ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ
ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ
ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ
ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ
ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ
ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ
ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΧΗΜΕΙΑΣ»
ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ «Χημική Ανάλυση - Έλεγχος Ποιότητας»
ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ
Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου HPLC για τον προσδιορισμό αμινοξέων σε φαρμακευτικό σκεύασμα βασισμένης σε προ-στήλης παραγωγοποίηση και ανίχνευση στο ορατό
Τσίκνα Διονυσία-Χρυσοβαλάντου ΧΗΜΙΚΟΣ
ΑΘΗΝΑ ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ 2018
Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου HPLC για τον προσδιορισμό αμινοξέων σε φαρμακευτικό σκεύασμα βασισμένης σε προ-στήλη παραγωγοποίηση και ανίχνευση στο ορατό
Τσίκνα Διονυσία-Χρυσοβαλάντου
Α.Μ.: 131313 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ:
Μιχαήλ Κουππάρης, Καθηγητής ΕΚΠΑ
ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ
1. Οικονόμου Αναστάσιος, καθηγητής
2. Θωμαῒδης Νικόλαος, καθηγητής
3. Μπακέας Ευάγγελος, αναπληρωτής καθηγητής
ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ: 30/10/2018
5
Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να αναπτυχθεί μία ταχεία μέθοδος υγροχρωματογραφίας αντίστροφης φάσης υψηλής απόδοσης (Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC) για τον διαχωρισμό και ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό δεκαπέντε αμινοξέων που αποτελούν ένα από τα τρία κύρια συστατικά των φαρμακευτικών σκευασμάτων παρεντερικής διατροφής. Ο διαχωρισμός τους πραγματοποιήθηκε με μια στήλη C18 και η ανίχνευσή τους βασίστηκε στην προ-στήλη παραγωγοποίηση με το αντιδραστήριο 4- διμεθυλαμινοαζωβενζολο-4’-σουλφονυλοχλωρίδιο (Dabsyl-Cl) και φασματοφωτομετρική ανίχνευση στο ορατό. Διενεργήθηκε εκτενής βελτιστοποίηση των πειραματικών παραμέτρων παραγωγοποίησης (pH, χρόνος, συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης) και για το διαχωρισμό (στήλη, κινητή φάση).
ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Αναλυτική χημεία, Φαρμακευτική ανάλυση ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: Αμινοξέα, Dabsyl-Cl, προ-στήλη παραγωγοποίηση, επικύρωση, HPLC
6
The objective of the present study was to develop a rapid Reversed phase HPLC (RP-HPLC) method for the separation and simultaneous quantitation of fifteen amino acids that consist one of the three main compartments of parenteral nutrition formulations. Their separation was carried out using a C18
column and their detection was based on precolumn derivatization with 4- dimethylaminoazobenzene-4’-sulfonylchloride (Dabsyl-Cl) and spectrophotometric detection in the visible region. An extensive optimization of derivatization parameters (pH, duration, concentration of derivatizating reagent) and separation (column, mobile phase) was conducted.
SUBJECT AREA: Analytical chemistry, Pharmaceutical analysis
KEYWORDS: Amino acids, Dabsyl-Cl, Pre-column derivatization, validation, HPLC
8
ΠΡΟΛΟΓΟΣ ... 16
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ... 17
ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 17
1.1 Γενικά για τα αμινοξέα ... 17
1.2 Οι χρήσεις τους στη βιομηχανία ... 22
1.2.1 Εντερική τεχνητή διατροφή ... 23
1.2.2 Παρεντερική τεχνητή διατροφή ... 23
1.3 Το φαρμακευτικό σκεύασμα και οι δραστικές ουσίες του ... 24
1.3.1 Φαρμακολογικές ιδιότητες ... 25
1.3.2 Φαρμακοτεχνικά στοιχεία... 26
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ... 27
ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ... 27
2.1 Ιστορική αναδρομή ... 27
2.2. Οργανολογία της υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης ... 28
2.3 Εφαρμογές της υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης ... 29
2.4. Μελλοντικές τάσεις της HPLC ... 30
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ... 31
ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ... 31
3.1 Εισαγωγή ... 31
3.2 Παραγωγοποίηση ... 33
3.2.1 Παραγωγοποίηση πριν τη στήλη ... 34
3.2.2 Παραγωγοποίηση μετά τη στήλη ... 34
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ... 38
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ... 38
9
4.2 Η ανάγκη για ανίχνευση μέσω παραγωγοποίησης ... 39
4.2.1 Τεχνικές διαχωρισμού και παραγωγοποίηση μετά τη στήλη ... 40
4.2.2 Τεχνικές διαχωρισμού και παραγωγοποίηση πριν τη στήλη ... 40
4.3 Αντιδραστήρια παραγωγοποίησης... 42
4.3.1 Παραγωγοποίηση μετά τη στήλη ... 43
4.3.2 Παραγωγοποίηση πριν τη στήλη ... 45
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ... 56
ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ... 56
5.1 Πρότυπα και αντιδραστήρια ... 56
5.2 Οργανολογία HPLC ... 56
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ... 57
ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC ΓΙΑ ΤΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΚΑΙ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΔΕΚΑΠΕΝΤΕ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ... 57
6.1 Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων των αμινοξέων ... 57
6.2 Παραγωγοποίηση ... 57
6.3 Επιλογή στήλης και εκλουστικού μέσου ... 58
6.4 Εύρεση βέλτιστων συνθηκών παραγωγοποίησης ... 68
6.4.1 Επίδραση της τιμής pH και της συγκέντρωσης του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης ... 69
6.4.2 Επίδραση του χρόνου ... 73
6.5 Βέλτιστες χρωματογραφικές συνθήκες και συνθήκες παραγωγοποίησης ... 76
6.5.1 Χρωματογραφικές συνθήκες ... 76
6.5.2 Συνθήκες παραγωγοποίησης ... 77
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ... 80
10
7.1 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗΣ ... 80
7.1.1 Ειδικότητα (Specificity) ... 80
