(19)

13

Σχήμα 1.6. Στην αλληλούχιση με ημιαγωγό γίνεται ανίχνευση της απελευθέρωσης ιόντων υδρογόνου μετά από ενσωμάτωση ενός νουκλεοτιδίου.

Στο chip ημιαγωγού υπάρχουν microwells που καθένα περιέχει αρκετά αντίγραφα ενός μονόκλωνου DNA εκμαγείου προς αλληλούχιση [38]. Εάν το dNTP που προστέθηκε είναι συμπληρωματικό με το επόμενο αζευγάρωτο νουκλεοτίδιο στο εκμαγείο, ενσωματώνεται στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα με την καταλυτική ενεργότητα της DNA πολυμεράσης. Εάν το dNTP που προστέθηκε δεν είναι συμπληρωματικό δεν γίνεται ενσωμάτωση και συνεπώς ούτε βιοχημική αντίδραση.

Το ιόν υδρογόνου που απελευθερώνεται κατά την αντίδραση αλλάζει το pH του διαλύματος, που ανιχνεύεται με τον αισθητήρα ιόντων. Τα dNTPs που δεν ενσωματώθηκαν ξεπλένονται πριν τον επόμενο κύκλο που προστίθεται το επόμενο dNTP [39]. Κάτω από το επίπεδο που βρίσκονται τα microwells υπάρχει ένα ιοντοευαίσθητο στρώμα, κάτω από το οποίο βρίσκεται ο αισθητήρας ιόντων. Όλα αυτά εμπεριέχονται σε ένα CMOS chip ημιαγωγού, όμοιο με αυτό που χρησιμοποιείται στους υπολογιστές. Κάθε chip περιλαμβάνει μία συστοιχία από microwells που αντιστοιχούν σε ανιχνευτές ISFET. Κάθε ιόν υδρογόνου που απελευθερώνεται διεγείρει τον αισθητήρα. Η σειρά των ηλεκτρικών παλμών που παράγονται μεταφράζονται μέσω υπολογιστή στην ακολουθία του DNA (Σχήμα 1.8.) [41].

(20)

14

Σχήμα 1.7. Η σειρά των ηλεκτρικών παλμών που παράγονται μεταφράζονται μέσω υπολογιστή στην ακολουθία του DNA.

Τα κυριότερα πλεονεκτήματα της αλληλούχισης με ημιαγωγό είναι η ταχύτητα και το σχετικά μικρό κόστος εξοπλισμού. Αυτό έχει γίνει επιτρεπτό με την έλλειψη ανάγκης χρήσης σημασμένων νουκλεοτιδίων και οπτικών μέσων ανίχνευσης σήματος [38]. Επίσης, η αλληλούχιση μπορεί να γίνει σε πραγματικό χρόνο καθώς το μηχάνημα καταγράφει γεγονότα ενσωμάτωσης νουκλεοτιδίων από την DNA πολυμεράση. Εάν υπάρχουν ομοπολυμερή νουκλεοτιδίων (για παράδειγμα GGGGG) τότε ενσωματώνονται περισσότερα νουκλεοτίδια σε έναν κύκλο και κατ’ επέκταση απελευθερώνονται περισσότερα μόρια υδρογόνου. Αυτό οδηγεί σε μεγαλύτερη αλλαγή του pH και αναλογικά μεγαλύτερο σήμα [38]. Ένας περιορισμός είναι το ότι είναι δύσκολο να έχει ακρίβεια σε μεγάλες επαναλήψεις. Αυτός ο περιορισμός υπάρχει και σε άλλες τεχνικές, όπως στην πυροαλληλούχιση [42]. Το σήμα που παράγεται από μεγάλο αριθμό επαναλήψεων είναι δύσκολο να διαφοροποιηθεί από επαναλήψεις παρόμοιου αλλά διαφορετικού αριθμού. Για παράδειγμα ομοπολυμερή μήκους 7 νουκλεοτιδίων είναι δύσκολο να διαφοροποιηθούν από ομοπολυμερή των 8 νουκλεοτιδίων. Ένας άλλος περιορισμός είναι το μικρό μήκος των reads. Γενικά, για de novo συναρμολόγηση γονιδιώματος είναι καλό τα reads να έχουν όσο το δυνατόν μεγαλύτερο μήκος. Οι αλληλουχιτές ημιαγωγού Ion Torrent παράγουν reads έως και 400 bp, ενώ και η απόδοση είναι προς το παρόν μικρότερη σε σύγκριση με άλλες high-throughput τεχνολογίες [43].

