Δοκιμή RT-PCR για την ανίχνευση των ιών του γένους

Χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε από τους Dovas and Katis (2003a, b) και Dovas et al. (2006). Σύμφωνα με τη μέθοδο, πραγματοποιείται αρχικά η σύνθεση του συμπληρωματικού DNA (cDNA) και στη συνέχεια η ενίσχυσή του στον ίδιο μικροσωλήνα (Εικόνα 2.6). Για την ανίχνευση των Clostero-ιών επιλέχθηκε η ενίσχυση τμημάτων [‘phosphate 1 και 2’ καθώς και του ‘connect 1’ (Tian et al. 1996)], μιας συντηρημένης περιοχής της πρωτεΐνης της θερμικής καταπόνησης 70 (Heat shock protein 70 homologue, HSP70h) (Πίνακας 2.12). Αρχικά γίνεται η RT-PCR σε ένα μικροσωλήνα και στη συνέχεια ακολουθούν πέντε ένθετες PCR για την ανίχνευση των ιών GLRaV (Εικόνα 2.7). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε στο θερμοκυκλοποιητή Mastercycler gradient (Eppendorf) σε μεταβαλλόμενες θερμοκρασίες και χρόνους (Πίνακας 2.14).

Εικόνα 2.6: Ένθετη RT-PCR σε ένα μικροσωλήνα (Dovas and Katis 2003a, b).

Figure 2.6: Nested RT-PCR in one microtube (Dovas and Katis 2003a, b).

Για την ανίχνευση των ιών του γένους Fovea- και Vitivirus χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε από τους Dovas and Katis (2003β). Σύμφωνα με αυτή, πραγματοποιείται αρχικά η σύνθεση του συμπληρωματικού DNA και στη συνέχεια η ενίσχυσή του στον ίδιο μικροσωλήνα (Εικόνα 2.6). Για την ανίχνευση των Fovea- και Viti-ιών επιλέχθηκε η ενίσχυση δύο συντηρημένων περιοχών της RNA εξαρτώμενης

RT-PCR στον

ίδιο μικροσωλήνα Ένθετη PCR

Fovea- Viti-

Ιοί Clostero-

ιοί 1 μl προϊόν

RT-PCR Fovea-

Viti- ιοί Ιοί Closterο-

Ιοί

από RNA πολυμεράσης (RNA dependent RNA polymerase, RdRp), των μοτίβων II και V (Dovas and Katis, 2003a) (Πίνακας 2.13). Όπως και προηγουμένως, η αντίδραση πραγματοποιήθηκε στον ίδιο θερμοκυκλοποιητή (Mastercycler gradient, Eppendorf) σε μεταβαλλόμενες θερμοκρασίες και χρόνους (Πίνακας 2.14).

Για την ανίχνευση των στελεχών του ιού GRSPaV χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές RSP π1 και RSP κ1 όπου η περιοχή που ενισχύεται βρίσκεται στην RdRp (Meng et al. 1999a), καθώς και οι εκκινητές RSP π2 και RSP κ2 όπου η περιοχή που ενισχύεται βρίσκεται στην καψιδιακή πρωτεΐνη (coat protein, CP) (Nakaune and Nakano 2006). Για την ανίχνευση των στελεχών του ιού GVA χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές GVA π1 και GVA κ1 (Gambino et al. 2006), καθώς και οι εκκινητές GVA π2 και GVA κ2 (Nakaune and Nakano 2006). Και στις δύο περιπτώσεις η προς ενίσχυση περιοχή βρίσκεται στην CP.

Τα συστατικά του μείγματος της αντίδρασης για την ανίχνευση των στελεχών του ιού GRSPaV, αλλά και του GVA (Πίνακας 2.15) και οι συνθήκες της αντίδρασης (Πίνακας 2.16), ήταν οι ίδιες και για τους δύο ιούς, με μόνη διαφορά τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε στο θερμοκυκλοποιητή Mastercycler gradient (Eppendorf).

Η διαφοροποίηση από τις προηγούμενες περιπτώσεις είναι ότι η ανίχνευση γίνεται μόνο με RT-PCR και δεν απαιτείται το στάδιο της ένθετης PCR.

2.2.2.3. Δοκιμή ένθετης PCR

Στην ένθετη PCR χρησιμοποιήθηκε 1 μl από τα προϊόντα της RT-PCR που περιγράφηκε (κεφάλαιο 2.2.2.2). Η σύσταση του μείγματος της αντίδρασης για την ανίχνευση των ιών Closterovirus (Πίνακας 2.17) και το πρόγραμμα θερμοκυκλοποίησης (Πίνακας 2.18) πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους Dovas et al. (2006). Για την ταυτόχρονη ανίχνευση των ιών Foveavirus και Vitivirus χρησιμοποιήθηκε το ίδιο μείγμα αντίδρασης, όμως ως εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν οι RW εστ π1 και RW εστ κ1 σε συγκέντρωση 1 μΜ. Το πρόγραμμα θερμοκυκλοποίησης (Πίνακα 2.18) ακολουθήθηκε σύμφωνα με τους Dovas et al. (2006). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε στο θερμοκυκλοποιητή Mastercycler gradient (Eppendorf).

Εικόνα 2.7: Ένθετη PCR για την ανίχνευση των ιών της οικογένειας Closteroviridae.

Figure 2.7: Nested PCR for Closteroviridae virus detection.

Τα προϊόντα της ένθετης PCR αναλύθηκαν σε 1,5% πηκτή αγαρόζης (Life Technologies^TM) σε ρυθμιστικό διάλυμα 1 X TAE (Πίνακας 2.19). Το διάλυμα αγαρόζης μετά τη θέρμανσή του μέχρι του σημείου βρασμού, τοποθετήθηκε σε συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης και αφού έπηξε συμπληρώθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα 1 X TAE. Στη συνέχεια 10 μl από το κάθε προϊόν της αντίδρασης PCR αναμείχθηκαν με 1 μl χρωστικού διαλύματος που περιείχε 0,25% κυανούν της βρωμοφαινόλης. Σε κάθε πηκτή τοποθετήθηκαν, εκτός από τα δείγματα, ένας υγιής και ένας ιωμένος μάρτυρας καθώς και ένας δείκτης μοριακού βάρους που περιείχε τμήματα DNA γνωστού μοριακού βάρους (Life Technologies^TM). Η τάση που εφαρμόστηκε ήταν 110 V για περίπου 1½ ώρα. Στη συνέχεια, η πηκτή επωάστηκε σε υδατικό διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου (0,5 mg/ml) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Η ανίχνευση του DNA έγινε με τοποθέτηση της πηκτής σε υπεριώδη ακτινοβολία σε τράπεζα φθορισμού.

RT-PCR στον

ίδιο μικροσωλήνα 1 μl προϊόν Εστιασμένη PCR RT-PCR

Closterο-

viridae GLRaV-1 GLRaV-2 GLRaV-3

Ampelo- viruses συγγενικοί

με GLRaV-5

Clostero- viridae

2.3. Πρωτόκολλο μικροπολλαπλασιασμού 2.3.1. Αγιωργίτικο

2.3.1.1. Εγκατάσταση

Από τους τρυφερούς βλαστούς μήκους 7-10 cm, που συλλέχθηκαν την περίοδο Μαΐου-Ιουνίου, αφαιρέθηκαν τα φύλλα και στη συνέχεια πλύθηκαν σε τρεχούμενο νερό (Εικόνα 2.8). Ακολούθησε ο τεμαχισμός τους σε μικρομοσχεύματα ενός γονάτου που περιλάμβαναν ένα οφθαλμό, τα οποία απολυμάνθηκαν αρχικά με 70% αλκοόλη για 30 sec και στη συνέχεια με 2%

(v/v) NaOCl για 15 λεπτά. Η απολύμανση έγινε σε κωνικές φιάλες των 500 ml υπό συνεχή ανάδευση όπου προστέθηκαν 3 σταγόνες Tween 20. Στη συνέχεια τα έκφυτα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με αποστειρωμένο, απιονισμένο νερό και τοποθετήθηκαν σε δοκιμαστικούς σωλήνες που περιείχαν το θρεπτικό υπόστρωμα. Τα υποστρώματα που ελέγχθηκαν για εγκατάσταση ήταν:

α) ½ Quoirin-Lepoivre (1977) - Murashige and Skoog (1962) (½ QL-MS), β) ½ MS,

γ) QL-MS (Bottalico et al. 1997), και

δ) Woody Plant Medium (WPM) (Lloyd and McCown 1980).

Τα θρεπτικά υποστρώματα (Πίνακες 2.20 και 2.21) χρησιμοποιήθηκαν τόσο χωρίς ορμόνες όσο και εμπλουτισμένα με 4,5 μΜ ΒΑ και 2,7 μΜ ΝΑΑ.

Το pH ρυθμίστηκε στο 5,75 ή στο 5,90 πριν από την αποστείρωση σε αυτόκαυστο.

Τα έκφυτα που επιβίωσαν της απολύμανσης και ήταν απαλλαγμένα από βακτήρια και μύκητες, παρήγαγαν μονούς, μασχαλιαίους βλαστούς, οι οποίοι κόπηκαν περαιτέρω σε τμήματα του ενός οφθαλμού και μεταφέρθηκαν σε γυάλινα βάζα των 500 ml (Εικόνα 2.9) που περιείχαν 125 ml από το θρεπτικό υπόστρωμα QL-MS, το οποίο εμπλουτίστηκε με 0,13 μM BA και 0,16 μM NAA (Σκιαδά 2003). Η διαδικασία της ανακαλλιέργειας επαναλαμβανόταν κάθε έξι εβδομάδες και επαρκές φυτικό υλικό για περαιτέρω πειραματισμό είχε παραχθεί μετά από έξι μήνες.

Εικόνα 2.8: Εγκατάσταση εκφύτων Αγιωργίτικου in vitro: α) Τμήματα από κληματίδες, β) Έκφυτο πριν την εγκατάσταση, γ-δ) Βλαστημένα έκφυτα.

Figure 2.8: In vitro establishment of Agiorgitiko explants: α) Segments of grapevine shoots, β) Explant before establishment, γ-δ) Explant with microshoot.

Εικόνα 2.9: In vitro καλλιέργεια εκφύτων της ποικιλίας Αγιωργίτικο. α) Βάζο καλλιέργειας, β) Βλαστοί, και γ) Ριζικό σύστημα.

Figure 2.9: In vitro culture of grapevine cultivar Agiorgitiko explants. α) Culture vase, β) Shoots and γ) Roots.

2.3.1.2. Βασικό υπόστρωμα μικροπολλαπλασιασμού

Μελετήθηκε η επίδραση έξι βασικών θρεπτικών υποστρωμάτων (Πίνακας 2.20), εμπλουτισμένων με 0,13 μM BA και 0,16 μM NAA, για τον in vitro

α γ

δ β

α

α β γ

πολλαπλασιασμό των εκφύτων της ποικιλίας Αγιωργίτικο (Skiada et al. 2009).

Αυτά ήταν τα εξής:

(α ) MS, (β) WPM,

(γ) Galzy (GAL) (Galzy et al. 1990),

(δ) MS-GAL, που αποτελείτο από μακρο- και μικροστοιχεία MS, βιταμίνες GAL (Galzy 1972) χωρίς παντοθενικό ασβέστιο και βιοτίνη (Chee και Pool 1982),

(ε) QL-MS, αποτελούμενο από μακρο- και μικροστοιχεία QL, βιταμίνες και Fe- EDTA MS (Bottalico et al. 1997), και

(στ) QL-WPM, αποτελούμενο από μακρο- και μικροστοιχεία QL, βιταμίνες WPM και Fe EDTA MS.

Ως καταλληλότερο υπόστρωμα για το Αγιωργίτικο αποδείχθηκε το WPM, το οποίο χρησιμοποιήθηκε και στον περαιτέρω πειραματισμό, εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό.

2.3.1.3. Επίδραση των ρυθμιστών ανάπτυξης

Μελετήθηκε η επίδραση δύο ρυθμιστών ανάπτυξης στο μικροπολλαπλασιασμό του Αγιωργίτικου σε υπόστρωμα WPM, μιας κυτοκινίνης (ΒΑ) και μιας αυξίνης (ΝΑΑ). Η μελέτη αφορούσε στην παρουσία μόνο της ΒΑ αλλά και στην αλληλεπίδραση ΒΑ-ΝΑΑ. Οι συγκεντρώσεις της ΒΑ που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 8 και 16 μM. Η αλληλεπίδραση BA-ΝΑΑ έγινε με συγκεντρώσεις 0,5-4 μM ΒΑ σε συνδυασμό με 0,1 και 0,3 μM NAA (Heloir et al. 1997). Το υπόστρωμα στο οποίο έγινε η μελέτη των ορμονών ήταν το καταλληλότερο που προέκυψε από τον πειραματισμό για την επίδραση των βασικών υποστρωμάτων (κεφάλαιο 2.3.1.2). Οι συγκεντρώσεις των ρυθμιστών ανάπτυξης που μελετήθηκαν προέκυψαν μετά από προκαταρκτικό πειραματισμό, όπου φάνηκε ότι δεν δημιουργούσαν εκτεταμένη παρακμή των εκφύτων-φυταρίων στην περίπτωση της BA, και παράλληλα δεν προκαλούσαν τη δημιουργία μεγάλων κάλλων στη βάση του βλαστού. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε θρεπτικό μέσο WPM χωρίς ορμόνες.

2.3.1.4. Επίδραση της θερμοκρασίας

Μελετήθηκε η επίδραση υψηλότερης (26±2^oC) και χαμηλότερης (21±2^oC) θερμοκρασίας στο μικροπολλαπλασιασμό του Αγιωργίτικου. Ως θρεπτικό υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε το WPM εφοδιασμένο με 0,25 μM BA and 0,3 µM NAA (Galzy et al. 1990, Ibáñez et al. 2005).

2.3.1.5. Ριζοβολία in vitro και εγκλιματισμός

Η ριζοβολία των εκφύτων της ποικιλίας Αγιωργίτικο μελετήθηκε σε δύο τιμές θερμοκρασίας (22±2 και 26±2^oC). Βλαστοί ηλικίας έξι εβδομάδων ύψους 4 cm καλλιεργήθηκαν σε υπόστρωμα MS (Li and Eaton 1984) εφοδιασμένο με διάφορες συγκεντρώσεις NAA (0,1, 0,3, 0,5, 1 µM) (Chee et al. 1984) ή IBA (0,1, 0,5, 1, 1,5 μM) (Grammatikaki and Avgelis 2000).

Ριζοβολημένοι και μη ριζοβολημένοι μικροβλαστοί που προέκυψαν από τα πειράματα ριζοβολίας, αφού πλύθηκαν σε τρεχούμενο νερό βρύσης προκειμένου να απομακρυνθεί το θρεπτικό υπόστρωμα, τοποθετήθηκαν ξεχωριστά η μία κατηγορία από την άλλη (παρουσία-απουσία ρίζας, υπόστρωμα ριζοβολίας, θερμοκρασία καλλιέργειας) σε δίσκους 60 θέσεων, διαστάσεων 5 x 5 x 5 cm, σε μίγμα τύρφης (Klasmann, KTS 1)-περλίτη σε αναλογία 4:1 (v/v).

