ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCES

GVA Grapevine virus A (Vitivirus) GVA κ1-2, π1-2 RT-PCR εκκινητές για ανίχνευση GVA GVB Grapevine virus B (Vitivirus) GVC Grapevine virus C C, Vitivirus) GVD Grapevine virus D, Vitivirus.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η άμπελος

Βοτανικά χαρακτηριστικά της αμπέλου
Η ιστορία της αμπέλου

Προέλευση και εξάπλωση της αμπέλου
Η άμπελος στην αρχαιότητα και στη μυθολογία

Η πορεία του κρασιού από την αρχαιότητα μέχρι σήμερα
Οι δρόμοι του κρασιού της Μακεδονίας
Η καλλιέργεια της αμπέλου
Ελληνικές ποικιλίες αμπέλου

Αγιωργίτικο
Μαλαγουζιά
Ξινόμαυρο

Ιολογικές ασθένειες της αμπέλου

Ιοί της οικογένειας Closteroviridae

Η ασθένεια της συστροφής των φύλλων της αμπέλου

Ιοί της οικογένειας Flexiviridae

Η ασθένεια της βοθρίωσης του κορμού της αμπέλου

Διάγνωση των ιών της αμπέλου
Εμπορικό πολλαπλασιαστικό υλικό αμπέλου

Τυπικά μέλη κάθε γένους είναι ο ιός του κίτρινου τεύτλου (BYV), ο ιός 3 που σχετίζεται με τις μπούκλες των φύλλων της αμπέλου (GLRaV-3) και ο μολυσματικός ιός του κίτρινου τεύτλου (LIYV) (Tian et al. 1996, Martelli et al. 2002). Αυτοί είναι: Grapevine virus A, B, C, D (Grapevine virus A, B, C, D, GVA, GVB, GVC, GVD) (Martelli 1997), μέλη του γένους Vitivirus και μέλος του Foveavirus, που σχετίζεται με το Grapevine συσχετισμένος με κουκούτσια ιού στελέχους rupestris (GRSPaV) (Martelli and Jelkmann 1998, Meng et al. 1999a, 2005, Zhang et al. 1998).

Η μέθοδος της ιστοκαλλιέργειας

Στάδια μικροπολλαπλασιασμού
Ρυθμιστές αύξησης και ανάπτυξης
Υπερυδάτωση
Η ιστοκαλλιέργεια της αμπέλου

Η τεχνολογία σωματικής εμβρυογένεσης χρησιμοποιείται σήμερα για μαζική αναπαραγωγή φυτών (Carron et al. 1995, Van Boxtel and Berthouly 1996, Grapin et al. 1998, Cote et al. 1999), σε διαδικασίες γενετικής βελτίωσης (Santanm and Finer 1999), όπως και στον καθαρισμό των φυτών από ιούς που εντοπίζονται στο φλόωμα (Goussard et al. 1991, Popescu et al. 2003, Gambino et al. 2006, Gribaudo et al. 2006). Η βασική αντιπροσωπεύει υψηλή συγκέντρωση ορμονών, όπου η κορυφή είναι χαμηλή (van George 1993, van Eleftheriou 2006, van George et al.

Μέθοδοι εξυγίανσης της αμπέλου

Εφαρμογή θερμοθεραπείας και καλλιέργειας ιστών
Χρήση αντι-ιικών ουσιών

Η θειαζοφουρίνη (2-β-D-ριβοφουρανοσυλσελεναζολ-4-καρβοξαμίδιο) (Kirsi et al. 1983), είναι ένα συνθετικό νουκλεοτιδικό ανάλογο, ο ενδοκυτταρικός ενεργός μεταβολίτης του οποίου είναι το νουκλεοτίδιο αδενίνης θειαζολο-4-καρβοξαμιδίου (TAD) (Cooney et al. Το μυκοφαινολικό οξύ) MPA) (Allison and Eugui 2000) είναι ένας μη-νουκλεοτιδικός ανταγωνιστικός αναστολέας του IMPDH που μπορεί να συνδεθεί στη θέση δέσμευσης του IMP καθώς και στο NAD+ (Fleming et al. 1996, Link and Straub 1996, Gan et al. 2002 ).