(21)

15 1.3.3 Αλληλούχιση με «reversible terminators»

Η μέθοδος αλληλούχισης βασίζεται σε χρωμοφόρους reversible terminators που επιτρέπουν την ταυτοποίηση μεμονωμένων βάσεων καθώς ενσωματώνονται σε αλυσίδες DNA. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος και συγκεκριμένων περιοχών αυτού, στην ανάλυση μεταγραφώματος, στη μεταγονιδιωματική, στην ανακάλυψη μη κωδικών RNA, στην ανάλυση μεθυλίωσης και στην ανάλυση αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών-νουκλεικών οξέων. Η τεχνολογία αλληλούχισης της Illumina περιλαμβάνει 3 βήματα: ενίσχυση, αλληλούχιση και ανάλυση [44]. Η διαδικασία ξεκινάει με απομόνωση του DNA. Το DNA κόβεται σε μικρότερα θραύσματα και τροποποιείται μοριακά με αλληλουχίες- αντάπτορες (και με άλλες αλληλουχίες) που χρησιμοποιούνται κατά την ενίσχυση, την αλληλούχιση ή την ανάλυση. Το τροποποιημένο DNA φορτώνεται σε ειδικό chip όπου γίνεται η ενίσχυση και η αλληλούχιση. Το chip περιέχει χιλιάδες ολιγονουκλεοτίδια με τέτοιο τρόπο ώστε να μπορούν να προσδένουν θραύσματα DNA που έχουν συμπληρωματικές ακολουθίες. Όταν τα θραύσματα προσδεθούν ξεκινάει η φάση δημιουργίας cluster. Σε αυτή τη φάση γίνονται περίπου 1000 αντίγραφα κάθε θραύσματος DNA [45]. Κατόπιν, εκκινητές και τροποποιημένα νουκλεοτίδια εισέρχονται στο chip. Τα νουκλεοτίδια έχουν reversible 3’ blockers που αναγκάζουν τους εκκινητές να προσθέτουν μόνο ένα νουκλεοτίδιο κάθε φορά. Μετά από κάθε κύκλο σύνθεσης, μία κάμερα λαμβάνει φωτογραφία του chip και με τη χρήση υπολογιστή προσδιορίζεται ποια βάση προστέθηκε με βάση το μήκος κύματος της φθορισμοφόρου σήμανσης και καταγράφεται για κάθε σημείο στο chip. Μετά από κάθε κύκλο τα μη ενσωματωμένα νουκλεοτίδια ξεπλένονται. Ακολουθεί ένα βήμα

«deblocking» για την απομάκρυνση της 3’ terminal blocking ομάδας και του χρωμογόνου σε κάθε κύκλο. Η διαδικασία συνεχίζεται τελικά μέχρι την αλληλούχιση ολόκληρης της συστοιχίας [46].

Το πρώτο στάδιο μετά την απομόνωση του DNA είναι ο θρυμματισμός του (tagmentation). Ένζυμα που καλούνται transposomes κόβουν τυχαία το DNA σε μικρά τμήματα (tags). Προστίθενται αντάπτορες σε κάθε πλευρά των σημείων κοπής (ligation). Αλυσίδες που δεν έχουν αντάπτορες απομακρύνονται. Στο επόμενο στάδιο (reduced cycle amplification), προστίθενται αλληλουχίες για πρόσδεση με primers, αλληλουχίες index και τερματικές αλληλουχίες (Σχήμα 1.9.) [47]. Οι αλληλουχίες που χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό συγκεκριμένων δειγμάτων είναι συνήθως

(22)

16

μήκους 6 bp και επιτρέπουν μέχρι και 96 διαφορετικά δείγματα να «τρέχουν»