Οι δίσκοι τοποθετήθηκαν σε πάγκους υάλινου θερμοκηπίου με θέρμανση στη βάση που εξασφάλιζε σταθερή θερμοκρασία εδαφικού μείγματος 18-20^οC. Η σχετική υγρασία του χώρου διατηρήθηκε μεγαλύτερη από 90% στις πρώτες 10 ημέρες χρησιμοποιώντας σύστημα ομίχλης (fog system), ενώ παράλληλα εφαρμόσθηκε αυτόματο σύστημα σκίασης με κουρτίνες που δεν επέτρεπε στην ένταση του φωτός μέσα στο χώρο να υπερβαίνει τα 300 W/m² (Van Telgen et al. 1992). Σταδιακά, από τη 10η έως την 20ή ημέρα η σχετική υγρασία μειωνόταν κατά 5%, ενώ παράλληλα αυξανόταν η ένταση του φωτισμού. Σε όλο το χρονικό διάστημα έγινε προσπάθεια η θερμοκρασία του χώρου να μην ανέβει πάνω από 29^οC (George 1996, De Klerk 2000). Ο χειρισμός των συστημάτων γινόταν μέσω ηλεκτρονικού υπολογιστή. Ο εγκλιματισμός των φυταρίων διήρκησε 30 ημέρες και τα φυτά που επιβίωσαν μετά το τέλος της διαδικασίας μεταφέρθηκαν σε δικτυοκήπιο.

2.3.2. Μαλαγουζιά 2.3.2.1. Εγκατάσταση

Για την εγκατάσταση εκφύτων της ποικιλίας Μαλαγουζιά, που πραγματοποιήθηκε την εποχή Ιουλίου-Σεπτεμβρίου, ακολουθήθηκαν οι εξής μεταχειρίσεις:

Α΄ μεταχείριση: Βλαστικές κορυφές μήκους μέχρι 15 cm πάρθηκαν από τα μητρικά φυτά που βρίσκονται στον αμπελώνα της εταιρίας ΒΙΤΡΟ ΕΛΛΑΣ Α.Ε. στο Νησέλι και, αφού αφαιρέθηκαν τα φύλλα τους και ακολούθησε πλύση σε τρεχούμενο νερό, τελικά κόπηκαν ανά γόνατο. Στη συνέχεια παρέμειναν σε 70% αλκοόλη για 30 sec και ακολούθησε πλύση σε τρεχούμενο νερό. Τα έκφυτα τοποθετήθηκαν σε υάλινες κωνικές φιάλες των 500 ml που περιείχαν διάλυμα 2% NaOCl και 3 σταγόνες Tween 20, για 20 λεπτά. Ακολούθησε πλύση τρεις φορές με αποστειρωμένο νερό και τοποθέτηση σε σωλήνες με υπόστρωμα

α) ½ QL-MS, β) ½ MS, γ) QL-MS, και δ) WPM,

χωρίς ορμόνες και εμπλουτισμένα με 0,3 μΜ ΒΑ και 0,005 μΜ ΝΑΑ (Πίνακες 2.20 και 2.22).

Β΄ μεταχείριση: Ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία με την Α΄ μεταχείριση, με τη διαφορά ότι η απολύμανση έγινε με διάλυμα 2‰ HgCl2 για 20 λεπτά.

Γ΄ μεταχείριση: Λήφθηκαν 180 ξυλοποιημένες και 174 μη ξυλοποιημένες κληματίδες από τα μητρικά φυτά, οι οποίες κόπηκαν σε μοσχεύματα του ενός γονάτου. Τα ξυλοποιημένα μοσχεύματα εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα 2% ΙΒΑ (w/v), ενώ τα μη ξυλοποιημένα σε διάλυμα 0,066% ΙΒΑ (w/v). Στη συνέχεια τα μοσχεύματα φυτεύτηκαν σε μείγμα τύρφης-περλίτη αναλογίας 4:1 (v/v) και αφέθηκαν να βλαστήσουν σε συνθήκες υδρονέφωσης με σχετική υγρασία πάνω από 90% (Εικόνα 2.10). Κατά τη διάρκεια της παραμονής τους στην υδρονέφωση εφαρμόστηκαν τα μυκητοκτόνα Thiram και Garbendan σε συγκεντρώσεις 2% και 1,2% (w/v) αντίστοιχα. Μετά από 40 ημέρες και αφού τα φυτά διέθεταν βλαστό και ριζικό σύστημα, μεταφέρθηκαν σε σκίαστρο. Στη

συνέχεια, κόπηκαν οι βλαστικές κορυφές μεγέθους μέχρι πέντε γονάτων και ακολούθησε η διαδικασία επιφανειακής απολύμανσης όπως και στην Α΄

μεταχείριση. Για την απολύμανση χρησιμοποιήθηκε διάλυμα 2% NaOCl για 15- 18 λεπτά. Η εγκατάσταση των εκφύτων έγινε αρχικά σε υπόστρωμα ½ QL-MS εμπλουτισμένο με 0,3 μΜ ΒΑ και 0,005 μΜ ΝΑΑ (Μ ΕΓΚ 2) και μετά από 15 ημέρες μεταφέρθηκαν σε θρεπτικό μέσο QL-MS παρουσία 0,13 μΜ ΒΑ και 0,16 μΜ ΝΑΑ (Μ ΕΓΚ 9) (Πίνακας 2.22).

Εικόνα 2.10: Μαλαγουζιά: α, β) Βλαστημένα και ριζοβολημένα μοσχεύματα.

Figure 2.10: Malagouzia: a, b) Shooted and rooted cuttings.

2.3.2.2. Βασικό υπόστρωμα μικροπολλαπλασιασμού

Μελετήθηκε η επίδραση των έξι βασικών θρεπτικών υποστρωμάτων που δοκιμάστηκαν και στην περίπτωση του Αγιωργίτικου (κεφάλαιο 2.3.1.2), εμπλουτισμένα με 0,13 μM BA και 0,05 μM NAA για τον in vitro πολλαπλασιασμό των εκφύτων της ποικιλίας Μαλαγουζιά. Η συγκέντρωση των ορμονών προέκυψε μετά από προκαταρκτικό πειραματισμό. Ως καταλληλότερο υπόστρωμα για τη Μαλαγουζιά αποδείχθηκε το GAL, το οποίο χρησιμοποιήθηκε και στον περαιτέρω πειραματισμό, εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό.

2.3.2.3. Επίδραση των ρυθμιστών ανάπτυξης

Η επίδραση των ρυθμιστών ανάπτυξης (ΒΑ και ΝΑΑ) μελετήθηκε σε υπόστρωμα GAL επειδή αυτό αποδείχθηκε το καλύτερο για την ποικιλία αυτή, στις ίδιες συγκεντρώσεις όπως στην περίπτωση του Αγιωργίτικου (κεφάλαιο

α β

2.3.1.3) και μετά από ανάλογο προκαταρκτικό πειραματισμό. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε θρεπτικό μέσο GAL χωρίς ορμόνες.

2.3.2.4. Επίδραση της θερμοκρασίας

Μελετήθηκε η επίδραση υψηλότερης (26±2^oC) και χαμηλότερης (21±2^oC) θερμοκρασίας στο μικροπολλαπλασιασμό της Μαλαγουζιάς. Ως θρεπτικό υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε το GAL εφοδιασμένο με 0,25 μM BA and 0,1 µM NAA (Galzy et al. 1990, Ibáñez et al. 2005).

2.3.2.5. Ριζοβολία in vitro και σκληραγώγηση

Η ριζοβολία και η σκληραγώγηση πραγματοποιήθηκε όπως στην περίπτωση του Αγιωργίτικου (κεφάλαιο 2.3.1.5).

2.3.3. Ξινόμαυρο 2.3.3.1. Εγκατάσταση

Για την εγκατάσταση των εκφύτων της ποικιλίας Ξινόμαυρο (Εικόνα 2.11) πραγματοποιήθηκαν οι μεταχειρίσεις Α΄, Β΄, Γ΄, όπως στην περίπτωση της Μαλαγουζιάς (κεφάλαιο 2.3.2.1), αλλά και

Δ΄ μεταχείριση: Ξυλοποιημένες κληματίδες που βρίσκονταν σε λήθαργο, τοποθετήθηκαν στο ψυγείο σε θερμοκρασία 4^οC για 30 ημέρες (Σπινθιροπούλου, προσωπική επικοινωνία).

Στη συνέχεια ακολούθησε τοποθέτησή τους σε βάζα με νερό, όπου και βλάστησαν.

Όσες κληματίδες διέθεταν ανεπτυγμένο ριζικό σύστημα φυτεύτηκαν σε γλάστρες.

Συνολικά στη Γ΄ και Δ΄

μεταχείριση φυτεύτηκαν 1040 Εικόνα 2.11: Ξινόμαυρο: ριζοβολημένα

μοσχεύματα στην αρχή της βλάστησης.

Figure 2.11: Xinomavro: rooted cuttings at the beginning of vegetation.

μικρομοσχεύματα. Aπό τους νέους βλαστούς προέκυψαν τα έκφυτα τα οποία μεταχειρίστηκαν όπως στην περίπτωση Α΄. Η απολύμανση έγινε με διάλυμα 2%

NaΟCl για 15-20 λεπτά και 1,5% NaΟCl για 10 λεπτά. Ακολούθησε εγκατάσταση των εκφύτων στα υποστρώματα που δοκιμάστηκαν στην περίπτωση της Μαλαγουζιάς (Πίνακες 2.20 και 2.22), επιπρόσθετα και σε άλλα υποστρώματα (Πίνακες 2.23, 2.24 και 2.25).

Η εγκατάσταση του Ξινόμαυρου εξελίχθηκε σε πολύ δύσκολη διαδικασία, καθώς υπήρξαν προβλήματα τόσο στην απολύμανση του φυτικού υλικού, όσο και στη διατήρησή του, προκειμένου να παραχθεί το βασικό πολλαπλασιαστικό υλικό. Παρατηρήθηκε ολική καταστροφή των φυταρίων μετά τη μεταφορά τους από τους δοκιμαστικούς σωλήνες, όπου τοποθετούνταν τα έκφυτα αρχικά, στα βάζα ανάπτυξης. Αυτό συνέβαινε σε όλα τα τμήματα που διαιρείτο το φυτάριο (κορυφή, ενδιάμεσα τμήματα, βάση). Για την αντιμετώπιση της δυσκολίας δοκιμάστηκε η πρώτη ανακαλλιέργεια σε όλα τα θρεπτικά υποστρώματα που ελέγχθηκαν (Πίνακες 2.20, 2.23, 2.24 και 2.25) μετά από 20 και 40 ημέρες καλλιέργειας, συνδυασμένη με έκφυτα που περιλάμβαναν:

α) ένα οφθαλμό

β) ένα οφθαλμό και τμήμα του αρχικού φυταρίου γ) δύο οφθαλμούς (Singh et al. 2004)

δ) δύο οφθαλμούς και τμήμα του αρχικού φυταρίου

Μετά από πολλές δοκιμές, η εγκατάσταση του Ξινόμαυρου πραγματοποιήθηκε με χρήση εκφύτων του ενός οφθαλμού, που καλλιεργήθηκαν αρχικά σε υπόστρωμα Ξ ΕΓΚ2 (½MS) και μετά ακριβώς από 40 ημέρες ανακαλλιεργήθηκαν σε υπόστρωμα Ξ ΕΓΚ 16 (ZL + 0,4 μΜ ΒΑ + 0,005 μΜ ΝΑΑ).

2.3.3.2. Βασικό υπόστρωμα μικροπολλαπλασιασμού

Μελετήθηκε η επίδραση των έξι βασικών θρεπτικών υποστρωμάτων που δοκιμάστηκαν και στην περίπτωση του Αγιωργίτικου (κεφάλαιο 2.3.1.2), καθώς και του υποστρώματος Zlenco (ZL) (Zlenco et al. 1995), εμπλουτισμένα με 0,01 μM BA και 0,005 μM NAA για τον in vitro πολλαπλασιασμό των εκφύτων της ποικιλίας Ξινόμαυρο. Ως καταλληλότερο υπόστρωμα για το Ξινόμαυρο

αποδείχθηκε το ZL, το οποίο χρησιμοποιήθηκε και στον περαιτέρω πειραματισμό, εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό.

2.3.3.3. Επίδραση των ρυθμιστών ανάπτυξης

Η επίδραση των ρυθμιστών ανάπτυξης (ΒΑ και ΝΑΑ) μελετήθηκε σε υπόστρωμα ZL, το οποίο αποδείχθηκε καταλληλότερο για το μικροπολλαπλασιασμό του Ξινόμαυρου (κεφάλαιο 2.3.3.2). Οι συγκεντρώσεις της ΒΑ που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 0,05, 0,1, 0,15, 0,35, 0,7, 1,4 και 2,8 μM. Η αλληλεπίδραση BA-ΝΑΑ έγινε σε συγκεντρώσεις 0,05 - 0,15 μM ΒΑ σε συνδυασμό με 0,005, 0,015 και 0,03 μM NAA (Heloir et al. 1997). Οι συγκεντρώσεις των ρυθμιστών ανάπτυξης που μελετήθηκαν προέκυψαν μετά από προκαταρκτικό πειραματισμό, όπου φάνηκε ότι δεν δημιουργούσαν εκτεταμένη παρακμή των εκφύτων-φυταρίων στην περίπτωση της BA, και παράλληλα δεν προκαλούσαν τη δημιουργία μεγάλων κάλλων στη βάση του βλαστού. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε θρεπτικό μέσο ZL χωρίς ορμόνες.

2.3.3.4. Επίδραση της θερμοκρασίας

Μελετήθηκε η επίδραση υψηλότερης (26±2^oC) και χαμηλότερης (21±2^oC) θερμοκρασίας στο μικροπολλαπλασιασμό του Ξινόμαυρου σε θρεπτικό υπόστρωμα ZL (Galzy et al. 1990, Ibáñez et al. 2005) εφοδιασμένο με 0,01 μM BA and 0,005 µM NAA.

2.3.3.5. Ριζοβολία in vitro και σκληραγώγηση

Η ριζοβολία και η σκληραγώγηση πραγματοποιήθηκε όπως στην περίπτωση του Αγιωργίτικου (κεφάλαιο 2.3.1.5).

2.3.4. Πειραματικός σχεδιασμός

Στη φάση της εγκατάστασης τα έκφυτα που χρησιμοποιήθηκαν σε όλες τις μεταχειρίσεις και για τις τρεις ποικιλίες τοποθετήθηκαν για 40 ημέρες (εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό) σε σωλήνες 20 mm x 100 mm που περιείχαν 10 ml από το θρεπτικό μέσο (Πίνακας 2.20-2.24). Ακολούθησε η ανάπτυξη των

εκφύτων σε θάλαμο, όπου οι συνθήκες ήταν ακτινοβολία 40 μmol m^-2 s^-1 (Galzy and Compan 1988), θερμοκρασία 21±2^οC και φωτοπερίοδος 16 ώρες.

Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν έκφυτα ενός γονάτου (ενός οφθαλμού) μήκους 1 cm, τα οποία συλλέχθηκαν τυχαία από το βασικό πειραματικό υλικό. Σε κάθε μεταχείριση χρησιμοποιήθηκαν πέντε βάζα των 10 εκφύτων και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές. Όλα τα θρεπτικά μέσα περιείχαν 3% (w/v) σακχαρόζη, 0,6% (w/v) άγαρ (B & V S. r .L., τύπος S 1000) και το pH ρυθμίστηκε στο 5,9 πριν την αποστείρωση. Η διατήρηση των καλλιεργειών έγινε στους θαλάμους ανάπτυξης της εταιρίας με κοινές λάμπες φθορισμού με ένταση 40 μmol m^-2 s^-1, όπου η θερμοκρασία ήταν 21±2^oC, και η φωτοπερίοδος 16 ώρες.