7.1.2 Γραμμικότητα (Linearity) ... 81
7.1.3 Όριο ανίχνευσης (LOD) ... 82
7.1.4 Όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) ... 83
7.1.5 Εύρος (Range) ... 83
7.1.6 Πιστότητα (Precision) ... 83
7.1.7 Ακρίβεια (Accuracy) ... 84
7.1.8 Σταθερότητα (Stability) ... 85
7.1.9 Ανθεκτικότητα (Robustness) ... 86
7.2 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗΣ ... 87
7.2.1 Ειδικότητα ( Specificity) ... 87
7.2.2 Γραμμικότητα (Linearity) ... 88
7.2.3 Όριο ανίχνευσης (LOD) ... 118
7.2.4 Όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) ... 119
7.2.5 Πιστότητα (Precision) ... 120
7.2.6 Ακρίβεια (Accuracy) ... 122
7.2.7 Σταθερότητα (Stability) ... 123
7.2.8 Ανθεκτικότητα (Robustness) ... 125
ΠΙΝΑΚΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ... 126
ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ – ΑΡΚΤΙΚΟΛΕΞΑ – ΑΚΡΩΝΥΜΙΑ ... 128
ΑΝΑΦΟΡΕΣ ... 130
11
Σχήμα 1: Κατάσταση ιοντισμού των αμινοξέων σε σχέση με το pH ... 17
Σχήμα 2: Κατηγοριοποίηση των αμινοξέων ανάλογα με τα δομικά χαρακτηριστικά ή τις χημικές τους ιδιότητες ... 22
Σχήμα 3: Σύστημα υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης ... 29
Σχήμα 4: Αντίδραση παραγωγοποίησης με το Dansyl-Cl ... 51
Σχήμα 5: Αντίδραση παραγωγοποίησης με το Dabsyl-Cl ... 55
Σχήμα 6: %Ανακτήσεις των αμινοξέων σε συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης 1,3 mg/mL και σε διαφορετικά pH του ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικών, 100 mM ... 70
Σχήμα 7: %Ανακτήσεις των αμινοξέων σε συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης 2,6 mg/mL και σε διαφορετικά pH του ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικών, 100 mM ... 70
Σχήμα 8Α, 8Β: Εμβαδά των προτύπων αμινοξέων σε συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης 1,3 mg/mL και σε διαφορετικά pH του ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικών, 100 mM ... 71
Σχήμα 9Α, 9Β: Εμβαδά των προτύπων αμινοξέων σε συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης 2,6 mg/mL και σε διαφορετικά pH του ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικών, 100 Mm ... 72
Σχήμα 10: %Ανακτήσεις των αμινοξέων σε συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης 1,3 mg/mL και σε διαφορετικούς χρόνους παραγωγοποίησης ... 73
Σχήματα 11Α, 11Β : Εμβαδά των προτύπων αμινοξέων σε συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης 1,3 mg/mL και σε διαφορετικούς χρόνους παραγωγοποίησης ... 74 Σχήματα 12-41: Γραφικές παραστάσεις των καμπυλών βαθμονόμησης των αμινοξέων ... 89-117
13
Εικόνα 1: Χρωματογράφημα του συνθετικού σκευάσματος σε pH = 10,0, συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης 1,3 mg/mL και χρόνος παραγωγοποίησης 12 min ... 60 Εικόνα 2: Χρωματογράφημα του προτύπου μείγματος Α (σερίνη, θρεονίνη, αργινίνη, γλυκίνη, αλανίνη) ... 62 Εικόνα 3: Χρωματογράφημα του προτύπου μείγματος Β (προλίνη, βαλίνη, μεθειονίνη) ... 62 Εικόνα 4: Χρωματογράφημα του προτύπου μείγματος Γ (ισολευκίνη, λευκίνη, θρυπτοφάνη, φαινυλαλανίνη) ... 63 Εικόνα 5: Χρωματογράφημα του προτύπου μείγματος Δ (λυσίνη, ιστιδίνη, τυροσίνη) ... 63 Εικόνα 6: Σύγκριση του χρωματογραφήματος του συνολικού προτύπου μείγματος των αμινοξέων (μαύρο χρώμα) και του επιμέρους προτύπου μείγματος Δ (κόκκινο χρώμα) ... 64 Εικόνα 7: Χρωματογράφημα του αναλυόμενου φαρμακευτικού σκευάσματος με τις τελικές βέλτιστες χρωματογραφικές συνθήκες και συνθήκες παραγωγοποίησης και χρωματογραφική στήλη την BDS-Hypersil, C18, 100 mm x 4,6 mm, 3,5 μm ... 79
15
Πίνακας 1Α: Οι δομές των 20 βασικών αμινοξέων ... 19
Πίνακας 1B: Οι δομές των 20 βασικών αμινοξέων ... 20
Πίνακας 1Γ: Οι δομές των 20 βασικών αμινοξέων ... 21
Πίνακας 2: Στάδια προκατεργασίας δείγματος ... 32
Πίνακας 3: Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της παραγωγοποίησης πριν τη στήλη ... 36
Πίνακας 4: Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της παραγωγοποίησης μετά τη στήλη ... 37
Πίνακας 5: Τύποι χρωματογραφικών στηλών που χρησιμοποιήθηκαν κατά την ανάπτυξη της μεθόδου... 59
Πίνακας 6: %Ανακτήσεις από το συνολικό μικτό πρότυπο μείγμα των αμινοξέων με βάση τα επιμέρους μικτά πρότυπα μείγματα ... 65
Πίνακας 7: Επίδραση pH στο διαχωρισμό ... 66
Πίνακας 8: Επίδραση σύστασης κινητής φάσης στο διαχωρισμό ... 67
Πίνακας 9: Επίδραση συγκέντρωσης ρυθμιστικού στο διαχωρισμό ... 68
Πίνακας 10: %Ανακτήσεις τριών αμινοξέων από το πρότυπο μείγμα όλων των αμινοξέων με βάση τα εμβαδά στο επιμέρους πρότυπο μείγμα Δ σε διαφορετικές συνθήκες ... 76
Πίνακας 11: Βέλτιστο πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης ... 77
Πίνακας 12: Διαλύματα παρακαταθήκης των αμινοξέων ... 81
Πίνακας 13-27: Αποτελέσματα γραμμικότητας των αμινοξέων ... 88-116 Πίνακας 28: Αποτελέσματα LOD των αμινοξέων ... 118
Πίνακας 29: Αποτελέσματα LOQ των αμινοξέων ... 119
Πίνακας 30: Αποτελέσματα πιστότητας της σερίνης ... 120
Πίνακας 31: Αποτελέσματα πιστότητας των αμινοξέων ... 121
Πίνακας 32: Αποτελέσματα ακρίβειας της σερίνης ... 122
Πίνακας 33: Αποτελέσματα ακρίβειας των αμινοξέων ... 123
Πίνακας 34: Αποτελέσματα σταθερότητας ... 124
Πίνακας 35: Αποτελέσματα σταθερότητας του διαλύματος της μεθειονίνης . 125 Πίνακας 36: Πίνακας ορολογίας με τις αντιστοιχίσεις των ελληνικών και ξενόγλωσσων όρων... 126
Πίνακας 37: Ακρωνύμια και ανάπτυξή τους ... 128
16
ΠΡΟΛΟΓΟΣ
Η διπλωματική εργασία «Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου για τον προσδιορισμό αμινοξέων σε φαρμακευτικό σκεύασμα βασισμένης σε προ- στήλη παραγωγοποίηση και ανίχνευση στο ορατό» διεκπεραιώθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας κατά το ακαδημαϊκό έτος 2014-2015 υπό την επίβλεψη του καθηγητή του τμήματος, κ. Μιχαήλ Α. Κουππάρη.
Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα για το αμείωτο ενδιαφέρον του, την πολύτιμη καθοδήγηση και την αμέριστη υποστήριξη καθ’
όλη τη διάρκεια πραγματοποίησης της παρούσας διπλωματικής εργασίας.