ταυτόχρονα [48]. Κατά την ανάλυση ο υπολογιστής ομαδοποιεί όλα τα reads με τον ίδιο «κωδικό». Οι τερματικές ακολουθίες χρησιμοποιούνται για τη δέσμευση της κάθε αλυσίδας DNA στο flow cell (κύτταρο). Είναι μία μέθοδος αλληλούχισης μέσω σύνθεσης. Το flow cell περιέχει ολιγονουκλεοτίδια (μικρού μήκους νουκλεοτιδικές ακολουθίες) που επικαλύπτουν την επιφάνεια του κυττάρου και δεσμεύουν τις αλυσίδες DNA κατά την αλληλούχιση [49]. Τα ολιγονουκλεοτίδια είναι συμπληρωματικά με τις δύο τερματικές ακολουθίες που προστίθενται σε αυτό το στάδιο. Καθώς το DNA εισέρχεται στο κύτταρο, ένας από τους αντάπτορες προσδένεται σε ένα συμπληρωματικό ολιγονουκλεοτίδιο. Μόλις τα θραύσματα προσδεθούν ξεκινάει ο σχηματισμός cluster [50]. Στόχος είναι η δημιουργία εκατοντάδων αλυσίδων DNA. Κάποιες θα είναι forward και οι υπόλοιπες reverse πολικότητας.

Σχήμα 1.8. Το DNA κόβεται σε μικρότερα θραύσματα και τροποποιείται μοριακά με αλληλουχίες-αντάπτορες και άλλες αλληλουχίες που χρησιμοποιούνται κατά την ενίσχυση, την αλληλούχιση ή την ανάλυση.

Τα clusters δημιουργούνται μέσω bridge PCR (Σχήμα 1.10.). Η DNA πολυμεράση κινείται κατά μήκος μιας αλυσίδας συνθέτοντας τη συμπληρωματική της. Στην κορυφή της reverse αλυσίδας υπάρχει ένας αντάπτορας. Η αλυσίδα κάμπτεται και προσδένεται στο ολιγονουκλεοτίδιο που είναι συμπληρωματικό με τον

(23)

17

αντάπτορα. Η DNA πολυμεράση προσδένεται στη reverse αλυσίδα συνθέτοντας τον συμπληρωματικό της κλώνο. Το δίκλωνο DNA αποδιατάσσεται ούτως ώστε η κάθε αλυσίδα να μπορεί να προσδεθεί σε ένα γειτονικό ολιγονουκλεοτίδιο. Με αυτόν τον τρόπο η μία θα είναι η reverse και η άλλη η forward αλυσίδα. Αυτή η μεθοδολογία ονομάζεται bridge PCR και γίνεται σε κάθε ένα από τα χιλιάδες clusters του κυττάρου [51]. Η κλωνική ενίσχυση είναι απαραίτητη για λόγους ελέγχου. Εάν μια αλυσίδα βρεθεί να έχει ασυνήθιστη αλληλουχία, μπορεί να ελεγχθεί η ύπαρξη αλυσίδας reverse πολικότητας ούτως ώστε να επιβεβαιωθεί ότι υπάρχει συμπληρωματική αλυσίδα με την ίδια ιδιαιτερότητα [52, 53]. Οι forward και reverse αλυσίδες δηλαδή λειτουργούν ως σημεία ελέγχου τεχνιτών αποτελεσμάτων (artifacts).

Σχήμα 1.9. Σχηματική απεικόνιση της τεχνικής bridge PCR.

Στο τέλος της bridge PCR, όλες οι reverse αλυσίδες ξεπλένονται και παραμένουν μόνο οι forward. Οι εκκινητές προσδένονται στις forward αλυσίδες και προσθέτουν σημασμένα νουκλεοτίδια στο εκμαγείο. Μόνο μία βάση προστίθεται σε κάθε κύκλο. Υπάρχει ένας reversible terminator σε κάθε νουκλεοτίδιο που δεν επιτρέπει την προσθήκη περισσότερων του ενός ανά κύκλο. Κάθε μία από τις 4 βάσεις εκπέμπει σε διαφορετικό μήκος κύματος και μετά από κάθε προσθήκη το μηχάνημα καταγράφει ποια βάση προστέθηκε (Σχήμα 1.11.) [54].