Τα πειράματα στα οποία μελετήθηκε η επίδραση (α) των διαφορετικών βασικών υποστρωμάτων και (β) των ρυθμιστών ανάπτυξης στον πολλαπλασιασμό των βλαστών διήρκησαν 40 ημέρες. Τα μετρήσιμα μορφολογικά χαρακτηριστικά που καταγράφηκαν αφορούσαν:

(α) στον αριθμό των νέων βλαστών,

(β) στο ύψος του νέου βλαστού (από τη βάση μέχρι τον τελευταίο ορατό οφθαλμό),

(γ) στον αριθμό των οφθαλμών, (δ) στον αριθμό των ριζών, και (ε) στο μήκος των ριζών.

Από επεξεργασία αυτών των στοιχείων προέκυψαν: (α) το μεσογονάτιο διάστημα (που υπολογίζεται από τη διαίρεση του ύψους του νέου βλαστού δια του αριθμού των οφθαλμών), και (β) ο ρυθμός ανάπτυξης (που υπολογίζεται από τον πολλαπλασιασμό του αριθμού των βλαστών επί τον αριθμό των οφθαλμών). Τα στοιχεία που συλλέχθηκαν αφορούσαν μόνο τους βλαστούς με ύψος και μήκος ρίζας μεγαλύτερα του 0,5 cm.

Η μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας έγινε στους 21±2^oC και στους 26±2^oC και η καταγραφή των στοιχείων έγινε κάθε 20, 30, 40, 50 και 60 ημέρες καλλιέργειας. Τα πειράματα της ριζοβολίας διεξήχθησαν στους 22±2^oC και είχαν διάρκεια 18 ημέρες και στους 26±2^oC για 10 ημέρες. Στο τέλος αυτών των περιόδων μετρήθηκαν: (α) ο αριθμός και (β) το μήκος των ριζών, για ρίζες

με μήκος μεγαλύτερο του 1 mm. Στα πειράματα ριζοβολίας ενδιαφέρει η έκπτυξη των νέων ριζών και όχι το μήκος τους, χαρακτηριστικό που προτιμάται να έχει μικρές τιμές καθώς διαφορετικά παρουσιάζονται προβλήματα κατά το στάδιο του εγκλιματισμού (Γρηγοριάδου, προσωπική επικοινωνία). Η περίοδος του εγκλιματισμού είχε διάρκεια 30 ημερών και τα φυτά αξιολογούνταν κάθε 10 ημέρες ως προς την επιβίωση. Στο τέλος της διαδικασίας καταγράφηκαν:

(α) ο αριθμός των νέων βλαστών,

(β) το ύψος του νέου βλαστού (από τη βάση του μέχρι τον τελευταίο ορατό οφθαλμό),

(γ) ο αριθμός των οφθαλμών καθώς, και

(δ) η επιβίωση των φυτών εκφρασμένη ως ποσοστό %.

Για όλα τα πειράματα οι μετρήσεις (α) του ύψους του νέου βλαστού, (β) του αριθμού των οφθαλμών, (γ) του μεσογονάτιου διαστήματος, και (δ) του μήκους των ριζών αναφέρονται στο μέσο όρο του αριθμού των νέων βλαστών και νέων ριζών, αντίστοιχα. Η στατιστική ανάλυση των μεταβλητών πραγματοποιήθηκε με το General Linear Model Procedure (SPSS 8.0) και ο διαχωρισμός των μέσων όρων με το τεστ Duncan (P<0,05). Στα πειράματα που αφορούσαν στην επίδραση της θερμοκρασίας η ανάλυση έγινε με το Student’s t-test (P<0,05). Ελήφθησαν ψηφιακές φωτογραφίες με φωτογραφική μηχανή Sony Cyber-Shot (9.0 Mega pixels).

2.4. Εξυγίανση

Όπως ήδη αναφέρθηκε (κεφάλαιο 1.4) η απαλλαγή του φυτικού υλικού από τους ιούς GLRaV θεωρείται σχετικά εύκολη (Mannini 2003), η διαδικασία όμως εμφανίζει πληθώρα προβλημάτων όσον αφορά στον ιό GRSPaV (Minafra and Boscia 2003, Gribaudo et al. 2006). Η εξυγίανση των φυτών μελετήθηκε με δύο τρόπους: α) με συνδυασμό εφαρμογής θερμοθεραπείας και καλλιέργειας μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών (Grammatikaki et al. 2005, Skiada et al.

2009), και β) με τη χρήση αντι-ιικών ουσιών (Panattoni et al. 2007a, b).

2.4.1. Συνδυασμός θερμοθεραπείας και καλλιέργειας μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών

2.4.1.1. Θερμοθεραπεία

Η θερμοθεραπεία πραγματοποιήθηκε και για τις τρεις ποικιλίες σύμφωνα με το πρωτόκολλο όπου εφαρμόζεται διαφορετική θερμοκρασία κατά τη διάρκεια της ημέρας και της νύχτας (Stein et al. 1991, από George 1993).

Έκφυτα και των τριών ποικιλιών μήκους 1 cm, τα οποία επιλέχθηκαν τυχαία από το βασικό πολλαπλασιαστικό υλικό που είχε αναπτυχθεί για την κάθε ποικιλία, μεταφέρθηκαν στο θρεπτικό υπόστρωμα που βρέθηκε ως καταλληλότερο για την καλλιέργειά τους (Πίνακας 2.26). Σε κάθε βάζο τοποθετήθηκαν 10 έκφυτα και συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 260 έκφυτα για το Αγιωργίτικο, 350 για τη Μαλαγουζιά και 90 για το Ξινόμαυρο.

Για τη Μαλαγουζιά χρησιμοποιήθηκαν τα περισσότερα έκφυτα, καθώς παρουσιάστηκαν προβλήματα κατά την εφαρμογή της μεθόδου που εντοπίζονταν:

α) στην έντονη καταπόνηση των εκφύτων από τις υψηλές θερμοκρασίες με αποτέλεσμα τη νέκρωσή τους,

β) σε διάφορες επιμολύνσεις από βακτήρια και μύκητες,

γ) στην έντονη καλλογένεση μετά την καλλιέργεια μεριστωμάτων που προκάλεσε αναστολή της βλαστογένεσης,

δ) στην έντονη υπερυδάτωση των φυταρίων μετά από καλλιέργεια μεριστωμάτων, η οποία είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη ακατάλληλων βλαστών, και

ε) στην έντονη χλώρωση μετά από την καλλιέργεια των βλαστικών κορυφών που προκαλούσε τη νέκρωσή τους.

Ο μικρός αριθμός εκφύτων Ξινόμαυρου που χρησιμοποιήθηκε οφείλεται στις δυσκολίες που προέκυψαν:

α) κατά την αρχική in vitro εγκατάσταση της ποικιλίας (κεφάλαιο 2.3.3.1, 3.2.3.1), και

β) κατά τη δημιουργία βασικού πολλαπλασιαστικού υλικού, που προκάλεσαν καθυστέρηση στην παραγωγή επαρκούς φυτικού υλικού για πειραματισμό (κεφάλαιο 2.3.3.1).

Τα έκφυτα τοποθετήθηκαν για έξι εβδομάδες στο θάλαμο ανάπτυξης Percival Scientific, I-36LLVL, όπου οι αρχικές συνθήκες ήταν 26±0,5^oC κατά τη διάρκεια της ημέρας και 23±0,5^oC για τη νύχτα, 16 ώρες φωτοπερίοδος και ένταση φωτισμού 40 μmol m^-2 s^-1. Κατά τη διάρκεια της μεθόδου η θερμοκρασία τόσο της ημέρας όσο και της νύχτας αυξανόταν σταδιακά κατά 3^oC ανά εβδομάδα. Οι τελικές θερμοκρασίες που εφαρμόστηκαν ήταν στην περίπτωση του Αγιωργίτικου 40±0,5^oC για την ημέρα και 37±0,5^oC για τη νύχτα, ενώ για τη Μαλαγουζιά και το Ξινόμαυρο 36±0,5^oC για την ημέρα και 33±0,5^oC για τη νύχτα, εξαιτίας της έντονης καταπόνησης και παρακμής που παρατηρήθηκαν στα φυτάρια. Η διαδικασία επαναλήφθηκε δύο φορές για το Αγιωργίτικο, τέσσερις για τη Μαλαγουζιά και μία φορά για το Ξινόμαυρο.

2.4.1.2. Λήψη και καλλιέργεια επάκριων μεριστωμάτων

Μετά το τέλος της θερμοθεραπείας, αποκόπηκαν δύο τύποι ιστών από τα φυτάρια, αφού πρώτα έγινε αξιολόγηση της φυσιολογικής τους κατάστασης σε ζωντανά και νεκρά. Οι ιστοί αποχωρίστηκαν μόνο από τα εύρωστα φυτάρια που δεν εμφάνιζαν σημάδια νέκρωσης στην περιοχή της κορυφής. Επάκρια μεριστώματα μήκους 0,1-0,2 mm αποκόπηκαν με τη βοήθεια αποστειρωμένης λαβίδας και αυτοσχέδιου εργαλείου (Εικόνα 2.12) που έφερε μύτη από βελόνα σύριγγας για υποδόριες ενέσεις ινσουλίνης, κάτω από στερεοσκόπιο ZEISS Stemi 2001-C, αφού αφαιρέθηκαν τα πρώτα φύλλα (Εικόνα 2.13 α-δ). Η λήψη των φωτογραφιών έγινε με φωτογραφική Contax, Aria και φιλμ Kodak (GB 200-7).

Για το Αγιωργίτικο έγινε λήψη 61 μεριστωμάτων, για τη Μαλαγουζιά 110 και για το Ξινόμαυρο 30. Από προκαταρκτικά πειράματα, όπως είναι γνωστό και από τη βιβλιογραφία (από George 1993), φάνηκε ότι η ανάπτυξη και βιωσιμότητα των μεριστωμάτων επηρεάζεται από την παρουσία των τελευταίων καταβολών των φύλλων (leaf primordia), αφού απουσία τους τα μεριστώματα νεκρώνονται.

Εικόνα 2.12: Αυτοσχέδιο εργαλείο λήψης επάκριου μεριστώματος (Από Ν.

Λεβεντάκης).

Figure 2.12: Handmade tool for apical meristem cuttings (From N. Leventakis).

Εικόνα 2.13: Επάκριο μερίστωμα: α) βλαστική κορυφή πριν τη λήψη του μεριστώματος, β, γ) απομάκρυνση των φύλλων, δ) επάκριο μερίστωμα.

Figure 2.13: Apical meristem: α) shoot before meristem cutting, β, γ) leaf removal, δ) meristem.

Τα μεριστώματα τοποθετήθηκαν σε σωλήνες που περιείχαν τα υποστρώματα ΕΜ1-ΕΜ5 (Πίνακας 2.26). Τα μεριστώματα τοποθετήθηκαν σε

α β γ δ

όλη τη διάρκεια της καλλιέργειας στα υποστρώματα ΕΜ3-5, ενώ η καλλιέργειά τους διήρκησε 4 εβδομάδες στο ΕΜ1 και στη συνέχεια όσα μεριστώματα επιβίωσαν ανακαλλιεργήθηκαν στο ΕΜ2 (Γραμματικάκη και συν. 2005). Τα μεριστώματα της ποικιλίας Αγιωργίτικο και Μαλαγουζια τοποθετήθηκαν στα υποστρώματα ΕΜ1-5, ενώ η μεριστωματική καλλιέργεια της ποικιλίας Ξινόμαυρο έγινε στο υπόστρωμα ΕΜ4 (Πίνακας 2.26). Η καλλιέργεια των μεριστωμάτων έγινε στο θάλαμο ανάπτυξης Percival Scientific, I-36LLVL, όπου οι συνθήκες ήταν 26±0,5^oC κατά τη διάρκεια ημέρας και νύχτας, 16 ώρες φωτοπερίοδος και ένταση φωτισμού 40 μmol m^-2 s¹. Κάθε προσπάθεια καλλιέργειας μεριστωμάτων σε θερμοκρασία χαμηλότερη από τους 26^oC, που έγινε σε προκαταρκτικά πειράματα, έδειξε ότι δεν ήταν εφικτή η ανάπτυξή τους.

Μετά την πάροδο τεσσάρων εβδομάδων ανάπτυξης διορθώθηκε ο κατακόρυφος προσανατολισμός των υπό ανάπτυξη μεριστωμάτων, ώστε οι κορυφές τους να μην έχουν επαφή με το υπόστρωμα. Αυτό ήταν απαραίτητο, καθώς σε αντίθετη περίπτωση προκαλείτο υπερυδάτωση στα αναπτυσσόμενα μεριστώματα με αποτέλεσμα το μη αντιστρεπτό μαρασμό και τελικά τη νέκρωσή τους. Στις οχτώ εβδομάδες τα υπό ανάπτυξη μεριστώματα μεταφέρθηκαν στο υπόστρωμα που είχε αποδειχθεί καταλληλότερο για την κάθε ποικιλία (Πίνακας 2.27), όμως παρέμειναν στο θάλαμο στους 26±0,5^oC.

Μετά τις 12 εβδομάδες καλλιέργειας, και αφού είχαν μήκος βλαστού περί τα 2 cm, μεταφέρθηκαν σε βάζα καλλιέργειας με το ίδιο υπόστρωμα και σε θάλαμο με θερμοκρασία 21±2^oC, 16 ώρες φωτοπερίοδο και ένταση φωτισμού 40 μmol m^-2 s^-1. Μετά την πάροδο 6 εβδομάδων είχε δημιουργηθεί επαρκές φυτικό υλικό ώστε να ελεγχθεί ιολογικά.

2.4.1.3. Λήψη και καλλιέργεια βλαστικών κορυφών

Βλαστικές κορυφές μήκους 0,5 cm που προέρχονται από τον κορυφαίο οφθαλμό, αποκόπηκαν και αφού αφαιρέθηκαν τα φύλλα, όπως στην Εικόνα 2.13α, β, μεταφέρθηκαν σε βάζα καλλιέργειας που περιείχαν το κατάλληλο υπόστρωμα για την ανάπτυξη της κάθε ποικιλίας (Πίνακας 2.27). Η αφαίρεση των φύλλων ήταν απαραίτητη, καθώς σε περίπτωση που αυτά εφάπτονταν στο υπόστρωμα καλλιέργειας προκαλείτο εκτεταμένη υπερυδάτωση στα έκφυτα

που οδηγούσε στο μαρασμό και τη νέκρωσή τους. Τα βάζα τοποθετήθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης με θερμοκρασία 21±2^oC, 16 ώρες φωτοπερίοδο και ένταση φωτισμού 40 μmol m^-2 s^-1. Έξι εβδομάδες αργότερα υπήρχε διαθέσιμο επαρκές φυτικό υλικό για να ελεγχθεί ιολογικά, σύμφωνα με τη μέθοδο της ένθετης RT- PCR που περιγράφεται στο κεφάλαιο 2.2.2.

2.4.2. Χρήση αντι-ιικών ουσιών

Έγινε η χρήση των ουσιών Tiazofurin (Tr) (Kirsi et al. 1983), Ribavirin (Rb) (Schuster, 1976) και Mycophenolic acid (MPA) (Allison and Eugui 2000), οι οποίες έχουν αντι-ιική δράση και στοχεύουν στην αναστολή της βιοσύνθεσης των πουρινών, άμεσα της γουανίνης και έμμεσα της αδενίνης (Shu and Nair, 2008), προκαλώντας αύξηση στο ρυθμό μεταλλαξιγένεσης στους RNA ιούς.