Στην Αικατερίνη Γκρεμιλογιάννη, στον Νικόλαο Μέγκουλα και στη Δήμητρα Σταυροπούλου εκφράζω τις θερμές ευχαριστίες μου για τις συμβουλές, την παρακολούθηση της πορείας της εργασίας, τις εύστοχες υποδείξεις και συμβουλές τους καθώς και την ηθική συμπαράσταση τους σ’ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της εργασίας.
Ευχαριστώ επίσης τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής για το χρόνο που διέθεσαν για τη μελέτη και εξέταση της εργασίας.
17
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ
1.1 Γενικά για τα αμινοξέα
Τα αμινοξέα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο, τόσο ως δομικοί λίθοι των πρωτεϊνών, όσο και ως ενδιάμεσες ενώσεις στο μεταβολισμό. Πρόκειται για οργανικές ενώσεις που περιέχουν τουλάχιστον μια καρβοξυλομάδα και μια αμινομάδα μαζί με μια χαρακτηριστική πλευρική αλυσίδα η οποία καθορίζει τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες. Στη φύση 20 αμινοξέα συμμετέχουν στη σύνθεση των πρωτεϊνών τα οποία είναι όλα α-αμινοκαρβονικά οξέα, δηλαδή το α-άτομο άνθρακα στο μόριο φέρει μια αμινομάδα και μια καρβοξυλομάδα και αποκαλούνται "πρωτεϊνικά αμινοξέα". Βρίσκονται ως L-ισομερή και είναι οπτικώς ενεργά μόρια. Τα 10 από τα 20 πρωτεϊνικά αμινοξέα (αργινίνη, θρεονίνη, βαλίνη, λευκίνη, ισολευκίνη, μεθειονίνη, λυσίνη, θρυπτοφάνη, φαινυλαλανίνη και ιστιδίνη) δεν μπορούν να συντεθούν από τον ανθρώπινο οργανισμό και γι’ αυτό ονομάζονται απαραίτητα αμινοξέα [1].
Τα αμινοξέα συμπεριφέρονται σα δίπολα ιόντα (που ονομάζονται και αμφοτερικά ιόντα) σε διάλυμα που έχει ουδέτερο pH λόγω της ενδομοριακής οξεοβασικής αντίδρασης που υφίστανται. Πρόκειται για ένα είδος
"εσωτερικών" αλάτων και ως εκ τούτου εμφανίζουν πολλές από τις φυσικές ιδιότητες των αλάτων, όπως για παράδειγμα έχουν μεγάλες διπολικές ροπές, είναι διαλυτά στο νερό, αλλά αδιάλυτα στους υδρογονάνθρακες και έχουν υψηλά σημεία τήξεως. Τα αμινοξέα, ως αμφοτερίζουσες ενώσεις, αντιδρούν είτε ως οξέα, είτε ως βάσεις ανάλογα με τις συνθήκες. Σε όξινα διαλύματα, ένα αμφοτερικό αμινοξύ γίνεται δέκτης ενός πρωτονίου προς σχηματισμό κατιόντος, ενώ αντίθετα, σε αλκαλικά διαλύματα αποβάλλει ένα πρωτόνιο, οπότε σχηματίζεται ένα ανιόν όπως φαίνεται και στο σχήμα 1 [1].
H3NCHCOH R O
H3NCHCO H2NCHCO
R O R O
H3O+ OH-
+ +
Σχήμα 1: Κατάσταση ιοντισμού των αμινοξέων σε σχέση με το pH
18
Τα 20 συνήθη αμινοξέα μπορούν να ταξινομηθούν με πολλούς τρόπους [2]:
a. Με βάση τον αριθμό των αμινομάδων-καρβοξυλομάδων (μονοαμινο- μονοκαρβονικά, μονοαμινο-διακαρβονικά, διαμινο-μονοκαρβονικά).
b. Με βάση τη χημική δομή της πλευρικής αλυσίδας (αλειφατικά, ετεροκυκλικά, αρωματικά).
c. Με βάση την πολικότητα-ιοντική κατάσταση της πλευρικής αλυσίδας σε φυσιολογικές τιμές pH (6-7).
Ο τελευταίος τρόπος, που αποτελεί και την πιο επιτυχή κατάταξη των πρωτεϊνικών αμινοξέων, περιλαμβάνει τέσσερις ομάδες, όπως φαίνεται στον πίνακα 1 [2,3,4]:
Μη πολικά αμινοξέα (υδρόφοβα αμινοξέα)
Πολικά –μη ιονιζόμενα (υδρόφιλα αμινοξέα)
Πολικά-ιονιζόμενα (υδρόφιλα αμινοξέα)
Επιπλέον, στο σχήμα 2 γίνεται μια προσπάθεια σχηματικής απεικόνισης των κατηγοριών στις οποίες ανήκει κάθε αμινοξύ ανάλογα με την υδροφοβικότητα, το μέγεθος, το φορτίο, την παρουσία θείου, υδροξυλικής ομάδας ή αρωματικού δακτυλίου στο μόριο τους.
19
Πίνακας 1Α: Οι δομές των 20 βασικών αμινοξέων
Μη πολικά αμινοξέα
Ονομασία Δομή pKa1
α-COOH
pKa2 α-NH3+
Γλυκίνη 2,35 9,78
Αλανίνη 2,35 9,87
Βαλίνη 2,29 9,74
Μεθειονίνη 2,13 9,28
Λευκίνη 2,33 9,74
Θρυπτοφάνη 2,46 9,41
Φαινυλαλανίνη 2,20 9,31
Προλίνη 1,95 10,64
Ισολευκίνη 2,32 9,76
20
Πίνακας 1Β: Οι δομές των 20 βασικών αμινοξέων
Πολικά αμινοξέα
Ονομασία Δομή pKa1
α-COOH
pKa2 α-NH3+
pKa3 πλευρικής
αλυσίδας
Σερίνη 2,19 9,21 -
Θρεονίνη 2,09 9,10 -
Κυστεῒνη 1,92 10,70 8,37
Τυροσίνη 2,20 9,21 10,46
Ασπαραγίνη 2,14 8,72 -
Γλουταμίνη 2,17 9,13 -
21
Πίνακας 1Γ: Οι δομές των 20 βασικών αμινοξέων
Βασικά φορτισμένα
Ονομασία Δομή pKa1
α-COOH
pKa2 α-NH3+
pKa3 πλευρικής
αλυσίδας
Λυσίνη 2,16 9,06 10,54
Αργινίνη 1,82 8,99 12,48
Ιστιδίνη 1,80 9,33 6,04
Όξινα φορτισμένα
Ονομασία Δομή pKa1
α-COOH
pKa2 α-NH3+
pKa3 πλευρικής
αλυσίδας Ασπαρτικό
οξύ 1,99 9,90 3,90
Γλουταμικό
οξύ 2,10 9,47 4,07
22
Σχήμα 2: Κατηγοριοποίηση των αμινοξέων ανάλογα με τα δομικά χαρακτηριστικά ή τις χημικές τους ιδιότητες
1.2 Οι χρήσεις τους στη βιομηχανία
Τα αμινοξέα χρησιμοποιούνται κυρίως στη βιομηχανία τροφίμων ως πρόσθετα των ζωοτροφών, λόγω των χαμηλών επιπέδων ή της έλλειψης βασικών αμινοξέων (λυσίνη, μεθειονίνη και θρεονίνη) και ως ενισχυτικά γεύσης (ασπαρτικό οξύ, όξινο γλουταμινικό νάτριο, σερίνη). Επιπλέον, χρησιμοποιούνται στα λιπάσματα για να διευκολύνουν τη μεταφορά των ιχνοστοιχείων στα φυτά, λόγω της δυνατότητάς τους να συμπλοκοποιούνται με αυτά [4].