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Φυτικό πειραματικό υλικό

Ιολογικός έλεγχος

Δοκιμή ELISA

Δοκιμή DAS-ELISA
Δοκιμή ΤAS-ELISA

Δοκιμή εστιασμένης RT-PCR

Εκχύλιση ολικού RNA
Δοκιμή RT-PCR για την ανίχνευση των ιών του γένους
Δοκιμή εστιασμένης PCR

Οι εκκινητές RSP π1 και RSP κ1, όπου η ενισχυμένη περιοχή βρίσκεται στο RdRp (Meng et al. 1999a), καθώς και οι εκκινητές RSP π2 και RSP κ2, όπου η ενισχυμένη περιοχή βρίσκεται στην πρωτεΐνη καψιδίου, χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του ιού GRSPaV στελέχη. (πρωτεΐνες περιβλήματος, CP) (Nakaune and Nakano 2006).

Πρωτόκολλο μικροπολλαπλασιασμού

Εγκατάσταση
Βασικό υπόστρωμα μικροπολλαπλασιασμού
Επίδραση των ρυθμιστών ανάπτυξης
Επίδραση της θερμοκρασίας
Ριζοβολία in vitro και εγκλιματισμός

Ριζοβολία in vitro και σκληραγώγηση

Πειραματικός σχεδιασμός

In vitro placement of Agiorgitiko explants: α) Vine shoot segments, β) Explant before establishment, γ-δ) Microshoot explant.

Εξυγίανση

Συνδυασμός θερμοθεραπείας και καλλιέργειας

Θερμοθεραπεία
Λήψη και καλλιέργεια επάκριων μεριστωμάτων
Λήψη και καλλιέργεια βλαστικών κορυφών

Φυτικό υλικό και υπόστρωμα καλλιέργειας
Εφαρμογή των αντι-ιικών ουσιών

Το αντιιικό Ribavirin και Mycophenolic acid αγοράστηκαν από τη Sigma–Aldrich (St. Louis, MO), ενώ το Tiazofurin παρασχέθηκε ευγενικά από τον Prof. Jayaram HN (Indiana University, School of Medicine, Indianapolis, Indiana, USA).

Μικροσκοπία

Φυτικό υλικό
Προετοιμασία φυτικού υλικού για παρατήρηση
Μορφομετρία

Πίνακες Υλικών και Μεθόδων

Αναλυτική σύνθεση των υποστρωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την in vitro εγκατάσταση των εκφυτευμάτων της ποικιλίας Ξινόμαυρο. Καθαρισμένα φυτά έχουν ληφθεί μετά από εφαρμογή θερμικής επεξεργασίας (Goheen and Luhn 1973, Doazan et al. 1979), συνεχούς μικροπολλαπλασιασμού αναπτυσσόμενων μικροβλαστών (Stellmach 1980), μικροενοφθαλμισμού (Engelbrecht and Schwerdtfeger 1979, Benin8 και Grenan καλλιέργειας) in1. μεριστώματα, βλαστικά μπουμπούκια και τμήματα βλαστών με μπουμπούκια (Barlass et al.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Ιολογικός έλεγχος

Πρωτόκολλο μικροπολλαπλασιασμού

Εξυγίανση

Συνδυασμός θερμοθεραπείας και καλλιέργειας μεριστωμάτων

Καλλιέργεια επάκριων μεριστωμάτων
Καλλιέργεια βλαστικών κορυφών
Ιολογικός έλεγχος φυταρίων από καλλιέργεια μεριστωμάτων
Φυτοτοξικότητα που προκαλείται από τις αντι-ιικές ουσίες
Εξυγίανση από τον GRSPaV