2.4.2.1. Φυτικό υλικό και υπόστρωμα καλλιέργειας

Χρησιμοποιήθηκαν έκφυτα της ποικιλίας Αγιωργίτικο και Μαλαγουζιά μήκους 1 cm. Η επιλογή ήταν τυχαία και προερχόταν από το βασικό πολλαπλασιαστικό υλικό που είχε αναπτυχθεί μετά την εφαρμογή θερμοθεραπείας για το Αγιωργίτικο και ήταν προσβεβλημένα μόνο από τον GRSPaV και από το βασικό πολλαπλασιαστικό υλικό για τη Μαλαγουζιά, στο οποίο εντοπίστηκε ο ίδιος ιός. Ο έλεγχος έγινε σύμφωνα με το κεφάλαιο 2.2.2.

Ο λόγος που επιλέχθηκαν τα έκφυτα Αγιωργίτικου μετά από θερμοθεραπεία ήταν ώστε:

α) να μην επηρεαστεί η αντι-ιική ιδιότητα των ουσιών από τη μεικτή ιική μόλυνση που παρουσιάστηκε στο Αγιωργίτικο (GRSPaV και GLRaV-1),

β) να φανεί η αντι-ιική ιδιότητα της κάθε ουσίας προς τον ίδιο ιό ανάλογα με την ποικιλία, και

γ) να φανεί η φυτοτοξικότητα της κάθε ουσίας ανάλογα με την ποικιλία.

Η εξυγίανση με τη χρήση αντι-ιικών δεν πραγματοποιήθηκε στο Ξινόμαυρο, γιατί κατά το διάστημα του πειραματισμού δεν υπήρχε επαρκές φυτικό υλικό για την ποικιλία αυτή.

Σε κάθε βάζο και στο κατάλληλο υπόστρωμα καλλιέργειας για την κάθε ποικιλία (Πίνακας 2.27) τοποθετήθηκαν 30 έκφυτα, αφού πρώτα εφαρμόστηκε

η κατάλληλη συγκέντρωση του κάθε αντι-ιικού (κεφάλαιο 2.4.2.2.). Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 60 έκφυτα για κάθε μεταχείριση σε κάθε ποικιλία.

2.4.2.2. Εφαρμογή των αντι-ιικών ουσιών

Τα αντι-ιικά Ribavirin και Mycophenolic acid αγοράστηκαν από τη Sigma–Aldrich (St. Louis, MO), ενώ το Tiazofurin παραχωρήθηκε ευγενικά από τον καθηγητή Jayaram HN (Indiana University, School of Medicine, Indianapolis, Indiana, USA). Για το Αγιωργίτικο χρησιμοποιήθηκαν και οι τρεις ουσίες, ενώ στη Μαλαγουζιά εφαρμόστηκαν μόνο το Tiazofurin και το Mycophenolic acid εξαιτίας:

α) της υπερευαισθησίας που επέδειξε γενικά η ποικιλία σε συνθήκες καταπόνησης,

β) της έντονης φυτοτοξικότητας που προκάλεσε το Ribavirin σε άλλες ποικιλίες αμπέλου σύμφωνα με τη βιβλιογραφία (Panattoni et al. 2007b), και

γ) της περιορισμένης ποσότητας Ribavirin που υπήρχε.

Οι συγκεντρώσεις όλων των αντι-ιικών που εφαρμόστηκαν ήταν 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60 και 80 μg/ml. Επίσης, μελετήθηκε η συνδυαστική δράση των αντι-ιικών Tiazofurin και Ribavirin με το Mycophenolic acid σε συγκεντρώσεις 20 μg/ml Tiazofurin και Ribavirin με 40 ή 60 μg/ml Mycophenolic acid. Τα διαλύματα των αντι-ιικών ουσιών δημιουργήθηκαν μόλις πριν την εφαρμογή τους και αποστειρώθηκαν με τη χρήση υπερ-λεπτών φίλτρων 0,2 μm (Schleicher and Schuell). Η διάλυση των Tiazofurin και Ribavirin έγινε σε αποστειρωμένο και απιονισμένο νερό, ενώ το Mycophenolic acid σε 100%

αιθανόλη. Η κατάλληλη ποσότητα του αντι-ιικού διαλύματος (που βρέθηκε από προκαταρκτικά πειράματα ώστε να διαχέεται ομοιόμορφα σε όλο το υπόστρωμα και περιείχε την κατάλληλη συγκέντρωση της ουσίας), απλώθηκε με αποστειρωμένη πιπέτα pasteur στην επιφάνεια του υποστρώματος και αφού αφέθηκε να στεγνώσει σε ασηπτικές συνθήκες, στη συνέχεια τοποθετήθηκαν τα έκφυτα. Σε κάθε περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν φυτά-μάρτυρες, τα οποία καλλιεργήθηκαν στο κατάλληλο υπόστρωμα (Πίνακας 2.27) για την κάθε ποικιλία απουσία αντι-ιικών ουσιών.

Η διάρκεια της μεθόδου ήταν 80 ημέρες και αποτελείτο από δύο ανακαλλιέργειες. Η φυτοτοξικότητα που προκάλεσε η κάθε ουσία σε κάθε μία από τις ποικιλίες εκτιμήθηκε με την καταμέτρηση των νεκρωμένων εκφύτων που υπήρχαν σε κάθε συγκέντρωση στο τέλος της πρώτης ανακαλλιέργειας (μετά από 40 ημέρες), προς τον αριθμό των εκφύτων που τοποθετήθηκαν αρχικά.

Μετά το τέλος των 80 ημερών καλλιέργειας, το κορυφαίο τμήμα από κάθε φυτάριο που επιβίωσε τοποθετήθηκε στο κατάλληλο υπόστρωμα για την κάθε ποικιλία (Πίνακας 2.27), που όμως δεν περιείχε αντι-ιικά. Ο λόγος που επιλέχθηκε η καλλιέργεια μόνο του κορυφαίου τμήματος κάθε φυταρίου μετά την καλλιέργεια παρουσία αντι-ιικών ουσιών, ήταν γιατί σε καμία των περιπτώσεων που ελέγχθηκαν δεν εμφανίστηκαν ενδείξεις καταπόνησης και νέκρωσης. Τα έκφυτα που τοποθετήθηκαν αρχικά στις αυξημένες συγκεντρώσεις των αντι-ιικών και δεν είχαν βλαστήσει αλλά δεν είχαν νεκρωθεί (τόσο τα ίδια, όσο και οι οφθαλμοί τους), μεταφέρθηκαν επίσης σε νέα υποστρώματα αφού πρώτα έγινε ανανέωση της βάσης τους. Μετά το τέλος της εφαρμογής της χημειοθεραπείας ακολούθησαν δύο ανακαλλιέργειες των 40 ημερών στο κατάλληλο υπόστρωμα για την κάθε ποικιλία (Πίνακας 2.27) και στη συνέχεια από τα φυτάρια που προέκυψαν έγινε λήψη φυτικού υλικού για ιολογικό έλεγχο, σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στο κεφάλαιο 2.2.2.

2.5. Μικροσκοπία

Για τις ανάγκες της παρούσας διατριβής εφαρμόστηκε οπτική μικροσκοπία φωτεινού πεδίου και ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (από Ελευθερίου 1993, 2007, από Ελευθερίου και συν. 2000).

2.5.1. Φυτικό υλικό

Χρησιμοποιήθηκαν φυτά της ποικιλίας Αγιωργίτικο, τα οποία:

α) είχαν εξυγιανθεί μετά από εφαρμογή θερμοθεραπείας, βρίσκονταν σε γλάστρες και είχαν ηλικία ενός έτους,

β) ήταν ιωμένα μόνο από τον GRSPaV μετά από εφαρμογή θερμοθεραπείας, βρίσκονταν σε γλάστρες και είχαν ηλικία ενός έτους,

γ) ήταν ιωμένα μόνο από τον GRSPaV μετά από εφαρμογή θερμοθεραπείας, βρίσκονταν σε βάζα καλλιέργειας in vitro και το χρονικό διάστημα που μεσολάβησε από την προηγούμενη ανακαλλιέργεια ήταν 40 ημέρες, και

δ) είχαν εξυγιανθεί μετά από εφαρμογή χημειοθεραπείας, με τη χρήση 20 μg/ml Tiazofurin και 40 μg/ml Mycophenolic acid, βρίσκονταν σε βάζα καλλιέργειας in vitro και το χρονικό διάστημα που μεσολάβησε από την προηγούμενη ανακαλλιέργεια ήταν 40 ημέρες.

Και για τις τέσσερις περιπτώσεις πραγματοποιήθηκε λήψη φυτικού υλικού που περιλάμβανε το πέμπτο (νεαρό) και το ένατο (ώριμο) φύλλο από την κορυφή και αποτελείτο από τη νεύρωση, το έλασμα και το μίσχο του. Οι περιοχές του φύλλου που επιλέχθηκαν βρίσκονταν κοντά στο μίσχο, καθώς η περιοχή αυτή έδινε πάντα θετικό σήμα στους ιολογικούς ελέγχους με RT-PCR.

Ο μίσχος κόπηκε κατά μήκος και εγκάρσια, ώστε να εξασφαλιστεί η καλύτερη εμπότισή του. Οι κατά μήκος τομές πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τον άξονα συμμετρίας. Οι διαστάσεις των τομών ήταν 1,5 x 2 mm στην περίπτωση του ελάσματος και 2 mm μήκος για τις κυλινδρικές τομές.

2.5.2. Προετοιμασία φυτικού υλικού για παρατήρηση

Ακολούθησε η μεθοδολογία που αποσκοπούσε στη μελέτη του υλικού με οπτική και ηλεκτρονική μικροσκοπία και στηρίχθηκε στη βιβλιογραφία (Ελευθερίου 1981, 1993).

Α. Στερέωση: Χρησιμοποιήθηκε το στερεωτικό διάλυμα Karnovsky (1965) που αποτελείτο από 2% παραφορμαλδεΰδη και 3% γλουταρική αλδεΰδη σε 0,05 Μ ρυθμιστικό διάλυμα κακωδυλικού νατρίου, pH 7,0, σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε γυάλινα φιαλίδια, παρέμειναν για 3 h στο στερεωτικό διάλυμα υπό ανάδευση και ακολούθησαν τέσσερις πλύσεις με καθαρό ρυθμιστικό διάλυμα 0,05 Μ κακωδυλικού νατρίου pH 7,0 κάθε 15 min.

Β. Μεταστερέωση: Τα δείγματα βυθίστηκαν σε διάλυμα 2% τετροξειδίου του οσμίου (OsO4) σε 0,05 Μ ρυθμιστικό διάλυμα κακωδυλικού νατρίου, pH 7,0, για 3 h, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, υπό συνεχή ανάδευση. Στη συνέχεια ακολουθούσαν 4 πλύσεις με 0,05 Μ διάλυμα κακωδυλικού νατρίου, pH 7,0 ανά 15 min και παραμονή των δειγμάτων στους 4^oC για μία νύχτα.

Γ. Αφυδάτωση: Η αφυδάτωση πραγματοποιήθηκε σε σειρά διαλυμάτων ακετόνης αυξανόμενης συγκέντρωσης σε θερμοκρασία δωματίου, υπό συνεχή ανάδευση. Στο τέλος χρησιμοποιήθηκε οξείδιο του προπυλενίου. Αναλυτικά, τα δείγματα βυθίζονταν διαδοχικά σε διαλύματα:

™ Ακετόνη 30% για 30 min

™ Ακετόνη 50% για 30 min

™ Ακετόνη 70% για 45 min

™ Ακετόνη 90% για 1 h

™ Ακετόνη 100% για 1 h

™ Ακετόνη 100% για 1 h

™ Ακετόνη 100% για 2 h

™ Δύο πλύσεις με 100% οξείδιο του προπυλενίου για 15 min

Στα διαστήματα μεταξύ των αλλαγών τα δείγματα διατηρούνταν στο ψυγείο.

Δ. Εμπότιση – έγκλειση: Για την εμπότιση χρησιμοποιήθηκε η ρητίνη Durcupan ACM της εταιρίας Fluka. Η εμπότιση πραγματοποιήθηκε ως εξής:

™ Οξείδιο του προπυλενίου + ρητίνη σε αναλογία 3:1 για 2 h

™ Οξείδιο του προπυλενίου + ρητίνη σε αναλογία 1:1 για 2 h

™ Οξείδιο του προπυλενίου + ρητίνη σε αναλογία 1:3 για 2 h

™ Καθαρή ρητίνη όλη νύχτα

™ Καθαρή ρητίνη για 3 h

™ Καθαρή ρητίνη για 3 h

Η εμπότιση πραγματοποιήθηκε υπό συνεχή ανάδευση σε πλάγια θέση σε περιστροφικό αναδευτήρα, σε θερμοκρασία δωματίου.

Στη συνέχεια τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε ειδικά εκμαγεία πολυαιθυλενίου γεμάτα με ρητίνη και προσανατολίστηκαν με τη βοήθεια στερεοσκοπίου ώστε να είναι δυνατή η εγκάρσια, κατά μήκος ή εφαπτομενική κοπή των τομών στον υπερμικροτόμο. Ακολούθησε ο πολυμερισμός της ρητίνης σε κλίβανο στους 60^οC για 60 h.

Ε. Τομή, χρώση, παρατήρηση: Οι τομές του εγκλεισμένου υλικού έγιναν σε υπερμικροτόμο Reichert-Jung Ultracut E χρησιμοποιώντας γυάλινα μαχαίρια για τη λήψη ημίλεπτων τομών πάχους 0,5-2 μm και διαμάντινο μαχαίρι για την κοπή υπέρλεπτων τομών πάχους 60-90 nm (Ελευθερίου 1993).

Οι ημίλεπτες τομές συλλέχθηκαν σε αντικειμενοφόρους μικροσκοπίας, χρωματίστηκαν με 0,5% κυανούν τολουιδίνης Ο σε διάλυμα 0,5% βόρακα και χρησιμοποιήθηκαν για συγκριτική ανατομική μελέτη των ιστών και οργάνων ιωμένων και εξυγιασμένων φυτών σε οπτικό μικροσκόπιο. Χρησιμοποιήθηκαν τα οπτικά μικροσκόπια Nikon Eclipse TE 2000-S (ανάστροφο) και Zeiss Axiostar plus όπου ελήφθησαν ψηφιακές φωτογραφίες με φωτογραφική μηχανή Canon PowerShot A 640 (10.0 Mega pixels).

Οι υπέρλεπτες τομές συλλέχθηκαν σε χάλκινα πλέγματα, με τετράγωνες ή εξάγωνες οπές, καλυμμένα με υμένιο στήριξης formvar. Ακολούθησε διπλή

«ηλεκτρονική χρώση» σε 4% οξικό ουρανύλιο σε 50% αιθανόλη για 10 min και σε κιτρικό μόλυβδο κατά Reynolds (1963) για 10 min. Οι τομές μελετήθηκαν στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Zeiss EM 9S-2, και οι φωτογραφίες λήφθηκαν σε φιλμ Agfa, Scientia EM διαστάσεων 7 x 7 cm, που εμφανίσθηκαν σε εμφανιστικό D-19 της Kodak και στερεώθηκαν σε Agfa Acidofix. Ακολούθησε η ψηφιοποίηση και η επεξεργασία τους με το πρόγραμμα Adobe Photoshop CS3.