Σε πολύ μικρότερο ποσοστό χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία των φαρμάκων και στα καλλυντικά. Συγκεκριμένα, στα φαρμακευτικά προϊόντα χρησιμοποιούνται για την παροχή τεχνητής διατροφικής υποστήριξης, για ασθένειες του ήπατος, για τη θεραπεία της καρδιακής ανεπάρκειας, για το πεπτικό έλκος και για τη στειρότητα των αντρών [4].
Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε ανάπτυξη και επικύρωση για τον προσδιορισμό αμινοξέων σε φαρμακευτικό σκεύασμα για την παροχή τεχνητής διατροφικής υποστήριξης. Η τεχνητή διατροφική υποστήριξη
23
περιλαμβάνει τη βελτίωση/εμπλουτισμό των παρεχόμενων γευμάτων, την εντερική και την παρεντερική διατροφή.
1.2.1 Εντερική τεχνητή διατροφή
Ο όρος εντερική διατροφή αφορά κάθε διατροφικό σκεύασμα που χορηγείται για ειδικούς ιατρικούς σκοπούς και περιλαμβάνει τα σκευάσματα που χορηγούνται μέσω της γαστρεντερικής οδού με διαρρινικούς ή διαδερμικούς καθετήρες, αλλά και από το στόμα όταν λαμβάνονται συμπληρώματα διατροφής.
Η εντερική διατροφή αποτελεί τη πρώτη μορφή τεχνητής διατροφής που εφαρμόσθηκε. Χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά στην εποχή των αρχαίων Αιγυπτίων και του Ιπποκράτη, όπου τα θρεπτικά συστατικά χορηγούνταν με ειδικές συσκευές στο ορθό, υπό μορφή διακλυσμού. Η μέθοδος αυτή, με αρκετές βελτιώσεις έφθασε να εφαρμόζεται μέχρι τον Β’ παγκόσμιο πόλεμο.
Παρ’ όλα αυτά η εντερική τεχνητή διατροφή δεν είχε ευρεία διάδοση και αποδοχή, αρχικά κυρίως για λόγους πρακτικούς, καθώς δεν ήταν δυνατόν να εφαρμοσθεί επί μακρόν και να καλύψει τις θερμιδικές ανάγκες του αρρώστου, και στη συνέχεια, λόγω του ενθουσιασμού που περιέβαλλε την παρεντερική διατροφή, όταν άρχισε να διαδίδεται ευρέως και να εφαρμόζεται κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του ΄60 [5].
1.2.2 Παρεντερική τεχνητή διατροφή
Ως παρεντερική διατροφή καλείται η σίτιση του ασθενή μέσω ενδοφλέβιας έγχυσης από κεντρική ή περιφερειακή φλέβα, όταν η από του στόματος ή η εντερική σίτιση είναι αδύνατη, ανεπαρκής ή αντενδείκνυται. Κατά την παρεντερική χορήγηση χορηγούνται ενδοφλεβίως μίγματα υδατανθράκων, αμινοξέων και λίπους, σε συνδυασμό με βιταμίνες, ιχνοστοιχεία και ηλεκτρολύτες. Η μέθοδος που επικράτησε είναι η ανάμιξη όλων των συστατικών σε έναν περιέκτη.
24
Η πρώτη απόπειρα παρεντερικής σίτισης έγινε το 1656 από τον Wren ο οποίος χορήγησε αλκοόλη πειραματικά σε σκύλους, ενώ σε άρρωστο έγινε μόλις το 1911 από τον Κausch με διάλυμα γλυκόζης, και ακολούθησε η χορήγηση αμινοξέων το 1939 από τον Elman. Τα προβλήματα στην εφαρμογή της παρεντερικής διατροφής την εποχή εκείνη ήταν δύο: ο μεγάλος όγκος των διαλυμάτων που οδηγούσε συχνά σε πνευμονικό οίδημα και οι θρομβώσεις που προκαλούσε η περιφερειακή χορήγηση γλυκόζης 15%. Η ευρεία διάδοση της παρεντερικής διατροφής έγινε κατά τη δεκαετία του 60, όταν τα παραπάνω προβλήματα αντιμετωπίστηκαν με την παρασκευή του πρώτου διαλύματος λίπους από τη σουηδική εταιρεία Kabi το 1961 και με τον καθετηριασμό και τη χρήση κεντρικών φλεβών.
Για πολλά χρόνια η παρεντερική διατροφή ήταν συνώνυμη της τεχνητής διατροφής και αποτελούσε την κύρια επιλογή ανεξάρτητα αν λειτουργούσε ή όχι το γαστρεντερικό σύστημα. Σήμερα που η εντερική διατροφή έχει πάρει τη θέση που της αρμόζει, η εφαρμογή της παρεντερικής διατροφής περιορίζεται στις περιπτώσεις εκείνες που η χρησιμοποίηση του γαστρεντερικού αυλού είναι αδύνατη ή αντενδείκνυται. Αυτό συμβαίνει γιατί η εντερική σίτιση έχει χαμηλότερο κίνδυνο λοίμωξης και μικρότερη πιθανότητα εμφάνισης τεχνικών και μεταβολικών επιπλοκών σε σχέση με την παρεντερική σίτιση [5].
1.3 Το φαρμακευτικό σκεύασμα και οι δραστικές ουσίες του
Το σκεύασμα για το οποίο αναπτύχθηκε η μέθοδος προορίζεται για παρεντερική σίτιση σε ενήλικες και παιδιά μεγαλύτερα των 2 ετών, όταν η από του στόματος ή η εντερική σίτιση είναι αδύνατη, ανεπαρκής ή αντενδείκνυται.