(24)

18

Σχήμα 1.10. Στην αλληλούχιση με reversible terminators κάθε μία από τις 4 βάσεις εκπέμπει σε διαφορετικό μήκος κύματος.

Μόλις διαβαστεί η μία αλυσίδα του DNA απομακρύνεται. Κατόπιν προσδένεται ο index 1 εκκινητής, πολυμερίζοντας την index 1 ακολουθία. Η αλυσίδα σχηματίζει πάλι γέφυρα και το 3’ άκρο της αλυσίδας DNA προσδένεται σε ένα ολιγονουκλεοτίδιο στο κύτταρο. Προσδένεται ο index 2 εκκινητής, πολυμερίζοντας την index 2 αλληλουχία και ξεπλένεται [54]. Η DNA πολυμεράση συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα. Ακολουθεί διαχωρισμός και μπλοκάρεται το 3’ άκρο των αλυσίδων. Η forward αλυσίδα ξεπλένεται και η διαδικασία επαναλαμβάνεται για τη reverse αλυσίδα. Η αλληλούχιση γίνεται ταυτόχρονα σε εκατομμύρια clusters κάθε στιγμή. Κάθε cluster έχει περίπου 1000 πανομοιότυπα αντίγραφα του αρχικού DNA θραύσματος [55]. Τα δεδομένα της αλληλούχισης αναλύονται με τη βοήθεια αλληλεπικαλυπτόμενων περιοχών (contigs) ή με ευθυγράμμιση με μία ακολουθία αναφοράς για τον εντοπισμό αλλαγών [56]. Ωστόσο τα reads που παράγονται δεν είναι μεγάλου μήκους, δημιουργώντας πρόβλημα στην μελέτη περιοχών με επαναλαμβανόμενες ακολουθίες, ειδικά κατά την de novo συναρμολόγηση όταν δεν υπάρχει ακολουθία αναφοράς [57]. Επιπλέον δυσκολίες στην ανάλυση μπορεί να προκαλέσουν λάθη από μη ακριβείς πολυμεράσες, χιμαιρικές ακολουθίες και PCR- bias, που μπορεί να οδηγήσουν σε εσφαλμένη αλληλουχία [42].

(25)

19 1.3.4 Αλληλούχιση με «ligation»

Στην αλληλούχιση με ligation (πλατφόρμα SOLiD™ της Applied Biosystems) χρησιμοποιούνται πάλι αντάπτορες συνδεδεμένοι με τα θραύσματα της βιβλιοθήκης, όπως και στις υπόλοιπες πλατφόρμες αλληλούχισης νέας γενιάς [58]. Η ενίσχυση των θραυσμάτων της βιβλιοθήκης γίνεται με PCR σε γαλάκτωμα και τα ενισχυμένα προϊόντα μεταφέρονται σε γυάλινη επιφάνεια όπου λαμβάνει χώρα η αλληλούχιση μέσω επαναλαμβανόμενων κύκλων υβριδισμού και σύνδεσης μεταξύ δεκαέξι συνδυασμών δινουκλεοτιδίων. Κάθε συνδυασμός επισημαίνεται με διαφορετική φθορίζουσα χρωστική, ενώ κάθε χρωστική χρησιμοποιείται για τη σήμανση τεσσάρων δινουκλεοτιδίων. Χρησιμοποιώντας παράλληλα κατάλληλους εκκινητές από μήκος n έως μήκος n-4 νουκλεοτίδια καθώς και το συγκεκριμένο πλάνο βάσει του οποίου κάθε φορά είναι γνωστό ποιο δινουκλεοτίδιο εισάγεται, είναι εφικτό να αναλυθεί κάθε θέση δύο φορές στην ίδια αντίδραση [59]. Αρχικά, οι εκκινητές υβριδοποιούνται με την αλληλουχία των ανταπτόρων μέσα στη βιβλιοθήκη. Στη συνέχεια ένα σύνολο από τα τέσσερα σημασμένα δινουκλεοτίδια ανταγωνίζονται για την πρόσδεσή τους μετά τον εκκινητή. Προφανώς μόνο ο συνδυασμός δινουκλεοτιδίων που αντιστοιχεί στα επόμενα δυο από τον εκκινητή νουκλεοτίδια είναι ικανός να συνδεθεί και να ανιχνευθεί με το ειδικό χρώμα που είναι σημασμένος (το χρώμα κάθε φορά έχει οριστεί με βάση ένα συγκεκριμένο πλάνο). Μετά από σειρά κύκλων το προϊόν που έχει επιμηκυνθεί-αλληλουχηθεί απομακρύνεται έως τη θέση n-1 του αρχικού εκκινητή για μια νέα σειρά κύκλων αλληλούχισης. Είναι απαραίτητη η πραγματοποίηση πέντε κύκλων όπου σε καθένα η θέση του εκκινητή μετακινείται πίσω κατά μία θέση έως τελικό σημείο έναρξης την πέμπτη φορά το n-5 νουκλεοτίδιο από την άκρη του εκκινητή. Οι πέντε κύκλοι επαναλαμβάνονται και για τις τέσσερεις ομάδες ζευγών δινουκλεοτιδίων [60]. Αυτό είναι ένα σημαντικό πλεονέκτημα καθώς μπορούμε να κάνουμε διάκριση μεταξύ ενός λάθους της αλληλουχίας και ενός πολυμορφισμού, διότι ο πολυμορφισμός θα βρεθεί σε δύο καταγραφές ενώ ένα λάθος στην αλληλουχία αναμένεται μόνο σε μία καταγραφή (Πίνακες 1.1. και 1.2.) [61].