2.5.3. Μορφομετρία

Μετά από προκαταρκτική παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο φάνηκε ότι τα δείγματα και για τις τέσσερις κατηγορίες που μελετήσαμε (κεφάλαιο 2.5.1) δεν εμφάνισαν διαφορές στην περιοχή του μίσχου και του βλαστού (για τα δείγματα που προήλθαν μετά από ιστοκαλλιέργεια). Αντίθετα, με την οπτική μικροσκοπία εντοπίστηκαν διαφορές στην περιοχή του ελάσματος και για το λόγο αυτό η συγκριτική ανατομία ιωμένων και εξυγιασμένων φυτών περιορίστηκε σε αυτό τον τύπο δείγματος.

Οι φωτογραφίες που λήφθηκαν από το οπτικό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση x 40 και εκτυπώθηκαν σε εκτυπωτή HP Deskjet 5440. Στη συνέχεια εφαρμόστηκε διαφανές πλέγμα με διάσταση κελιών 0,5 x 0,5 cm και υπολογίστηκε η πυκνότητα όγκου των δομικών στοιχείων του φύλλου, δηλαδή η αναλογία του όγκου ενός συστατικού προς τον όγκο της μονάδας αναφοράς.

Η πυκνότητα όγκου υπολογίστηκε από το κλάσμα σημείων που στηρίζεται στην αρχή ότι η επιφανειακή έκταση μίας δομής σε μία λεπτή τομή είναι ανάλογη προς τον όγκο που κατέχει η δομή αυτή στο όλο κύτταρο (Steer 1981, Toth 1982, Eleftheriou 1987, Θωμόπουλος και συν. 1997).

Σε 30 διαφορετικές φωτογραφίες φύλλου για κάθε περίπτωση φυτικού υλικού υπολογίστηκε ο όγκος πυκνότητας των παρακάτω παραμέτρων ως προς το φύλλο:

α) μεσοκυττάριος χώρος, β) δρυφακτοειδές παρέγχυμα, γ) σπογγώδες παρέγχυμα, δ) επιδερμίδες,

ε) κύτταρα ταννίνης,

στ) χλωροπλάστες του δρυφακτοειδούς παρεγχύματος ανά κύτταρο δρυφακτοειδούς, και

ζ) χλωροπλάστες του σπογγώδους παρεγχύματος ανά κύτταρο σπογγώδους.

Η μελέτη έγινε με καταγραφή των σημείων διασταύρωσης του πλέγματος που συνέπιπταν με κάθε μία από τις παραπάνω παραμέτρους.

Επίσης μετρήθηκαν οι παρακάτω κυτταρικοί τύποι συγκριτικά με τη μονάδα επιφάνειας του φύλλου (mm²):

α) ο αριθμός των κυττάρων του δρυφακτοειδούς παρεγχύματος, β) ο αριθμός των κυττάρων του σπογγώδους παρεγχύματος, γ) ο αριθμός των κυττάρων ταννίνης,

δ) ο αριθμός των κυττάρων της πάνω επιδερμίδας, ε) ο αριθμός των κυττάρων της κάτω επιδερμίδας, στ) αριθμός των συνολικών κυττάρων της επιδερμίδας,

Από τα αποτελέσματα της μορφομετρίας με τη βοήθεια της οπτικής μικροσκοπίας εντοπίστηκαν διαφορές σε ό,τι αφορούσε στους χλωροπλάστες.

Για το λόγο αυτό, η χρήση της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας περιορίστηκε στη μελέτη αυτών των πλαστιδίων, συγκρίνοντας ιωμένο και εξυγιασμένο υλικό γλάστρας αλλά και ιστοκαλλιέργειας. Καταμετρήθηκαν τα πλαστοσφαιρίδια που βρέθηκαν στις κατηγορίες μελέτης και διακρίθηκαν ανάλογα με τη θέση στην οποία βρέθηκαν (δρυφακτοειδές ή σπογγώδες παρέγχυμα).

Η στατιστική ανάλυση των μεταβλητών πραγματοποιήθηκε με το General Linear Model Procedure (SPSS 8.0) και ο διαχωρισμός των μέσων όρων με το τεστ Duncan (P<0,05) και το Student’ s t-test (P<0,05).

2.6. Πίνακες Υλικών και Μεθόδων

Πίνακας 2.1: Αναλυτική σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος ομογενοποίησης για τα δείγματα της ELISA.

Table 2.1: Analytical composition of grinding buffer for ELISA samples.

Αντιδραστήριο Συγκέντρωση

Tris-HCl 0,5 M (pH 8,2)

NaCl 0,15 M

Tween 20 (Sigma) 0,1%

Polyvinylpyrrolidone (PVP) 2%

Πίνακας 2.2: Αναλυτική σύσταση του διαλύματος επίστρωσης της μικροπλάκας.

Table 2.2: Analytical composition of coating buffer of microplate.

Αντιδραστήριο Συγκέντρωση

Na2CO3 0,014 M

NaΗCO₃ 0,035 Μ

pH 9,6

Πίνακας 2.3: Αναλυτική σύσταση του διαλύματος συζευγμένου αντισώματος.

Table 2.3: Analytical composition of conjugate antibody buffer.

Αντιδραστήριο Συγκέντρωση

Phosphate Buffered Saline (PBS)-Tween μέχρι 1l Polyvinylpyrrolidone (PVP) 2%

Αλβουμίνη αυγού (Sigma) 0,2%

Πίνακας 2.4: Ο τύπος ELISA και η προέλευση των αντισωμάτων IgG που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του κάθε ιού.

Table 2.4: ELISA type and antibodies used for virus detection.

Ιός Τύπος ELISA

Προέλευση αντισωμάτων GLRaV-1 DAS Bioreba GLRaV-2 DAS Bioreba GLRaV-3 DAS Agritest

GLRaV-5 DAS Biorad

GLRaV-6 DAS Bioreba GLRaV-7 DAS Bioreba

GVA DAS Biorad

GVB ΤAS Agritest

GFLV DAS Agritest

GFkV ΤAS Agritest

ArMV DAS Bioreba

Πίνακας 2.5: Αναλυτική σύσταση του διαλύματος PBS-Tween.

Table 2.5: Analytical composition of PBS-Tween.

PBS-Tween: PBS + 0,05% (v/v) Tween (Sigma)

PBS Ποσότητα (g)

NaCl 8

KH2PO4 0,2

Na2HPO4·12H2O 2,9

KCl 0,2 Απεσταγμένο H2O Μέχρι όγκου 1l

Πίνακας 2.6: Αναλυτική σύσταση του διαλύματος υποστρώματος.

Table 2.6: Analytical composition of substrate buffer.

Αντιδραστήριο Ποσότητα (ml) Διαιθαλολαμίνη (Sigma) 97 Απεσταγμένο H2O Μέχρι όγκου 1l pH 9,8

Πίνακας 2.7: Αναλυτικά η αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των ιών των γενών Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus.

Table 2.7: Analytical sequences of primers used for generic detection of Closterovirus, Foveavirus and Vitivirus.

Ιός Εκκινητής Αλληλουχία (5’-3’) Προϊόν Βιβλιογραφία

Clostero- ιοί

HSP π1 GGIHTIGAITTYGGIACIACITT

RT-PCR/

580-620 ζβ

Dovas and Katis (2003b) HSP π1G AGTTYGGGACGACGTT

HSP κ2 GTICCICCICCNAARTC HSP κ2C GTICCICCCCCNAARTC Viti,-Fovea-

ιοί

RW π1 WGCAARGCIGGICARAC RT-PCR/

363 ζβ

Dovas and Katis (2003a) RW κ2 RMYTCICCISWRAAICKCAT

GRSPaV GRSP π1 GATGAGGTCCATTTGTTTCC RT-PCR/

339 ζβ

Meng et al.

(1999) GRSP κ1 ATCCAAAGGACCTTTTGACC

GVA GVA π1 AACCAACTGACGACGCTTCT RT-PCR/

399 ζβ

Gambino et al.

(2006) GVA κ1 ACGCGAAGTCGAACATAACC

GRSPaV GRSP π2 TGAGATGGTYGCTAATATCG RT-PCR/

242 ζβ Nakaune and Nakano (2006) GRSP κ2 CTATTAGTACGGTATTCCAG

GVA GVA π2 TTTGGGTACATCGCGTTGGT RT-PCR/

341 ζβ GVA κ2 TCTAAGCCCGACGCGGAAGT

Clostero- ιοί

HSP εστ1 TTYGGGACGACGTTYAGYAC Εστ. PCR/

500-535 ζβ

Dovas and Katis (2003b) HSP εστ2 TYGGGACGACGTTYTCNAC

GLRaV-1 LR1-εστ4 GGCTTACCYAACCCTTCCAAAG Εστ. PCR/

409

Dovas et al.

(2006) GLRaV-2 LR2-εστ5 GCAACCCACCCAACGTTTYAA Εστ. PCR/

207 GLRaV-3 LR3- εστ6 ACCTACCCACCTTTTCGGGTTAA

C

Εστ. PCR/

192 Ampelo-ιοί/

GLRaV-5 LR5clus-

nest7 GCATTGAAYTTGTTCATICCRAA Εστ. PCR/

206 Clostero-

viridae

HSP-εστ3 SCIGCIGMISWIGGYTCRTT Εστ. PCR/

500-535 ζβ HSP-εστ3G GCGGMGSWGGGPTCRTT

Viti-Fovea- ιοί

RW εστ π1 GGGGCARACIHTIGCITGYTT Εστιασμένη PCR/

198 ζβ

Dovas and Katis (2003a) RW εστ κ 1 AIGCYTCRTARTCIGAITCNGT

(W=A+T, R=A+G, M=A+C, Y=C+T, S=G+C, K=G+T, H=A+T+C, N=A+T+C+G, I=Ινοσίνη).

Πίνακας 2.8: Αναλυτική σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος ομογενοποίησης για την εκχύλιση του ολικού RNA.

Table 2.8: Analytical composition of grinding buffer for total RNA extraction.

Αντιδραστήριο Ποσότητα

EDTA 25 mM

KOAc 1 M

NaOAc 0,2 Μ, (pH 5,2)

PVP 6%

Θειοκυανούχος γουανιδίνη 0,4 Μ β-Μερκαπταιθανόλη 0,2 Μ

Πίνακας 2.9: Αναλυτική σύσταση και παρασκευή του NaI.

Table 2.9: Analytical composition and preparation of NaI.

Αντιδραστήριο Ποσότητα (g)

Na₂SO₃ 0,75

NaI 46

Η ποσότητα του Na₂SO₃ διαλύθηκε σε 40 ml απεσταγμένο νερό και σε αυτό προστέθηκε το NaI. Το διάλυμα αποθηκεύτηκε σε σκοτεινό δοχείο στους 4^οC.

Πίνακας 2.10: Αναλυτική σύσταση και παρασκευή του SiO₂. Table 2.10: Analytical composition and preparation of SiO2.

Αντιδραστήριο Ποσότητα

SiO2 60 g

Απεσταγμένο H₂O 500 + 500 ml

pH 2 Η ποσότητα του SiO2 προστέθηκε στο απεσταγμένο νερό και αφού αναδεύτηκε αφέθηκε να καθιζάνει για 24 ώρες. Στο ίζημα προστέθηκαν 500 ml νερού και το διάλυμα αναδεύτηκε καλά και αφέθηκε να καθιζάνει για 5 ώρες. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και στα περίπου 60 ml του αιωρήματος έγινε ρύθμιση του pH. Το διάλυμα αποθηκεύτηκε στους 4^οC.

Πίνακας 2.11: Αναλυτική σύσταση του διαλύματος έκπλυσης.

Table 2.11: Analytical composition of washing buffer.

Αντιδραστήριο Ποσότητα

EDTA 0,5 mM

Tris-HCl 10 mM (pH 7,5)

NaCl 50 mM

Αιθανόλη 50%

Πίνακας 2.12: Το μείγμα αντίδρασης της RT-PCR για την ανίχνευση των Clostero- ιών.

Table 2.12: RT-PCR reaction mixture for Closterovirus detection.

Αντιδραστήριο Συγκέντρωση Προέλευση

Tris-HCl (pH 8,8) 10 mM

KCl 50 mM

MgCl₂ 1,5 mM

Triton X-100 0,1% F511, Optimised Dynazyme^TM Buffer, Finnzymes, Finland Κάθε νουκλεοτίδιο (DNTP) 0,25 mM

DTT 5 mM

DMSO 5%

RNASEOUT, αναστολέας ριβονουκλεασών

12 μονάδες Invitrogen, The Netherlands

Superscript^TM II RNase H^-, αντίστροφη μεταγραφάση

0,8 μονάδες Invitrogen, The Netherlands

AMV, αντίστροφη μεταγραφάση 0,8 μονάδες Finnzymes, Finland Platinum^® Taq DNA πολυμεράση 1,5 μονάδες Invitrogen, The Netherlands

HSP π1 1 μM

HSP κ2 1,5 μM

HSP κ2C 1,5 μM

HSP π1G 0,2 μM

Εκχύλισμα RNA 2 μl

DEPC + απεσταγμένο H₂O Μέχρι όγκο 23 μl

Τελικός όγκος 25 μl

Πίνακας 2.13: Το μείγμα αντίδρασης της RT-PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση των Foveavirus και Vitivirus.

Table 2.13: RT-PCR reaction mixture for simultaneous Foveavirus and Vitivirus detection.

Αντιδραστήριο Συγκέντρωση Προέλευση

Tris-HCl (pH 8,8) 10 mM

KCl 50 mM

MgCl₂ 1,5 mM

Triton X-100 0,1 % F511, Optimised Dynazyme^TM

Buffer, Finnzymes, Finland Κάθε νουκλεοτίδιο (DNTP) 0,25 mM

DTT 5 mM

DMSO 5 %

RNASEOUT,

αναστολέας ριβονουκλεασών

12 μονάδες Life Technologies^TM MD, USA

Superscript^TM II RNase H^-, αντίστροφη μεταγραφάση

0,8 μονάδες Invitrogen, The Netherlands

AMV, αντίστροφη μεταγραφάση 1 μονάδα Finnzymes, Finland Dynazyme^TM II, DNA πολυμεράση 0,6 μονάδες Finnzymes, Finland

RW π1 1 μM

RW κ1 1,5 μM

Εκχύλισμα RNA 2 μl

DEPC + απεσταγμένο H2O Μέχρι όγκο 23 μl

Τελικός όγκος 25 μl

Πίνακας 2.14: Το προφίλ θερμοκυκλοποίησης της RT-PCR για την ανίχνευση των ιών του γένους Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus.

Table 2.14: The thermal RT-PCR profile for Closterovirus, Foveavirus and Vitivirus detection.

Ιοί των γενών Foveavirus και Vitivirus

Ιοί του γένους Closterovirus Θερμοκρασία (^oC) Χρόνος Θερμοκρασία (^oC) Χρόνος

42 60 min 42 60 min

50 2 min 94 4 min

94 4 min 95 30 sec

x 10

95 30 sec

x 40

38 30 sec

42 30 sec 72 20 sec

72 15 sec 95 30 sec

x 30

72 2 min 49 10 sec

44 10 sec

38 15 sec

72 20 sec

72 2 min

Πίνακας 2.15: Το μείγμα αντίδρασης της RT-PCR για την ανίχνευση των στελεχών του ιού GRSPaV και GVA.

Table 2.15: RT-PCR reaction mixture for the detection of GRSPaV and GVA isolates.