Διατίθεται σε σάκο τριών θαλάμων οι οποίοι αποτελούνται από γαλάκτωμα λιπιδίων, διάλυμα αμινοξέων και διάλυμα γλυκόζης. Το γαλάκτωμα λιπιδίων αποτελείται από μίγμα ραφιναρισμένου ελαιόλαδου και σογιέλαιου σε αναλογία 4:1 και είναι ένα ομοιογενές υγρό με γαλακτώδη εμφάνιση. Το διάλυμα των αμινοξέων αποτελείται από 15 L-αμινοξέα, συμπεριλαμβανομένων και των 9 απαραίτητων αμινοξέων τα οποία είναι απολύτως αναγκαία για τη σύνθεση πρωτεϊνών. Όσον αφορά το διάλυμα της γλυκόζης αποτελείται από μονοένυδρη γλυκόζη. Τα δύο τελευταία διαλύματα
25
είναι διαυγή και άχρωμα ή ελαφρώς κίτρινα. Μετά την ανασύσταση το φαρμακευτικό σκεύασμα είναι ένα ομοιογενές υγρό με γαλακτώδη εμφάνιση.
Το προϊόν αυτό περιέχει ηλεκτρολύτες, αλλά δεν περιέχει βιταμίνες και ιχνοστοιχεία. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως έχει ή μετά από εμπλουτισμό στο ανασυσταμένο μείγμα με ηλεκτρολύτες, ιχνοστοιχεία, βιταμίνες και φωσφορικά άλατα, όταν απαιτούνται, εκτός από την περίπτωση των βιταμινών που μπορούν να προστεθούν και στο θάλαμο της γλυκόζης. Μετά την προσθήκη θα πρέπει να ξαναμετρηθεί η ωσμωτικότητα, ώστε να καθοριστεί αν θα γίνει η χορήγηση μέσω κεντρικής ή περιφερειακής φλέβας, καθώς η χορήγηση ενός υπέρτονου γαλακτώματος μέσω περιφερειακής φλέβας μπορεί να προκαλέσει τον ερεθισμό της [6].
1.3.1 Φαρμακολογικές ιδιότητες 1.3.1.1 Φαρμακοδυναμικές ιδιότητες
Πρόκειται για ένα τριμερές μείγμα που επιτρέπει τη διατήρηση του ισοζυγίου αζώτου/ενέργειας με πηγή αζώτου τα L-αμινοξέα και ενέργεια με τη μορφή της γλυκόζης και των απαραίτητων λιπαρών οξέων.
Το προφίλ των αμινοξέων έχει ως εξής:
-απαραίτητα αμινοξέα / ολικά αμινοξέα : 40,5%
-απαραίτητα αμινοξέα (g)/ ολικό άζωτο (g): 2,5
-αμινοξέα με διακλαδισμένη πλευρική αλυσίδα / ολικά αμινοξέα: 19%
H πηγή υδατανθράκων είναι η γλυκόζη με περιεκτικότητα 80 g/l
Το γαλάκτωμα λιπιδίων είναι ένας συνδυασμός ραφιναρισμένου ελαιόλαδου και σογιέλαιου σε αναλογία 4:1 με την ακόλουθη κατά προσέγγιση κατανομή λιπαρών οξέων:
-15% κορεσμένα λιπαρά οξέα (SFA) -65% μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (MUFA) -20% πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFA)
Ο λόγος των φωσφολιπιδίων / τριγλυκεριδίων είναι 0,06 [6].
26 1.3.1.2 Φαρμακοκινητικές ιδιότητες
Τα συστατικά του γαλακτώματος για ενδοφλέβια έγχυση (αμινοξέα, ηλεκτρολύτες, γλυκόζη, λιπίδια) κατανέμονται, μεταβολίζονται και αποβάλλονται κατά τον ίδιο τρόπο, όπως εάν είχαν χορηγηθεί μεμονωμένα.
Οι φαρμακοκινητικές ιδιότητες των αμινοξέων χορηγουμένων ενδοφλεβίως είναι κατά κύριο λόγο, ίδιες με αυτές των αμινοξέων που παρέχονται με την από του στόματος σίτιση. Ωστόσο, τα αμινοξέα που προέρχονται από τις πρωτεΐνες των τροφών περνούν πρώτα από την πυλαία φλέβα πριν φθάσουν στη συστηματική κυκλοφορία.
Η ταχύτητα απορρόφησης των λιπιδικών γαλακτωμάτων εξαρτάται από το μέγεθος των σωματιδίων. Το μέγεθος των λιπιδικών σωματιδίων του γαλακτώματος που περιέχονται στο σκεύασμα, είναι παρόμοιο με αυτό των χυλομικρών και έτσι, το γαλάκτωμα αυτό διαθέτει παρόμοια ταχύτητα απορρόφησης [6].
1.3.2 Φαρμακοτεχνικά στοιχεία
1.3.2.1 Κατάλογος με τα έκδοχα / ηλεκτρολύτες [6]
Θάλαμος γαλακτώματος λιπιδίων
Έκδοχα: λεκιθίνη αυγού, γλυκερόλη, ελαϊκό νάτριο, υδροξείδιο του νατρίου και ύδωρ για ενέσιμα
Θάλαμος διαλύματος αμινοξέων
Έκδοχα: οξεικό οξύ και ύδωρ για ενέσιμα
Ηλεκτρολύτες: χλωριούχο κάλιο, εξαϋδρικό χλωριούχο μαγνήσιο και γλυκεροφωσφορικό νάτριο
Θάλαμος διαλύματος γλυκόζης
Έκδοχα: υδροχλωρικό οξύ και ύδωρ για ενέσιμα Ηλεκτρολύτες: Χλωριούχο κάλιο
27
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2
ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ
2.1 Ιστορική αναδρομή
Οι πρώτες εμπορικά διαθέσιμες, χρωματογραφικές μέθοδοι εμφανίστηκαν στη δεκαετία του 1970. Η Χρωματογραφία Ανοιχτής Στήλης, η Χρωματογραφία Χάρτου και η Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας αποτέλεσαν τις πρώτες χρωματογραφικές τεχνικές επιτυγχάνοντας αρχικά ένα σημαντικό αριθμό χρωματογραφικών διαχωρισμών. Ωστόσο, παρουσίασαν μια σειρά από σημαντικά μειονεκτήματα, με βασικότερο την ανεπάρκειά τους για τον προσδιορισμό ορισμένων ενώσεων και το διαχωρισμό παρόμοιων συστατικών. Το γεγονός αυτό συνετέλεσε στην ανάπτυξη της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (High Performance Liquid Chormatography, HPLC) με την οποία επιτυγχάνονται μικρότεροι χρόνοι ανάλυσης.
Η HPLC αναπτύχθηκε στα μέσα της δεκαετίας του 1970 και αποτελεί εξέλιξη της κλασικής υγροχρωματογραφίας με τη διαφορά ότι χρησιμοποιούνται μικρόκοκκα υλικά πλήρωσης στις στήλες, οπότε και αναπτύσσονται μεγάλες πιέσεις. Στο τέλος της δεκαετίας αναπτύχθηκε και η Υγρoρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης Aντίστροφης Φάσης (Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC), η οποία έλυσε ολοκληρωτικά το πρόβλημα διαχωρισμού παρόμοιων ενώσεων. Στη συνέχεια, ακολούθησε η ανάπτυξη της τεχνολογίας στον τομέα των ανιχνευτών και η προσαρμογή τους στην HPLC. Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι:
φασματοφωτόμετρα, ανιχνευτές παράταξης φωτοδιόδων, φθορισμομετρικοί ανιχνευτές, αγωγιμομετρικοί ανιχνευτές και άλλοι.