(26)

20

Πίνακας 1.1. Σύγκριση των μεθόδων αλληλούχισης νέας γενιάς και της αλληλούχισης Sanger.

Μέθοδος Μήκος ανάγνωσης

Ακρίβεια Αριθμός read ανά run

Χρόνος ανά run

Κόστος ανά 1 εκατ. bp Αλληλούχιση με

ημιαγωγό

μέχρι 400 bp 98% μέχρι 80 εκατ.

2 ώρες $1

Πυροαλληλούχιση 700 bp 99.9% 1 εκατ. 24 ώρες $10 Αλληλούχιση με

reversible terminators

50 - 300 bp 99.9%

(Phred30)

μέχρι 6 δις.

(TruSeq paired-end)

1-11 ημέρες

$0,05 ως

$0,15

Αλληλούχιση με ligation (SOLiD)

50+35 ή 50+50 bp

99.9% 1,2 ως 1,4 εκατ.

1 ως 2 β/δες

$0,13

Αλληλούχιση Sanger

400 - 900 bp 99.9% - 20’ ως

3 ώρες

$2.400

Πίνακας 1.2. Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των μεθόδων αλληλούχισης νέας γενιάς και της αλληλούχισης Sanger.

Μέθοδος Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Αλληλούχιση με

ημιαγωγό

Οικονομικότερος εξοπλισμός. Γρήγορη.

Λάθη σε ομοπολυμερή.

Πυροαλληλούχιση Μεγάλο μήκος

ανάγνωσης. Γρήγορη.

Υψηλό κόστος για κάθε τρέξιμο.

Λάθη σε ομοπολυμερή.

Αλληλούχιση με reversible terminators

Υψηλή απόδοση. Ακριβός εξοπλισμός. Απαιτεί υψηλές συγκεντρώσεις DNA.

Αλληλούχιση με ligation (SOLiD)

Χαμηλό κόστος ανά βάση. Πιο αργή. Δυσκολία στην αλληλούχιση παλίνδρομων περιοχών.

Αλληλούχιση Sanger

Μεγαλύτερο μήκος ανάγνωσης. Εξακολουθεί να έχει πολλές εφαρμογές.

Ακριβή και μη πρακτική για μεγάλης κλίμακας αλληλούχιση.