Αντιδραστήριο Συγκέντρωση Προέλευση

Tris-HCl (pH 8,8) 10 mM

KCl 50 mM

MgCl₂ 1,5 mM

Triton X-100 0,1% F511, Optimised

Dynazyme^TM Buffer, Finnzymes, Finland Κάθε νουκλεοτίδιο (DNTP) 0,25 mM

DTT 5 mM

DMSO 5%

RNASEOUT,

αναστολέας ριβονουκλεασών

12 μονάδες Life Technologies^TM MD, USA Superscript^TM II RNase H^-, αντίστροφη

μεταγραφάση

0,8 μονάδες Invitrogen, The Netherlands

AMV, αντίστροφη μεταγραφάση 1 μονάδα Finnzymes, Finland Dynazyme^TM II, DNA πολυμεράση 0,6 μονάδες Finnzymes, Finland

GRSP π1 ή GRSP π2 / GVA π1 ή GVA π2 1 μM

GRSP κ1 ή GRSP κ2 / GVA κ1 ή GVA κ1 1 μM

Εκχύλισμα RNA 2 μl

DEPC + απεσταγμένο H2O Μέχρι όγκο 23 μl

Τελικός όγκος 25 μl

Πίνακας 2.16: Το προφίλ θερμοκυκλοποίησης της RT-PCR για την ανίχνευση των στελεχών του ιού GRSPaV και GVA.

Table 2.16: The thermal RT-PCR profile for the detection of GRSPaV and GVA isolates.

Στελέχη του ιού GRSPaV και GVA Θερμοκρασία (^oC) Χρόνος

48 20 min

50 30 min

94 4 min

94 30 sec

x 40

50 30 sec

72 20 sec

72 2 min

Πίνακας 2.17: Το μείγμα αντίδρασης της εστιασμένης PCR για την ανίχνευση των Clostero-ιών.

Table 2.17: Nested PCR reaction mixture for Closterovirus detection.

Αντιδραστήριο Συγκέντρωση Προέλευση Tris-HCl (pH 8,8) 10 mM

KCl 50 mM

MgCl₂ 1,5 mM

Triton X-100 0,1 % F511, Optimised Dynazyme^TM Buffer, Finnzymes, Finland Κάθε νουκλεοτίδιο (DNTP) 0,2 mM

DTT 5 mM

DMSO 3 %

Dynazyme^TM II DNA πολυμεράση 1 μονάδα Finnzymes, Finland

HSP εστ1 1 μM

HSP εστ2 1 μM

LR1-nest4 0,4 μM

LR2-nest5 0,4 μM

LR3-nest6 0,2 μM

LR5clus-nest7 0,8 μM

HSP-nest3 2 μM

HSP-nest3G 2 μM

Εκχύλισμα RNA 1 μl

DEPC+απεσταγμένο H2O Μέχρι όγκο 19 μl

Τελικός όγκος 20 μl

Πίνακας 2.18: Το προφίλ θερμοκυκλοποίησης της εστιασμένης PCR για την ανίχνευση των ιών των γενών Foveavirus, Vitivirus και Closterovirus.

Table 2.18: Thermal nested-PCR profile for the detection of Foveavirus, Vitivirus and Closterovirus.

Ιοί του γένους Foveavirus και Vitivirus

Ιοί του γένους Closterovirus Θερμοκρασία (^oC) Χρόνος Θερμοκρασία (^oC) Χρόνος

95 3 min 94 3 min

95 30 sec

x 5

95 30 sec

x 5

49 10 sec 48 30 sec

72 10 sec 72 20 sec

95 20 sec

x 39

95 30 sec

x 35

54 20 sec 58 10 sec

72 10 sec 53 10 sec

72 2 min 48 10 sec

72 20 sec

72 2 min

Πίνακας 2.19: Αναλυτική σύσταση του διαλύματος 50 Χ TAE.

Table 2.19: Analytical composition of 50 Χ TAE.

Αντιδραστήριο Ποσότητα

Tris-base 242 g

Οξικό οξύ 57,1 ml

EDTA (0.5 M, pH 8) 100 ml Για 1 Χ: 10 ml από ΤΑΕ 50 Χ + 490 ml απεσταγμένο Η2Ο

Πίνακας 2.20. Αναλυτική σύσταση (mg/l) των θρεπτικών υποστρωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για τoν in vitro πολλαπλασιασμό των ποικιλιών αμπέλου Αγιωργίτικο, Μαλαγουζιά και Ξινόμαυρο.

Table 2.20. Analytical composition (mg/l) of basal substrates used for the in vitro micropropagation of the grapevine varieties Agiorgitiko, Malagouzia and Xinomavro.

Συστατικά MS (Murashige &

Skoog 1962)

WPM (Lloyd &

McCown 1981)

QL (Quoirin &

Lepoivre 1977)

GAL (Galzy et

al. 1990)

ZL (Zlenco et

al. 1995) Μακροστοιχεία

KNO3 1900 - 1800 1011 922

Ca(NO3)2 · 4H2O - 556 1200 495 -

NH4NO3 1650 400 400 160 308

KH2PO4 170 170 270 122 122

K2SO4 - 990 - - -

CaCl2 · 2H2O 440 96 - - 331

MgSO4 · 7H2O 370 370 360 123 597

Μικροστοιχεία

MnSO4 · H2O - 22,3 - 0,61

MnSO4 · 4H2O 22,3 - 1 - 5,58

ZnSO4 · 7H2O 8,6 8,6 8,6 0,057 2,15

H3BO3 6,2 6,2 6,2 0,025 1,55

KJ 0,83 - 0,08 0,25 0,21

CuSO4 · 5H2O 0,025 0,25 0,025 0,025 0,0063 Na2MoO4 · 2H2O 0,25 0,25 0,25 0,024 0,063

CoCl2 · 6H2O 0,025 - 0,025 0,024 0,0063 FeSO4 · 7H2O 27,8 27,8 27,8 - 6,95 Na2EDTA · 2H2O 37,3 37,3 37,3 - 9,33

NiCl2 · 6H2O - - - 0,024 -

Fe2(SO4)3 - - - 18 -

Βιταμίνες και αμινοξέα

Μυο-ινοσιτόλη 100 100 100 1 20

Θειαμίνη - HCl 0,1 10 0,4 1 0,1

Νικοτινικό οξύ 0,5 1 0,5 1 0,5

Πυριδοσίνη - HCl 0,5 1 0,5 1 0,2

Βιοτίνη - - - 0,01

Γλυκίνη - - 5 -

Ca-pantothenate - - - 0,95

Πίνακας 2.21. Αναλυτική σύσταση των υποστρωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την in vitro εγκατάσταση των εκφύτων της ποικιλίας Αγιωργίτικο.

Table 2.21. Analytical composition of the substrates used for the in vitro establishment of the grapevine variety Agiorgitiko explants.

AΓ ΕΓΚ 1 AΓ ΕΓΚ 2 AΓ ΕΓΚ 3 AΓ ΕΓΚ 4 AΓ ΕΓΚ 5 AΓ ΕΓΚ 6 AΓ ΕΓΚ 7 AΓ ΕΓΚ 8

Μακροστοιχεία ½ QL ½ QL ½ MS ½ MS QL QL WPM WPM

Μικροστοιχεία MS MS Chi-MS Chi-MS QL MS chi-WPM chi-WPM

Fe MS

Βιταμίνες WPM WPM WPM WPM MS WPM WPM WPM

FeSO₄ (mg/ml) 50 50 50

Na₂EDTA (mg/ml) 55 55 55

BA (μΜ) 4,5 4,5 4,5 4,5

NAA (μΜ) 2,7 2,7 2,7 2,7

Σακχαρόζη (g) 30 30 30 30 30 30 30 30

Άγαρ (g) 6 6 6 6 6 6 6 6

pH 5,75 5,75 5,75 5,75 5,9 5,9 5,9 5,9

ΑΓ: Αγιωργίτικο ΕΓΚ: Εγκατάσταση

Πίνακας 2.22. Αναλυτική σύσταση των υποστρωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την in vitro εγκατάσταση των εκφύτων της ποικιλίας Μαλαγουζιά.

Table 2.22. Analytical composition of the substrates used for the in vitro establishment of the grapevine variety Malagouzia explants.

Μ ΕΓΚ 1 Μ ΕΓΚ 2 Μ ΕΓΚ 3 Μ ΕΓΚ 4 Μ ΕΓΚ 5 Μ ΕΓΚ 6 Μ ΕΓΚ 7 Μ ΕΓΚ 8 Μ ΕΓΚ 9

Μακροστοιχεία ½ QL ½ QL ½ MS ½ MS QL QL WPM WPM WPM

Μικροστοιχεία MS MS Chi-MS Chi-MS QL MS chi-WPM chi-WPM chi-WPM

Fe MS MS

Βιταμίνες WPM WPM WPM WPM MS WPM WPM WPM MS

FeSO4(mg/ml) 50 50 50

Na2EDTA(mg/ml) 55 55 55

BA (μΜ) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,13

NAA (μΜ) 0,005 0,005 0,005 0,005 0,16

Σακχαρόζη (g) 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Άγαρ (g) 6 6 6 6 6 6 6 6 6

pH 5,75 5,75 5,75 5,75 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9

Μ: Μαλαγουζιά ΕΓΚ: Εγκατάσταση

Πίνακας 2.23. Αναλυτική σύσταση των υποστρωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την in vitro εγκατάσταση των εκφύτων της ποικιλίας Ξινόμαυρο.

Table 2.23 Analytical composition of the substrates used for the in vitro establishment of the grapevine variety Xinomavro explants.

Ξ ΕΓΚ 1 Ξ ΕΓΚ 2 Ξ ΕΓΚ 3 Ξ ΕΓΚ 4 Ξ ΕΓΚ 5 Ξ ΕΓΚ 6 Ξ ΕΓΚ 7 Ξ ΕΓΚ 8 Ξ ΕΓΚ 9

Μακροστοιχεία WPM ½ MS MS ZL ZL ZL ZL ZL ZL

Μικροστοιχεία Chi-WPM Chi-MS Chi-MS ¼ Chi- MS ¼ Chi- MS ¼ Chi- MS ¼ Chi- MS ¼ Chi- MS ¼ Chi- MS

Βιταμίνες WPM MS MS ZL ZL ZL ZL ZL ZL

BA (μΜ) 0,06 0,4 0,2 0,8 0,2 0,4 0,4

NAA (μΜ) 0,03 0,08 0,08 0,003 0,03 0,05 0,003

Σακχαρόζη (g) 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Άγαρ (g) 6 6 6 6 6 6 6 6 6

pH 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9

Ξ: Ξινόμαυρο ΕΓΚ: Εγκατάσταση

Πίνακας 2.24. Αναλυτική σύσταση των υποστρωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την in vitro εγκατάσταση των εκφύτων της ποικιλίας Ξινόμαυρο.

Table 2.24. Analytical composition of the substrates used for the in vitro establishment of the grapevine variety Xinomavro explants.

Ξ ΕΓΚ 10 Ξ ΕΓΚ 11 Ξ ΕΓΚ 12 Ξ ΕΓΚ 13 Ξ ΕΓΚ 14 Ξ ΕΓΚ 15 Ξ ΕΓΚ 16 Ξ ΕΓΚ 17 Ξ ΕΓΚ 18 Ξ ΕΓΚ 19 Ξ ΕΓΚ 20

Μακροστοιχεία ⅔ MS ⅔ MS ⅔ MS ⅔ MS ⅔ MS ⅔ MS ZL ZL ZL ZL ZL

Μικροστοιχεία Chi-Berth Chi-Berth Chi-Berth Chi-Berth Chi-Berth Chi-Berth ¼ Chi- MS ¼ Chi- MS

¼ Chi- MS

¼ Chi- MS ¼ Chi- MS

Βιταμίνες MS MS MS MS MS MS ZL ZL ZL ZL ZL

BA (μΜ) 4 0,4 0,4 0,8 2 2 0,4 0,4 0,8 2 2

NAA (μΜ) 0,005 0,05 0,08 0,08 0,6 0,005 0,05 0,08 0,08 0,6

Σακχαρόζη (g) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Άγαρ (g) 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6

pH 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9

Ξ: Ξινόμαυρο ΕΓΚ: Εγκατάσταση

Πίνακας 2.25. Αναλυτική σύσταση (mg/l) των μικροστοιχείων BERTH (Berthelot 1934) που χρησιμοποιήθηκαν για την in vitro εγκατάσταση της ποικιλίας Ξινόμαυρο, με την τροποποίηση κατά Gautheret (1942).

Table 2.25. Analytical composition (mg/l) of micronutrients BERTH (Berthelot 1934) used for the in vitro establishment of the grapevine variety Xinomavro modified by Gautheret (1942).

Μικροστοιχεία BERTH

MnSO₄ · 4H₂O 1000

ZnSO4 · 7H2O 50

H₃BO₃ 25

KJ 250

CuSO4 · 5H2O 25

Na₂MoO₄ · 2H₂O -

CoCl2 · 6H2O 25

NiCl₂ · 6H₂O 25

Fe2(SO4)3 25

Πίνακας 2.26. Αναλυτική σύσταση των υποστρωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την in vitro εγκατάσταση των μεριστωμάτων.

Table 2.26. Analytical composition of the substrates used for the in vitro establishment of meristems.

Συστατικά ΕΜ1 EM2 ΕΜ3 ΕΜ4 ΕΜ5

Μακροστοιχεία ⅔ MS ½ MS ½ MS ½ MS WPM

Μικροστοιχεία Chi-

BERTH Chi-MS Chi-MS Chi-MS chi- WPM Fe

Βιταμίνες MS MS MS MS WPM

FeSO4 (mg/ml) Na2EDTA (mg/ml)

BA (μΜ) 8,8 4,4

NAA (μΜ) 0,55 2

Αδενίνη 29,5

Κινιτίνη 2,5

Σακχαρόζη (g) 30 30 30 30 30

Άγαρ (g) 6 6 6 6 6

pH 5,9 5,9 5,9 5,75 5,75

Πίνακας 2.27: Υπόστρωμα in vitro καλλιέργειας της κάθε ποικιλίας αμπέλου κατά τη διάρκεια της θερμοθεραπείας.

Table 2.27: In vitro culture medium for each grapevine cultivar during thermotherapy.

Ποικιλία Βασικό υπόστρωμα ΒΑ (μΜ) ΝΑΑ (μΜ)

Αγιωργίτικο WPM 0,25 0,3

Μαλαγουζιά GAL 0,5 0,3

Ξινόμαυρο ZL 0,05 0,03

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

4.1. Ιολογικός έλεγχος

Ο ιολογικός έλεγχος των υπό μελέτη ποικιλιών Αγιωργίτικο, Μαλαγουζιά και Ξινόμαυρο πραγματοποιήθηκε με ορολογικές (ELISA) και μοριακές (ένθετη RT-PCR) μεθόδους. Η Ευρωπαϊκή Ένωση με οδηγίες του οργανισμού European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO, www.eppo.org), ορίζει πλέον ως απαραίτητους τους διαρκείς ελέγχους και τη διακίνηση πιστοποιημένου υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού αμπέλου (Roy 2003), που εξασφαλίζεται μόνο μετά τον έλεγχο των φυτών με ευαίσθητες, ακριβείς και αξιόπιστες ιολογικές μεθόδους.

4.1.1. Δοκιμή ELISA

Σύμφωνα με τις οδηγίες της ΕΡΡΟ (1998) η ELISA είναι μία εύχρηστη μέθοδος η οποία χρησιμοποιείται για την ταχεία και μαζική ιολογική διάγνωση των φυτών και βρίσκει απήχηση από αρκετούς ερευνητές (Adams et al. 1999, Valero et al. 2003, Γραμματικάκη και συν. 2005). Υπάρχουν όμως κάποια στοιχεία που καθιστούν προβληματική τη χρήση της στην ανίχνευση των ιολογικών προσβολών της αμπέλου.