Η HPLC είναι η πιο διαδεδομένη απ’ όλες τις αναλυτικές τεχνικές διαχωρισμού, με ετήσιες πωλήσεις σε όργανα HPLC που φθάνουν τα δισεκατομμύρια δολλάρια. Οι κύριοι λόγοι για την τόσο ευρεία αποδοχή της είναι η ευαισθησία της, η εύκολη προσαρμογή της σε ακριβείς ποσοτικούς προσδιορισμούς, η καταλληλότητα της για διαχωρισμούς μη πτητικών ή θερμικά ευαίσθητων συστατικών και κυρίως η εφαρμοσιμότητά της σε
28
προσδιορισμούς ουσιών πρωτίστου ενδιαφέροντος για τη βιομηχανία, το δημόσιο και πολλά άλλα επιστημονικά πεδία [7].
Θεωρήθηκε σκόπιμο να μην γίνει ιδιαίτερη επέκταση στη θεωρία των χρωματογραφικών τεχνικών και της επικύρωσης μιας και κάτι τέτοιο έχει ήδη λάβει χώρα σε πληθώρα μεταπτυχιακών και διδακτορικών διατριβών. Στη συνέχεια ακολουθεί μια επιγραμματική αναφορά στην οργανολογία της HPLC, στις πρόσφατες εφαρμογές της καθώς και στις μελλοντικές της τάσεις.
2.2. Οργανολογία της υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης
Ένα τυπικό σύστημα ΗPLC αποτελείται από τα εξής μέρη, (σχήμα 3): α) τις φιάλες αποθήκευσης διαλυτών, β) την αντλία υψηλής πίεσης, γ) το σύστημα εισαγωγής δείγματος, δ) τη χρωματογραφική στήλη, ε) τον ανιχνευτή και στ) τη μονάδα επεξεργασίας και καταγραφής των δεδομένων [8]. Επιπλέον μπορούν να προστεθούν και άλλα τμήματα βελτιώνοντας την απόδοση της τεχνικής, όπως:
• Το σύστημα εισαγωγής του δείγματος μπορεί να αποτελείται από βαλβίδα σταθερού όγκου για έγχυση του δείγματος ή από αυτόματο δειγματολήπτη.
• Η χρωματογραφική στήλη μπορεί να βρίσκεται σε ειδικό θερμοστατούμενο φούρνο, εξασφαλίζοντας μεγαλύτερη επαναληψιμότητα στις μετρήσεις.
• Στον πρώτο ανιχνευτή μπορεί να συνδεθεί σε σειρά και δεύτερος ανιχνευτής.
• Δεύτερη χρωματογραφική στήλη μπορεί να συνδεθεί σε σειρά, ώστε να επιτευχθεί καλύτερος διαχωρισμός, ενώ με μια προστήλη αμέσως πριν τη χρωματογραφική στήλη αυξάνεται ο χρόνος ζωής της τελευταίας.
• Επίσης συνδέοντας μια δεύτερη αντλία μαζί με ένα κατάλληλο σύστημα ανάμιξης διαλυτών επιτρέπεται η επίτευξη αναλύσεων βαθμιδωτής έκλουσης.
29
Σχήμα 3: Σύστημα υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης
Η διεργασία του χρωματογραφικού διαχωρισμού αρχίζει με την εισαγωγή του δείγματος στη στήλη με τη βοήθεια ειδικής βαλβίδας. Ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος επιτυγχάνεται στην αναλυτική στήλη, ενώ η διοχέτευση της κινητής φάσης επιτυγχάνεται με τη χρήση αντλίας υψηλής πίεσης διαμέσου του μικρόκοκκου υλικού πλήρωσης. Καθένα από τα συστατικά του δείγματος εκλούεται και εμφανίζεται ως κορυφή στο σύστημα καταγραφής και αποτελεί το χρωματογράφημα του διαχωρισμού, ενώ η αποθήκευση των υπόλοιπων αναλυτικών δεδομένων γίνεται στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. Η ανίχνευση των εκλουόμενων συστατικών αποτελεί μια πολύ σημαντική παράμετρο και μπορεί να είναι είτε εκλεκτική, είτε όχι, ανάλογα με τον χρησιμοποιούμενο ανιχνευτή.
2.3 Εφαρμογές της υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης
Η ανάπτυξη της τεχνολογίας στον τομέα των ανιχνευτών σε συνδυασμό με τη συστηματική βελτίωση της οργανολογίας της υγροχρωματογραφίας, η οποία γίνεται μικρότερη, ταχύτερη και πιο αυτοματοποιημένη διευρύνει συνεχώς το πεδίο εφαρμογών της HPLC. Έτσι, τομείς όπως η βιοτεχνολογία, η φαρμακευτική βιομηχανία, η βιοϊατρική και η βιοχημική έρευνα που αποτελούσαν το κύριο πεδίο εφαρμογών της ΗPLC, αποτελούν πλέον μόλις το 50% των συνολικών εφαρμογών της. Τα τελευταία χρόνια έχει επεκταθεί
30
και σε άλλους τομείς, όπως το περιβάλλον, τη βιομηχανία καλλυντικών, τη βιομηχανία τροφίμων και τη βιομηχανία ενέργειας.
2.4. Μελλοντικές τάσεις της HPLC
Η ανάπτυξη της τεχνολογίας σχετικά με την πρόοδο της HPLC επικεντρώνεται κυρίως στους παρακάτω τομείς:
• Νανοτεχνολογία: Οι περισσότερες βιομηχανίες οι οποίες ασχολούνται με την HPLC (Waters, Thermo Finnigan, Upchurch) εστιάζουν την προσοχή τους στην ανάπτυξη της νανοτεχνολογίας, όσον αφορά συστήματα και όργανα της υγροχρωματογραφίας, τα οποία συνήθως συνδυάζονται με φασματόμετρο μαζών.
• Πολλαπλά ταυτόχρονα συστήματα: παρατηρείται πλέον η ανάπτυξη πολλαπλών συστημάτων υγροχρωματογραφίας ταυτόχρονα και παράλληλα με στόχο την αύξηση της αναλυτικής ικανότητας. Όσον αφορά το στάδιο της προκατεργασίας, δοκιμάζεται και εκεί ο συνδυασμός διαφόρων τεχνικών, από ηλεκτροφόρηση μέχρι υπερκρίσιμη εκχύλιση υγρής φάσης σε σειρά, με στόχο τη βελτιστοποίηση του ζητούμενου διαχωρισμού.