(27)

21 1.4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1.4.1 Προετοιμασία του δείγματος

Η επιτυχία ενός πρωτοκόλλου αλληλούχισης DNA βασίζεται στην προετοιμασία του δείγματος. Μια επιτυχής απομόνωση DNA θα δώσει δείγμα με μακριές και ακέραιες αλυσίδες για τα επόμενα βήματα που θα ακολουθήσουν, ανάλογα με την τεχνολογία που χρησιμοποιείται [62]. Στην αλληλούχιση Sanger, απαιτούνται διαδικασίες κλωνοποίησης ή PCR πριν την αλληλούχιση. Στην περίπτωση των μεθόδων αλληλούχισης νέας γενιάς απαιτείται προετοιμασία βιβλιοθήκης πριν την αλληλούχιση [63]. Με την έλευση της αλληλούχισης νέας γενιάς, οι μέθοδοι των Illumina και Roche 454 χρησιμοποιούνται ευρέως σε μελέτες μεταγραφώματος (RNA-seq). Το RNA μπορεί να απομονωθεί από ιστό και να μετατραπεί σε συμπληρωματικό DNA (cDNA) με αντίστροφη μεταγραφάση, μια DNA πολυμεράση που συνθέτει συμπληρωματικό DNA κλώνο με καλούπι ένα μόριο RNA με παρόμοιο τρόπο όπως στην κλασική PCR. Κατόπιν, το cDNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί με τον ίδιο ακριβώς τρόπο όπως το γενωμικό επιτρέποντας τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης RNA στον ιστό [64].

1.4.2 Προκλήσεις στην ανάλυση

Τεχνολογίες αλληλούχισης νέας γενιάς που περιγράφηκαν παράγουν πρωτογενή δεδομένα που απαιτούν συναρμολόγηση σε μεγαλύτερες ακολουθίες όπως ολόκληρα γονιδιώματα (sequence assembly) (Σχήμα 1.12.). Υπάρχουν αρκετές υπολογιστικές προκλήσεις για να γίνει αυτό, όπως για παράδειγμα η αξιολόγηση των πρωτογενών δεδομένων που γίνεται με προγράμματα και αλγορίθμους (Phred και Phrap) [65]. Μια άλλη πρόκληση είναι οι επαναλαμβανόμενες ακολουθίες που υπάρχουν διάσπαρτες στο γονιδίωμα. Λόγω της ύπαρξής τους κάποιες ακολουθίες δεν τοποθετούνται πάνω στα χρωμοσώματα αφήνοντας κενά [66].

(28)

22

Σχήμα 1.11. Συναρμολόγηση της ακολουθίας με βάση την αλληλεπικάλυψη των αλληλουχιών (sequencing reads).

1.5 ΜΕΛΕΤΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ

Το μεταγράφωμα ενός κυττάρου έχει δυναμική, δηλαδή αλλάζει διαρκώς. Η αλληλούχιση RNA (RNA-seq) είναι μία τεχνολογία που χρησιμοποιεί τις δυνατότητες της αλληλούχισης νέας γενιάς για να αποτυπώσει ένα στιγμιότυπο των μορίων RNA και της σχετικής τους έκφρασης μια δεδομένη χρονική στιγμή [67]. Η ραγδαία ανάπτυξη της αλληλούχισης νέας γενιάς επιτρέπει την αυξημένη κάλυψη (coverage) μιας αλληλουχίας, καθώς και την υψηλότερη απόδοση ανά δείγμα. Αυτό καθιστά εφικτή την αλληλούχιση των μορίων RNA σε ένα κύτταρο, παρέχοντας τη δυνατότητα να μελετηθούν εναλλακτικά μετάγραφα γονιδίων, μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις, συγχωνεύσεις γονιδίων, μεταλλάξεις/SNPs και αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση [68]. Επιπλέον, εκτός από mRNA μετάγραφα μπορούν να μελετηθούν και άλλοι πληθυσμοί μορίων RNA που εμπεριέχονται στο ολικό, όπως mi-RNA, tRNA και rRNA (ριβοσωμικό προφίλ). Η αλληλούχιση RNA μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί στη γονιδιακή ανάλυση για τον καθορισμό των ορίων μεταξύ εξωνίων και ιντρονίων, όπως και των 3’ και 5’ ορίων των γονιδίων. Σε πιο εξειδικευμένες περιπτώσεις η αλληλούχιση RNA χρησιμοποιείται στη μελέτη