Έχει αναφερθεί ότι, τόσο οι ιοί που σχετίζονται με την ασθένεια της βοθρίωσης του κορμού της αμπέλου (grapevine rugose wood, GRW) όσο και αυτοί που σχετίζονται με την ασθένεια της συστροφής των φύλλων της αμπέλου (grapevine leafroll, GLR), παρουσιάζουν ανισοκατανομή στα διάφορα τμήματα του φυτού (Monis and Bestwick 1996, Boscia et al. 1997, Dovas and Katis 2003β, O’ Herlihy et al. 2003), η οποία μάλιστα κυμαίνεται κατά τις εποχές του έτους, γεγονός που δυσχεραίνει την αξιοπιστία της ELISA.

Επιπρόσθετα, υπάρχουν βιβλιογραφικές αναφορές (Knapp et al. 1996, Boscia et al. 1997) της παρουσίας του ιού σε λανθάνουσα κατάσταση ή σε τίτλο χαμηλότερο του ορίου ανίχνευσης της μεθόδου, όπως συχνά συμβαίνει με τον GRSPaV, που είχαν ως αποτέλεσμα τον μη αξιόπιστο ιολογικό έλεγχο. Έχει αναφερθεί αύξηση του ποσοστού του εντοπισμού των προσβολών ακόμη και 35% μετά από συγκριτικό ιολογικό έλεγχο με ELISA και PCR (Acheche et al.

1999). Αυτές οι παρατηρήσεις συνεπάγονται προβλήματα ευαισθησίας αλλά και επαναληψιμότητας της μεθόδου (Boscia et al. 1997).

Ένα ακόμη πρόβλημα αποτελεί η απουσία εξειδικευμένων αντισωμάτων για τον GRSPaV (Meng et al. 2000β, Minafra et al. 2001), που όπως έχει δειχθεί αποτελεί έναν από τους κύριους ιούς που εντοπίζονται στον ελλαδικό χώρο (Δόβας, 2002) και συνίσταται από στελέχη με μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα (Nolasco et al. 2006). Επίσης, εξαιτίας της ειδικότητας της αντίδρασης αντιγόνου-υποστρώματος εμφανίζονται αδυναμίες στην ανίχνευση νέων ιών (Viti-, Fovea- και Clostero-virus) με τη μέθοδο ELISA.

Εντούτοις, δεδομένου ότι η ELISA είναι μία απλή, αρκετά οικονομική τεχνική ρουτίνας, χρησιμοποιήθηκε στην αρχή των ιολογικών ελέγχων προκειμένου να υπάρχει γρήγορη διάγνωση για το πειραματικό φυτικό υλικό.

Τα αποτελέσματα έδειξαν την προσβολή του Αγιωργίτικου από τον GLRaV-1, ενώ στις ποικιλίες Μαλαγουζιά και Ξινόμαυρο δεν εντοπίστηκε κανένας από τους ιούς για τους οποίους χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα.

4.1.2. Δοκιμή ένθετης RT-PCR

Η PCR είναι μια ιδιαίτερα ελκυστική μέθοδος ιολογικών ελέγχων, καθώς μπορεί να επιτευχθεί ταυτόχρονη ανίχνευση πληθώρας συγγενών ιών (με χρήση μη εξειδικευμένων εκκινητών με μεγάλο εκφυλισμό), με εξαιρετική ευαισθησία, αξιοπιστία και επαναληψιμότητα. Τα προβλήματα της μεθόδου είναι η μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα που εμφανίζουν οι πληθυσμοί των φυτικών ιών (όταν χρησιμοποιούνται ειδικοί εκκινητές), η παρουσία αναστολέων των ενζύμων της PCR που εντοπίζονται στους φυτικούς ιστούς, η χρονοβόρα διαδικασία προετοιμασίας των δειγμάτων και το μεγάλο κόστος για την πραγματοποίηση μαζικών ελέγχων.

Εκτός από τα αρχικά στάδια των ελέγχων όπου χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της ELISA, όλοι οι υπόλοιποι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν με την ένθετη RT-PCR που αναπτύχθηκε από τους Dovas and Katis (2003a, b) και Dovas et al. (2006). Η μοριακή μέθοδος επιβεβαίωσε την παρουσία του ιού GLRaV-1 στο Αγιωργίτικο (που είχε ανιχνευθεί και από την ELISA) και ανάδειξε την προσβολή και των τριών ποικιλιών από τον ιό GRSPaV, καθιστώντας σαφές ότι οι ιολογικοί έλεγχοι μόνο με ορολογικές μεθόδους είναι

ανεπαρκείς στην περίπτωση της αμπέλου, συμπέρασμα που συμφωνεί και με αυτά άλλων ερευνητών (Δόβας 2002, Acheche et al. 1999, Manganaris et al.

2003, Verma et al. 2005, Sharma et al. 2008). Αρχικά ο ιολογικός έλεγχος έγινε με την ένθετη RT-PCR όπου πραγματοποιείται ταυτόχρονη ανίχνευση των Clostero-, Fovea- και Viti-ιών, ενώ μετά την επιβεβαιωμένη εξυγίανση του Αγιωργίτικου από τον GLRaV-1 οι έλεγχοι πραγματοποιούνταν με ένθετη RT- PCR για ταυτόχρονη ανίχνευση των Foveavirus και Vitivirus.

Η χρήση ειδικών εκκινητών για την ανίχνευση των ιών GVA (Gambino et al. 2006, Nakaune and Nakano 2006) και GRSPaV (Meng et al. 1999a, Nakaune and Nakano 2006) ήταν απαραίτητη, καθώς η ένθετη RT-PCR που χρησιμοποιήθηκε ανιχνεύει ταυτόχρονα τους χαρακτηρισμένους Fovea- και Viti-ιούς, αλλά και άλλους άγνωστους που ανήκουν σε αυτά τα γένη (Dovas and Katis 2003a). Επομένως, ήταν σημαντικό να αποκαλυφθεί η ταυτότητα του ιού των προσβολών, που όπως αποδείχθηκε ήταν ο GRSPaV και για τις τρεις υπό μελέτη ποικιλίες.

Το πρόβλημα που δημιουργείται αρχικά κατά τον ιολογικό έλεγχο φυτών όπως η άμπελος που διαθέτουν πληθώρα φαινολικών ενώσεων, είναι ότι αυτές δρουν ως αναστολείς των ενζύμων της PCR (Rowhani et al. 1993, Minafra and Hadidi 1994). Προκειμένου να προσπελασθούν αυτές οι δυσκολίες χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο εκχύλισης του ολικού RNA των Rott and Jelkmann (2001), τροποποιημένο από τους Dovas et al. (2006). Η διαδικασία χρειάζεται ιδιαίτερα λεπτούς χειρισμούς, καθώς είναι πολύ εύκολο να δημιουργηθούν επιμολύνσεις μεταξύ των δειγμάτων. Επίσης, σημαντική ήταν η παρουσία των Na2SO3 και PVP στο διάλυμα ομογενοποίησης (Δόβας 2002).

Το Na2SO3 είναι αντιοξειδωτική ουσία που παρεμποδίζει την ενζυμική οξείδωση των φαινολικών υποστρωμάτων, ενώ το PVP είναι ένα υδατοδιαλυτό πολυμερές που προσροφά φαινολικές ενώσεις (Pierpoint 1996).

Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν εκφυλισμένοι, που σημαίνει ότι στηρίζονται στην αντίστοιχη ιδιότητα του γενετικού κώδικα σύμφωνα με την οποία ένα αμινοξύ μπορεί να κωδικοποιείται από περισσότερες της μίας τριάδας νουκλεοτιδίων. Ο εκφυλισμός εξυπηρετεί στην ταυτόχρονη ανίχνευση περισσότερων του ενός συγγενικών ιών και έτσι μπορούν να διαγνωστούν ακόμη και άγνωστοι ιοί των αντίστοιχων γενών. Προκειμένου όμως να αυξηθεί

η ειδικότητα και ευαισθησία της μεθόδου, όταν ο εκφυλισμός μίας θέσης ήταν τέσσερα (δηλαδή υπήρχε δυνατότητα ύπαρξης τεσσάρων διαφορετικών εκκινητών για τη συγκεκριμένη θέση), χρησιμοποιήθηκε το νουκλεοτίδιο δεοξυινοσίνη (dI) με στόχο τη μείωση του εκφυλισμού (Rossolini et al. 1994, Ehlers et al. 1999).

Η ινοσίνη μπορεί να δημιουργεί δεσμούς και με τις τέσσερις βάσεις του DNA, η σταθερότητα των οποίων είναι μικρότερη αυτών μεταξύ των πουρινών και πυριμιδινών (Martin and Castro 1985). Κάτι τέτοιο όμως μπορεί να δημιουργήσει σημαντικά προβλήματα αστάθειας στον υβριδισμό των εκκινητών, ιδιαίτερα όταν σε έναν εκκινητή συνυπάρχουν πολλές υποκαταστάσεις με dI. Για το λόγο αυτό η dI χρησιμοποιήθηκε μόνο σε θέσεις με εκφυλισμό τέσσερα.

Για περαιτέρω μείωση του εκφυλισμού, με στόχο την αύξηση της ευαισθησίας και αξιοπιστίας, στους ελέγχους ταυτόχρονης ανίχνευσης των Clostero-, Fovea- και Viti-ιών, χρησιμοποιήθηκαν ομόλογοι εκκινητές στους οποίους η dI υποκαταστάθηκε με dG (Δόβας 2002). Ο λόγος ήταν ότι παρατηρείται η τοποθέτηση dC απέναντι από την dI, επομένως στο δεύτερο κύκλο της PCR επιτυγχάνεται ο υβριδισμός των ομόλογων εκκινητών με την πρόσδεση του dC με το dG. Επίσης, στις θέσεις Y εκφυλισμού (Y = C+T) χρησιμοποιήθηκε το ανάλογο της πυριμιδίνης P (P: 6H,8H-3,4- dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one) (Δόβας 2002), το οποίο δημιουργεί δεσμούς με A και G, παρόμοιας σταθερότητας με τους δεσμούς T:A και G:C αντίστοιχα (Lin and Brown 1989, 1992) και αυξάνει την απόδοση της μεθόδου.

Η επιβεβαίωση της ιολογικής κατάστασης των φυτών που προήλθαν από τις τεχνικές εξυγίανσης που εφαρμόστηκαν, πραγματοποιούνταν κάθε τρεις μήνες για διάστημα μεγαλύτερο του ενός έτους, τόσο στα in vitro όσο και στα ex vitro φυτά και όσα από αυτά βρέθηκαν να είναι εξυγιασμένα δεν εμφάνισαν σε όλο το διάστημα των ελέγχων την παρουσία κάποιου ιού. Οι ιολογικοί έλεγχοι ήταν συχνοί λόγω της επιφύλαξης των Αυγελής και Κατής (2004) για την εγκυρότητά τους σε υλικό που προέρχεται από in vitro μεριστωματική καλλιέργεια.

Η χρήση της RT-PCR για ταυτόχρονη ανίχνευση των Clostero-, Fovea- και Viti-ιών, αλλά και την ταυτόχρονη ανίχνευση των Fovea- και Viti-ιών σε

ένα μικροσωλήνα είχε ως αποτέλεσμα την κατά το δυνατό μείωση του χρόνου και του κόστους των ιολογικών ελέγχων. Η αποτελεσματικότητα, σε συνδυασμό με την ευαισθησία και αξιοπιστία της τεχνικής που ενισχύθηκε με την εφαρμογή της ένθετης PCR, καθιστούν τη μέθοδο κατάλληλη για το μαζικό ιολογικό έλεγχο φυτών (Δόβας 2002), συμπέρασμα που ενισχύθηκε και από τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης.

4.2. Πρωτόκολλο μικροπολλαπλασιασμού

4.2.1. Εγκατάσταση

Οι τρεις ποικιλίες αμπέλου που μελετήθηκαν παρουσίασαν διαφοροποιήσεις στη μέθοδο της απολύμανσης και στα υποστρώματα εγκατάστασης που εφαρμόστηκαν. Τόσο η συγκέντρωση και ο χρόνος εφαρμογής του απολυμαντικού μέσου (NaOCl, HgCl2) όσο και τα διαφορετικά υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν επιλέχθηκαν λόγω των θετικών τους επιδράσεων σε άλλες ποικιλίες (Mhatre et al. 2000, Valero et al. 2003, Ibáñez et al. 2005).

Για την απολύμανση των εκφύτων της ποικιλίας Αγιωργίτικο, που πραγματοποιήθηκε την εποχή Μαΐου-Ιουνίου, αποτελεσματική θεωρήθηκε η επίδραση 2% NaOCl για 15 λεπτά αφού το 68,1% των εκφύτων που απολυμάνθηκαν επιβίωσαν και απαλλάχθηκαν επιτυχώς από τα διάφορα παθογόνα.

Καταλληλότερο υπόστρωμα για την πρώτη φάση της εγκατάστασης του Αγιωργίτικου αποδείχθηκε το τροποποιημένο ½ MS εμπλουτισμένο με 4,5 μΜ ΒΑ και 2,7 μΜ ΝΑΑ. Η παραμονή των εκφύτων σε αυτό το υπόστρωμα για διάστημα μεγαλύτερο των 80 ημερών (δύο ανακαλλιέργειες) προκάλεσε το μαρασμό τους, γεγονός που πιθανόν οφείλεται στην απουσία της κατάλληλης συγκέντρωσης των απαραίτητων θρεπτικών στοιχείων για την ποικιλία, αλλά ίσως και στην αυξημένη συγκέντρωση των ρυθμιστών ανάπτυξης, δεδομένου ότι είναι δυνατό να παρατηρηθεί διαφοροποίηση στις θρεπτικές ανάγκες κάποιων φυτών κατά τα στάδια της in vitro ανάπτυξής τους (από George et al.

2008). Με μεταφορά του φυτικού υλικού στο υπόστρωμα QL-MS απουσία ορμονών παρατηρήθηκε ανάκαμψη, γεγονός που επιβεβαιώνει τις προηγούμενες υποθέσεις.

Για την ποικιλία Μαλαγουζιά οι προσπάθειες εγκατάστασης ξεκίνησαν κατά τον Ιούλιο-Σεπτέμβριο και η απολύμανση αποδείχθηκε δυσκολότερη υπόθεση, καθώς μόνο από την Γ΄ μεταχείριση με επίδραση 2% NaOCl για 15- 16 λεπτά, όπου χρησιμοποιήθηκαν βλαστοί ανεπτυγμένοι σε συνθήκες θερμοκηπίου (βλέπε κεφάλαιο 2.3.2.1), προέκυψαν βιώσιμα έκφυτα, απαλλαγμένα από τα διάφορα παθογόνα. Οι μέθοδοι απολύμανσης των

εκφύτων που προήλθαν από τον αγρό με τη χρήση NaOCl ή HgCl2 ήταν ανεπιτυχείς καθώς το φυτικό υλικό ήταν ιδιαίτερα βεβαρημένο από τους παθογόνους μικροοργανισμούς της ατμόσφαιρας, κυρίως από μύκητες.

Για τη Μαλαγουζιά το υπόστρωμα ½ QL-MS εφοδιασμένο με 0,3 μM BA και 0,005 μM NAA αποδείχθηκε το καταλληλότερο και για τις τρεις ανακαλλιέργειες της φάσης εγκατάστασης της ποικιλίας, χωρίς τη δημιουργία άλλων προβλημάτων.