Μικροσκοπία

Προετοιμασία υλικού για μικροσκοπική παρατήρηση
Οπτική μικροσκοπία
Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Πίνακες αποτελεσμάτων

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Ιολογικός έλεγχος

Τόσο οι ιοί του αμπελόξυλου (GRW) όσο και των ιών των φύλλων σταφυλιών (GLR) έχουν αναφερθεί ότι είναι άνισα κατανεμημένοι μεταξύ των μερών του φυτού (Monis and Bestwick 1996, Boscia et al. 1997, Dovas and Katis 2003b, O'Herlihy et al. 2003). κυμαίνεται ακόμη και κατά τις εποχές του χρόνου, γεγονός που καθιστά δύσκολη την αξιοπιστία του ELISA.

Πρωτόκολλο μικροπολλαπλασιασμού

Βασικό πολλαπλασιαστικό υλικό

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ποικιλομορφία μεταξύ των ποικιλιών Vitis vinifera είναι εξαιρετικά υψηλή (Galzy 1964, Favre και Grenan 1979, Harris and Stevenson 1982, Chee and Pool 1983, Galzy et al. 1990). Η επιλογή αυτής της κυτοκινίνης έναντι άλλων, όπως η κινετίνη, έγινε λόγω της υπεροχής της σε καλλιέργειες αμπέλου από προηγούμενες μελέτες (Harris and Stevenson 1982, Chee and Pool Novák and Jůvová 1983, Lewandowski 1991, Thies and Graves 1992, Borregrosa 1992, ). , Mhatre et al. 2000, Ibáñez et al. 2005), παρά το γεγονός ότι παρατηρήθηκαν διαφορές στην απόκριση των μοσχευμάτων ανάλογα με τη συγκέντρωση λόγω της γενετικής τους διαφοροποίησης. Από τα αποτελέσματα άλλων ερευνητών (Jona and Webb 1978, Goussard 1981, Harris and Stevenson 1982, NovákandJůvová 1983, Gray and Fisher 1985, Lee and Wetzstein 1990, Torregrosa and Bouquet al.ñet al.ñet al.ñet al.20, 1990 05 ) έδειξε ότι η προσθήκη ΒΑ στο μέσο καλλιέργειας ήταν ιδιαίτερα σημαντική και απαραίτητη για τη ρύθμιση της ανάπτυξης και της ανάπτυξης.

Η χρήση της καλλιέργειας μεριστώματος (Barlass et al. 1982, Staudt and Kassemeyer 1994) σε συνδυασμό με τη θερμική θεραπεία (Gifford and Hewitt 1961, Valat and Mur 1976), οδήγησε σε αύξηση της αποτελεσματικότητας των μεθόδων υγιεινής και σε προηγούμενες μελέτες (Savino ) et al. 1990, Gribaudo et al. 1997, Credi and Babini 1997, Bottalico et al. 2003). Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη χρήση αντιιικών παραγόντων στην καταπολέμηση του GRSPaV, ενώ υπάρχουν λίγες αναφορές για την κάθαρση των ποικιλιών αμπέλου από τον ιό GLRaV (Monette 1983, Stevenson and Monette 1983, Barba et al. 1990), από το GVA και GLRaV-3 (Panattoni et al. 2007a, b), καθώς και από το GFLV (Weiland et al. 2003). Τα αποτελέσματα φυτοτοξικότητας και αποκατάστασης της παρούσας μελέτης διαφέρουν από αυτά άλλων ερευνητών που έχουν διερευνήσει την αποκατάσταση ιών μέσω χημειοθεραπείας (Weiland et al. 2003, Panattoni et al. 2007a, b) λόγω της διαφορετικής σχέσης μεταξύ ιών και ξενιστών (Kassanis ) 1950, Burnett et al. 1975, Walkey and Cooper 1975), την πολυπλοκότητα που παρουσιάζουν οι διαφορετικοί ιοί στην απόδοση των μεθόδων καθαρισμού (Gribaudo et al. 2006, βλ. Gribaudo et al. 2006, Panattoni et al. 2007b) και το διαφορετικό αρχικό δείγμα εκφύτευσης για το οποίο είναι η χημειοθεραπεία μεταχειρισμένος.