• Αύξηση της θερμοκρασίας: Όπως έχει παρατηρηθεί η αύξηση της θερμοκρασίας μπορεί να μειώσει ουσιαστικά τους χρόνους ανάλυσης αντικαθιστώντας ακόμα και τη βαθμιδωτή έκλουση, ενώ επιτρέπει τη χρήση στενότερων και βραχύτερων στηλών. Επιπλέον, καθιστά εφικτό το συνδυασμό της HPLC με την υπερκρίσιμη ρευστή εκχύλιση.
• Νέες στήλες: Νέες στατικές φάσεις αναπτύσσονται με στόχο την αύξηση της εκλεκτικότητας. Οι κύριες τάσεις είναι οι ρυθμιζόμενες στατικές φάσεις, οι πολυμερικές φάσεις μοριακής αποτύπωσης, οι νέες μορφές μονολιθικών πυριτικών στηλών, καθώς και η χρήση νέων βασικών υλικών.
31
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3
ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ
3.1 Εισαγωγή
Η προκατεργασία των δειγμάτων αποτελεί το πιο βασικό και χρονοβόρο στάδιο της ανάλυσης, ανεξάρτητα από την αναλυτική τεχνική που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί. Ειδικά στην περίπτωση της ανάλυσης με HPLC, η προκατεργασία του δείγματος συμβάλλει στην εξασφάλιση αντιπροσωπευτικών και επαναλήψιμων διαλυμάτων, κατάλληλων για έγχυση στη στήλη. Τα στάδια προκατεργασίας, που εφαρμόζονται κατά περίπτωση, εξαρτώνται από το δείγμα, το υπόστρωμα και το επίπεδο συγκέντρωσης, στο οποίο λαμβάνει χώρα η ανάλυση. Γενικά η σωστή και αποτελεσματική προκατεργασία ενός δείγματος έχει ως στόχο:
1. Τον καθαρισμό του προς ανάλυση δείγματος από τυχόν παρεμποδίσεις του υποστρώματος.
2. Την επαναλήψιμη απομόνωση, ποσοτική παραλαβή και προσυγκέντρωση των προς προσδιορισμό συστατικών του δείγματος.
3. Την παραλαβή του δείγματος σε μορφή συμβατή με την εφαρμοζόμενη μέθοδο ανάλυσης και το σύστημα ανίχνευσης.
4. Την παραγωγοποίηση του δείγματος, όποτε χρειάζεται, για βελτίωση του διαχωρισμού και/ή της ανίχνευσης των προσδιοριζόμενων ενώσεων.
Η διαδικασία της προκατεργασίας των δειγμάτων πρέπει να δίνει ποσοτικές και επαναλήψιμες ανακτήσεις των προσδιοριζόμενων συστατικών του δείγματος, να περιλαμβάνει το μικρότερο δυνατό αριθμό σταδίων, να μην καταστρέφει το δείγμα, να είναι εκλεκτική όσον αφορά στις ενώσεις που ενδιαφέρουν την ανάλυση, να χρησιμοποιεί τη μικρότερη δυνατή ποσότητα του αναλύτη και, αν είναι δυνατόν, να αυτοματοποιείται. Στον πίνακα 2 δίνονται τα στάδια που συνήθως ακολουθούνται στην προκατεργασία ενός δείγματος και στην επόμενη ενότητα αναπτύσσεται η τεχνική της παραγωγοποίησης [9].
32
Πίνακας 2: Στάδια προκατεργασίας δείγματος
Στάδια προκατεργασίας Παρατηρήσεις
1. Συλλογή δείγματος Εξασφάλιση αντιπροσωπευτικού δείγματος χρησιμοποιώντας στατιστικά βασιζόμενες μεθόδους
2. Αποθήκευση και συντήρηση Χρήση κατάλληλων κλειστών δοχείων και κατάλληλων συνθηκών συντήρησης, π.χ.
ψύξη, αδρανής ατμόσφαιρα κλπ.
3. Προκαταρκτική προκατεργασία Λυοφιλίωση, εξάτμιση, αραίωση, αποπρωτεΐνωση, κλπ., ώστε το δείγμα να είναι σε κατάλληλη μορφή για περαιτέρω κατεργασία.
4. Ζύγιση και διάλυση Λήψη κατάλληλων προφυλάξεων για ευαίσθητα δείγματα, χρησιμοποίηση βαθμονομημένων οργάνων.
5. Απομάκρυνση αιωρούμενων σωματιδίων
Διήθηση, φυγοκέντρηση.
6. Εκχύλιση (υγρού-υγρού, στερεάς φάσης-υγρού, κτλ)
Επιτυγχάνεται απομόνωση και προσυγκέντρωση των προσδιοριζόμενων ενώσεων σε στερεά και υγρά δείγματα.
7. Παραγωγοποίηση Επιφέρει βελτίωση των ιδιοτήτων ανίχνευσης ή επιθυμητή αλλαγή του χρόνου συγκράτησης στη στήλη.
33 3.2 Παραγωγοποίηση
Η παραγωγοποίηση (derivatization) αποτελεί μια ειδική περίπτωση οργανικών αντιδράσεων, που χρησιμοποιούνται με σκοπό τη μεταβολή κάποιων χημικών και φυσικών ιδιοτήτων της προσδιοριζόμενης ένωσης. Οι τέσσερις κύριοι λόγοι της παραγωγοποίησης στην HPLC είναι:
1. Βελτίωση των ιδιοτήτων ανίχνευσης με την εισαγωγή χρωμοφόρας ή φθορίζουσας ομάδας στο μόριο της ένωσης. Χρησιμοποιείται για ενώσεις που δεν ανιχνεύονται στην αρχική τους μορφή, αλλά και για ενώσεις που η μέθοδος ανίχνευσης τους δεν είναι αρκετά ευαίσθητη, οδηγώντας έτσι σε χαμηλότερα όρια ανίχνευσης.
2. Αλλαγή της μοριακής δομής ή της πολικότητας της προσδιοριζόμενης ένωσης με αποτέλεσμα τη βελτίωση της χρωματογραφικής συμπεριφοράς και τον καλύτερο χρωματογραφικό διαχωρισμό δομικά συγγενών ενώσεων.
3. Μεταβολή του υποστρώματος για καλύτερο χρωματογραφικό διαχωρισμό.
4.Σταθεροποίηση των ασταθών προσδιοριζόμενων ενώσεων.
Το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης επιλέγεται έτσι, ώστε να αντιδρά ποσοτικά και εκλεκτικά με μια λειτουργική ομάδα της προσδιοριζόμενης ένωσης σχηματίζοντας ένα σταθερό προϊόν με όσο το δυνατόν μικρότερο αριθμό παραπροϊόντων. Η αντίδραση παραγωγοποίησης πρέπει να είναι ταχεία και ποσοτική κάτω από σχετικά ήπιες συνθήκες. Τα παραπροϊόντα και η περίσσεια του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης δεν πρέπει να ανιχνεύονται ή πρέπει να διαχωρίζονται ικανοποιητικά από την προσδιοριζόμενη ένωση.