Μικροσκοπία

Εμφάνιση πλαστοσφαιριδίων ή αύξηση του αριθμού τους παρουσία ιών έχει επίσης παρατηρηθεί από άλλους ερευνητές στο παρελθόν, όπως από τους Russo και Martelli (1982) στο Chenopodium quinoa παρουσία του ιού του κάκτου Saquaro, από τους Zechmann et al. 2003) στα φυτά κολοκύθας της Στυρίας από τον ιό του κίτρινου μωσαϊκού των κολοκυθιών, όπου η εμφάνιση πλαστοσφαιρών συνοδεύτηκε από μείωση του αριθμού των θυλακοειδών.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

SUMMARY

Eradication of Xinomavro virus was not possible due to the small number of samples and the low survival rate of meristems and shoot tips. However, this was not the case for the survival rate, resulting in a higher number of virus-free plants produced from shoot tip culture. In addition, the eradication of GRSPaV from Agiorgitiko was greater than from Malagouzia, confirming the preferential or non-excretion-preferential relationship of the virus to the host.

The effect of chemotherapy using the antiviral drugs Tiazofurin, Ribavirin and Mycophenolic acid was studied for the first time on grapevines infected with GRSPaV and provided virus-free plants for both tested cultivars. However, after treatment with antiviral drugs, phytotoxicity occurred in both cultivars and was proportional to drug concentration. Tiazofurin proved to be more toxic, followed by ribavirin and mycophenolic acid for both studied cultivars.

Malagouzia appeared to be more tolerant to the toxic action of single antiviral drugs, but this was not the case for drug combinations, resulting in total mortality of the explants of this cultivar. The efficacy of chemotherapy on the elimination of GRSPaV was correlated with the type of drugs and their concentration. When separate antiviral agents were used, Tiazofurin for Agiorgitiko was found to be more effective, achieving the highest sanitary record of 80% at 10 μg/ml, followed by 20 μg/ml mycophenolic acid at 85.7% and 30 μg/ml Ribavirin at 62.5%. .

For Malagouzia, the highest virus eradication rate (53.3%) was achieved with 80 μg/ml mycophenolic acid followed by 15 μg/ml Thiazofurin with 37.5% eradication. An essential problem to consider in grapevine micropropagation is the genetic variability of Vitis vinifera cultivars, which affects the efficiency of in vitro techniques and applied procedures, possibly due to the different endogenous plant regulators of each cultivar. A comparative light microscopic cytological study of virus-free and infected Agiorgitiko plants revealed a difference in the chloroplast volume density of palisade and spongy parenchyma, with virus-free plants containing more chloroplasts than infected ones.

Electron microscopy showed the presence of many plastoglobules in the infected plant material, which could be attributed to virus infection. Comparative study of virus-free plants through thermotherapy and chemotherapy revealed the existence of plastoglobules in plants produced after drug treatment but not after thermotherapy. Given that the appearance of plastoglobules is closely related to aging or stress, their induction may be related to toxicity caused by antiviral drugs.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

In vitro grapevine stem tip grafting as an aid to recovery of virus-free clones. Use of heat therapy and in vitro shoot bud culture to eliminate grape leaf spot virus from grapevine. An improved procedure for in vitro propagation of Vitis vinifera (cv. Pinot noir) using axillary bud cuttings.

Monitoring of viral diseases in Austrian grape varieties and virus elimination using in vitro thermotherapy. Degree of development of vines under in vitro conditions depending on the biology of the original explant. Elimination of Grapevinevirus A (GVA) by cryopreservation of in vitro cultured shoot tips of Vitis vinifera L.

Regeneration of virus-free plants by in vitro chemotherapy of GFLV (Grapevine fanleaf virus) infected explants of.