Οι αντιδράσεις παραγωγοποίησης που έχουν ως στόχο τη βελτίωση της χρωματογραφικής συμπεριφοράς των προσδιοριζόμενων ενώσεων λαμβάνουν χώρα πριν το χρωματογραφικό διαχωρισμό (παραγωγοποίηση πριν από τη στήλη). Αντίθετα, όταν οι αντιδράσεις παραγωγοποίησης έχουν ως στόχο τη βελτίωση της ευαισθησίας και/ή της εκλεκτικότητας μπορούν να πραγματοποιηθούν πριν ή μετά το χρωματογραφικό διαχωρισμό (παραγωγοποίηση μετά τη στήλη) [10].
34 3.2.1 Παραγωγοποίηση πριν τη στήλη
Η παραγωγοποίηση πριν από τη στήλη (pre-column derivatization) αποτελεί την ευρύτερα χρησιμοποιούμενη τεχνική παραγωγοποίησης γιατί είναι απλή και δεν απαιτεί ειδική οργανολογία. Η κινητική της αντίδρασης δεν υπόκειται σε χρονικούς περιορισμούς εφ’ όσον αυτή ολοκληρώνεται σε σύντομο χρονικό διάστημα και τα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης και τα προϊόντα είναι σταθερά στο χρόνο αυτό. Οι συνθήκες παραγωγοποίησης μπορούν να μεταβληθούν, ώστε να βελτιωθεί η απόδοση της αντίδρασης, ενώ ο διαλύτης της αντίδρασης δε χρειάζεται να είναι συμβατός με το χρωματογραφικό σύστημα, καθώς είναι δυνατή η αλλαγή του πριν την έγχυση στη στήλη.
Πλεονεκτεί στην παροχή αυξημένης ευαισθησίας λόγω της άμεσης ανίχνευσης αποφεύγοντας έτσι την αραίωση και τη διακύμανση της γραμμής βάσης που προκαλούνται από την ανάμειξη μετά το χρωματογραφικό διαχωρισμό στην παραγωγοποίηση μετά τη στήλη (post-column derivatization) [11,12]. Όσον αφορά τα παραπροϊόντα που σχηματίζονται κατά την αντίδραση, καθώς και τα προϊόντα αποικοδόμησης του αντιδραστηρίου και η περίσσεια αυτού, μπορούν να διαχωριστούν από το παράγωγο, είτε χρωματογραφικά, είτε με κάποιο στάδιο καθαρισμού πριν το χρωματογραφικό διαχωρισμό.
Μειονεκτήματα της αποτελούν οι μη επιθυμητές παράπλευρες αντιδράσεις, η πιθανή αποικοδόμηση των παραγώγων, η επίδραση της μήτρας και οι ημιτελείς αντιδράσεις που απαιτούν τη χρήση εσωτερικού προτύπου.
Επιπλέον, είναι πιο χρονοβόρα και μπορεί να οδηγήσει σε μέθοδο χαμηλής ακρίβειας [13]. Γι’ αυτό θεωρείται κατάλληλη για περιορισμένα δείγματα που απαιτείται υψηλή ευαισθησία. Στον πίνακα 3 παρουσιάζονται συνοπτικά τα μειονεκτήματα και πλεονεκτήματά της [14-16].
3.2.2 Παραγωγοποίηση μετά τη στήλη
Η παραγωγοποίηση μετά τη στήλη (post-column derivatization) πραγματοποιείται σε ένα τμήμα του χρωματογραφικού συστήματος που καλείται αντιδραστήρας (post column reactor) και τοποθετείται μεταξύ της στήλης και του ανιχνευτή. Προτιμάται έναντι της παραγωγοποίησης πριν τη στήλη όταν το παράγωγο είναι ασταθές, αλλά διαθέτει μεγάλη σταθερά
35
σχηματισμού. Πρέπει να γίνει “on-line” για να υπάρχει μέγιστη ακρίβεια και μπορεί να αυτοματοποιηθεί και να προσφέρει εξαιρετική απόδοση, ακρίβεια και επαναληψιμότητα σε σχέση με την παραγωγοποίηση πριν τη στήλη ακολουθούμενη από υγροχρωματογραφία αντιστρόφου φάσεως [15,17]. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η χρωματογραφία και η παραγωγοποίηση είναι δύο διαφορετικές διαδικασίες που μπορούν να βελτιστοποιηθούν ξεχωριστά.
Δεδομένου ότι τα συστατικά του δείγματος διαχωρίζονται πριν την αντίδραση παραγωγοποίησης, η απόδοση της αντίδρασης είναι λιγότερο επιρρεπής στην επίδραση της μήτρας επιτρέποντας έτσι να χρησιμοποιηθεί για ένα ευρύ φάσμα δειγμάτων [11]. Η αντίδραση μπορεί να είναι επαναλήψιμη, χωρίς να είναι απαραίτητα πλήρης ή να σχηματίζεi ένα μόνο προϊόν σε αντίθεση με την παραγωγοποίηση πριν τη στήλη. Επιπλέον, η απαιτούμενη προκατεργασία του δείγματος είναι ελάχιστη, οι μη παραγωγοποιημένες ενώσεις μπορούν να ανιχνευθούν κατά την έκλουσή τους από τη στήλη πριν από την παραγωγοποίησή τους και παρατηρείται βελτίωση του σήματος λόγω της παραγωγοποίησης πολλαπλών ομάδων του αναλύτη [18-19].
Ωστόσο, εμφανίζει και σημαντικά μειονεκτήματα, όπως είναι η περιορισμένη ευαισθησία, το υψηλό κόστος των χρωματογραφικών στηλών, η απαίτηση για μεγάλη κατανάλωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης το οποίο ρέει συνεχώς, ο μεγάλος χρόνος ανάλυσης, οι διακυμάνσεις στη γραμμή βάσης και η δυσκολία στην κατασκευή και στη διατήρηση των συστημάτων παραγωγοποίησης μετά τη στήλη [11]. Επίσης, λόγω της διάχυσης του δείγματος στον αντιδραστήρα, οι κορυφές εμφανίζονται πιο ευρείες με αποτέλεσμα να χειροτερεύει ο χρωματογραφικός τους διαχωρισμός. Όσον αφορά την ανίχνευση των παραγώγων, υπάρχει ο κίνδυνος πιθανής παρεμπόδισης από την περίσσεια του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης ή από τα παραπροϊόντα της αντίδρασης. Τέλος, η παραγωγοποίηση μετά τη στήλη προσφέρει περιορισμένες επιλογές για τις συνθήκες παραγωγοποίησης, ενώ η κινητή φάση πρέπει να είναι συμβατή με το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης [18-19]. Στον πίνακα 4 παρουσιάζονται συνοπτικά τα μειονεκτήματα και πλεονεκτήματα της [12,14-16].