Η εγκατάσταση της ποικιλίας Ξινόμαυρο, που ξεκίνησε τον Ιούλιο του 2005 και τελικά πραγματοποιήθηκε το Μάρτιο του 2007, αποδείχθηκε ιδιαίτερα δύσκολη. Κατά τις μεταχειρίσεις Α΄ και Β΄, όπου χρησιμοποιήθηκε φυτικό υλικό από τον αγρό, η απολύμανση ήταν ανεπιτυχής καθώς ο καθολικός αριθμός των εκφύτων δεν απαλλάχθηκε από τα βακτήρια και τους μύκητες, τόσο μετά τη χρήση NaOCl όσο και HgCl2. Από τη Γ΄ και Δ΄ μεταχείριση φάνηκε ότι στα έκφυτα που προέρχονται από βλαστούς ανεπτυγμένους σε συνθήκες θερμοκηπίου η επίδραση 1,5% NaOCl για 10 λεπτά επαρκεί για την απαλλαγή επαρκούς αριθμού εκφύτων από τα διάφορα παθογόνα. Και πάλι σημαντικό είναι το γεγονός ότι τα φυτά από τα οποία προέκυψαν εκμεταλλεύσιμα έκφυτα δεν ήταν ιδιαίτερα εκτεθειμένα στους διάφορους μικροοργανισμούς.

Για το Ξινόμαυρο καλύτερο αποδείχθηκε το υπόστρωμα ½ MS, αυστηρά μόνο όμως για το διάστημα των πρώτων 40 ημερών εγκατάστασης. Η μεταφορά των νέων βλαστών σε διαφορετικό υπόστρωμα (ZL) με μεγαλύτερη συγκέντρωση μακροστοιχείων (Πίνακας 4.1) θεωρήθηκε αναγκαία εξαιτίας της καθολικής νέκρωσης των φυταρίων μετά από την παραμονή τους στο πρώτο υπόστρωμα εγκατάστασης. Η μεταφορά των εκφύτων από το υπόστρωμα ½ MS μόλις μετά από 20 ημέρες από την αρχική εγκατάσταση είχε ως αποτέλεσμα τη νέκρωση των φυταρίων, γεγονός που ίσως οφείλεται στην αρχική καταπόνηση του φυτικού υλικού το οποίο δεν μπόρεσε να ξεπεράσει και την καταπόνηση της μεταφοράς σε τελείως διαφορετικό θρεπτικό μέσο.

Η μεγαλύτερη καταλληλότητα του υποστρώματος ZL ίσως συνδέεται και με την ιδιότητά του να επάγει τη ριζογένεση (Zlenco et al. 1995) ταχύτερα σε σύγκριση με τα άλλα υποστρώματα που ελέγχθηκαν. Αυτή η παρατήρηση έχει

ιδιαίτερη αξία καθώς διαπιστώθηκε ότι απουσία έστω και υποτυπώδους ριζικού συστήματος τα φυτάρια της ποικιλίας Ξινόμαυρο αδυνατούσαν να επιβιώσουν.

Πίνακας 4.1: Συγκέντρωση ιόντων (mM) των μακροστοιχείων σε κάθε είδος υποστρώματος που χρησιμοποιήθηκε για την καλλιέργεια των τριών ποικιλιών αμπέλου Αγιωργίτικο, Μαλαγουζιά και Ξινόμαυρο.

Table 4.1: Ion concentration (mM) of macronutrients of the media used for in vitro culture of the grapevine cultivars Agiorgitiko, Malagouzia and Xinomavro.

Συγκέντρωση ιόντων (mM)

Είδος μακροστοιχείων

MS WPM QL GAL ZL

ΝΗ4+ 20,60 4,99 4,99 1,99 3,84

ΝΟ₃^- 39,40 9,640 33,00 22,60 18,13

K^- 20,04 12,61 19,80 10,91 10,03

Ca²⁺ 2,99 3 5,1 2,13 2,22

Mg²⁺ 1,5 1,5 1,45 0,005 2,42

SO₄^2- 1,76 7,44 1,64 0,55 2,68

Ολικό Ν 60,00 14,63 37,99 24,59 21,97

ΝΗ₄⁺/ΝΟ₃^- 0,52 0,51 0,15 0,09 0,21

Συνολική ποσότητα (g) των συστατικών

4530 2582 4030 1911 2280

Σύμφωνα με τους Singh et al. (2004), η αδυναμία ριζοβολίας που εκδηλώνουν τα έκφυτα κάποιων ποικιλιών μπορεί να οφείλεται στον ανταγωνισμό που παρατηρείται μεταξύ της βλαστογένεσης και της ριζογένεσης.

Το φαινόμενο έχει παρατηρηθεί και από άλλους ερευνητές (Chee and Pool 1982, Harris and Stevenson 1982, Thies and Graves 1992), έχει αποδοθεί στις γενοτυπικές διαφορές των ποικιλιών αμπέλου και για τον υπερκερασμό του προβλήματος προτάθηκε η χρήση εκφύτων με δύο οφθαλμούς, ώστε να είναι σαφής η πολικότητα (Singh et al. 2004). Παρά τη χρήση αυτής της τεχνικής η ριζοβολία του Ξινόμαυρου δεν επιταχύνθηκε, αντίθετα ίσως εξαιτίας της μεγαλύτερης επιφάνειας επαφής των εκφύτων με το υπόστρωμα προκλήθηκαν εντονότερα συμπτώματα καταπόνησης που επιτάχυναν τη νέκρωση του φυτικού υλικού. Η νέκρωση των εκφύτων θα μπορούσε να οφείλεται στην έκκριση φαινολών από το τραυματισμένο φυτικό υλικό στο υπόστρωμα καλλιέργειας (Tomažič et al. 2003, από George 2008), οι οποίες δρουν τοξικά και για το ίδιο.

Παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα και από την ακατάλληλη συγκέντρωση των ρυθμιστών ανάπτυξης. Οι υψηλές συγκεντρώσεις ΒΑ και ΝΑΑ είχαν ως αποτέλεσμα την αναστολή της βλαστογένεσης και της ριζογένεσης και την επαγωγή σχηματισμού μεγάλων εύθρυπτων κάλλων. Μόνο μετά από τον εμπλουτισμό του υποστρώματος ZL με 0,4 μΜ ΒΑ και 0,005 μΜ ΝΑΑ τα έκφυτα επιβίωσαν και παρήγαγαν φυτάρια καλής φυσιολογικής κατάστασης κατάλληλα για περαιτέρω πειραματισμό.

Σύμφωνα με τους Botti et al. (1993) και τους Delal et al. (1993) υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της φυσιολογικής κατάστασης του μητρικού φυτού από το οποίο γίνεται η λήψη των εκφύτων με την αντίδραση αυτών στη φάση της εγκατάστασης. Βέβαια υπάρχει διαφωνία για το αν καλύτερα αποτελέσματα εξασφαλίζονται με τη λήψη φυτικού υλικού μετά από επαγόμενη βλάστηση του μητρικού φυτού (Yu and Meredith 1986, Delal et al. 1993) ή λήψη υλικού το πρώτο διάστημα μετά από τη βλάστηση του φυτού στον αγρό την άνοιξη (Padeliev et al. 1990). Από τα δικά μας αποτελέσματα, που είναι σε συμφωνία και με αυτά των Ibáñez et al. (2005), δεν παρατηρήθηκε κάποια συσχέτιση και η κατάσταση των εκφύτων ήταν φυσιολογική είτε όταν αυτά προήλθαν από επαγόμενη βλάστηση (Μαλαγουζιά, Ξινόμαυρο) είτε μετά από βλάστηση κατά την άνοιξη (Αγιωργίτικο).

Καθοριστικός παράγοντας στην επιτυχία της απολύμανσης φάνηκε να είναι η συλλογή βλαστών απαλλαγμένων από το βαρύ φορτίο των παθογόνων, που μπορεί να επιτευχθεί είτε με την παραλαβή τους κατά το πρώτο διάστημα βλάστησης των φυτών στον αγρό κατά την άνοιξη είτε με την επαγόμενη βλάστησή τους στις προστατευμένες συνθήκες θερμοκηπίου. Έχει παρατηρηθεί μάλιστα (Ibáñez et al. 2005, παρούσα μελέτη) ότι η απαλλαγή από τα διάφορα παθογόνα είχε μεγαλύτερη επιτυχία στα έκφυτα που προέρχονται από τα ανώτερα τμήματα των νέων βλαστών των μητρικών φυτών από ό,τι στα κατώτερα που είναι εκτεθειμένα για μεγαλύτερο διάστημα στους παθογόνους μικροοργανισμούς. Οι παρατηρήσεις είναι σύμφωνες με τα συμπεράσματα και άλλων ερευνητών σε διαφορετικά φυτικά είδη που διαθέτουν όμως τρίχες στην επιδερμίδα τους, όπως για παράδειγμα στην ελιά (Γρηγοριάδου 2003).

Από τα υποστρώματα εγκατάστασης που ελέγχθηκαν παρατηρήθηκε ότι η κάθε ποικιλία έχει διαφορετικές απαιτήσεις, κυρίως σε μακρο- και μικρο-

στοιχεία, αλλά και σε ρυθμιστές ανάπτυξης με αποτέλεσμα να χρειάζεται διαφορετικό θρεπτικό υπόστρωμα για την καλλιέργειά της. Αυτό συμφωνεί με τις παρατηρήσεις άλλων ερευνητών (Chee et al. 1984, Galzy and Compan 1988, Heloir et al. 1997, Mhatre et al. 2000, Singh et al. 2004, Ibáñez et al. 2005) κατά την εγκατάσταση άλλων ποικιλιών αμπέλου. Επίσης παρατηρήθηκε ότι σε κάποιες ποικιλίες αλλάζουν οι θρεπτικές απαιτήσεις κατά τη διάρκεια της εγκατάστασης. Αυτό ίσως να οφείλεται στην ανάγκη κάποιου «ελαφριού»

υποστρώματος ως προς τα διάφορα στοιχεία (μακρο- και μικρο-στοιχεία) ώστε να μην καταπονηθούν περαιτέρω τα έκφυτα μετά την αποκοπή και απολύμανσή τους (από George 1993), το οποίο όμως δεν επαρκεί για τη συνέχιση της καλλιέργειας. Παρόμοια στοιχεία παρατηρούνται και ως προς τη συγκέντρωση των ρυθμιστών ανάπτυξης σε κάποιες ποικιλίες. Στην αρχική φάση της εγκατάστασης απαιτείται μεγάλη συγκέντρωση ορμονών, ώστε να προωθηθεί ταχύτατα η πρώτη έκπτυξη των νέων βλαστών, που όμως σε κάποιες ποικιλίες μπορεί να αποδειχθεί τοξική για τη συνέχεια της καλλιέργειας. Οι παρατηρήσεις είναι σύμφωνες και με προηγούμενες μελέτες (Monette 1988) στον in vitro πολλαπλασιασμό της αμπέλου, όπου φάνηκε ότι ο βαθμός επιτυχίας κάθε σταδίου καλλιέργειας είναι γενετικά εξαρτώμενος και διαφέρει ανάλογα με τις συνθήκες που εφαρμόζονται.

4.2.2. Βασικό πολλαπλασιαστικό υλικό

Σε πολλά φυτά αμπέλου που προέρχονται από μικροπολλαπλασιασμό έχουν παρατηρηθεί κάποιες φαινοτυπικές τροποποιήσεις, ιδιαίτερα στη μορφολογία των φύλλων (Pospíšilová et al. 1999, Gribaudo et al. 2000).

Σύμφωνα με κάποιους ερευνητές (Grenan 1984, 1994, Cancellier and Cossio 1987, Martinez and Mantilla 1993) αυτές οι μορφολογικές τροποποιήσεις θυμίζουν εικόνα σποροφύτων σε νεανική φάση ανάπτυξης, και θεωρείται ότι οφείλονται στη νεανικότητα των βλαστών που προάγεται από τη μέθοδο. Αυτού του είδους τα προβλήματα μπορεί να δημιουργήσουν δυσκολίες στον αμπελογραφικό χαρακτηρισμό των κλώνων (Gribaudo et al. 2000).

Για τον υπερκερασμό ή την ελαχιστοποίηση αυτών των ανεπιθύμητων επιδράσεων έχει προταθεί ο περιορισμός του αριθμού των in vitro ανακαλλιεργειών, η χρήση της κατάλληλης συγκέντρωσης ρυθμιστών

ανάπτυξης στο θρεπτικό μέσο και η μη χρησιμοποίηση των φυτών που έχουν μη αποδεκτή μορφολογία ή έχουν σχηματίσει κάλλους (Grenan 1994). Μετά τη μεταφορά τους στον αγρό συνιστάται η αποφυγή του κοντού κλαδέματος, καθώς έχει παρατηρηθεί ότι αυτό ενισχύει την παρατεταμένη νεανικότητα των φυτών που προέρχονται από μικροπολλαπλασιασμό (Grenan 1994).

Στις ποικιλίες αμπέλου που μελετήσαμε δεν παρατηρήθηκαν τα προβλήματα που αναφέρθηκαν νωρίτερα, όμως η in vitro καλλιέργειά τους έγινε σύμφωνα με τις προτάσεις του Grenan (1994).

4.2.3. Βασικό υπόστρωμα μικροπολλαπλασιασμού

Από προηγούμενες μελέτες έχει γίνει φανερό ότι η ποικιλομορφία μεταξύ των ποικιλιών του είδους Vitis vinifera είναι ιδιαίτερα έντονη (Galzy 1964, Favre and Grenan 1979, Harris and Stevenson 1982, Chee and Pool 1983, Galzy et al. 1990). Κάποιοι ερευνητές (Reisch 1986, Botti et al. 1993, Ibáñez et al.

2005) υποστηρίζουν ότι η ιδανική σύνθεση ενός θρεπτικού υποστρώματος που χρησιμοποιείται για την ανάπτυξη ποικιλιών αμπέλου εξαρτάται από το είδος και την ποικιλία. Μάλιστα η εξάρτηση είναι τόσο έντονη ώστε τα αποτελέσματα από την καλλιέργεια ενός γενοτύπου μπορεί να διαφέρουν δραματικά από αυτά που προκύπτουν από την καλλιέργεια ενός άλλου. Αυτό μπορεί να εξηγήσει και τις διαφοροποιήσεις που παρατηρήθηκαν κατά τον in vitro μικροπολλαπλασιασμό των ποικιλιών Αγιωργίτικο, Μαλαγουζιά και Ξινόμαυρο και την ανάγκη διερεύνησης του ιδανικότερου υποστρώματος για την κάθε μία.

Σύμφωνα με τους Galzy (1969) και Roubelakis-Angelakis and Zivanovitc (1991), η διαφορετική απόκριση στην in vitro βλαστογένεση και ριζογένεση της αμπέλου σχετίζεται με τις διαφορές στη σύνθεση των μακροστοιχείων, τα οποία και κατέχουν και τη μεγαλύτερη συγκέντρωση από όλα τα συστατικά των υποστρωμάτων. Μάλιστα, οι αυξημένες συγκεντρώσεις κάποιων από τα συστατικά των μακροστοιχείων ευνοούν την ανάπτυξη των βλαστών και αυτό διαφέρει ανάλογα με την καλλιεργούμενη ποικιλία (Galzy 1969). Κατά τους Scienza et al. (1986), στο γένος Vitis παρατηρείται διαφορετική ικανότητα πρόσληψης των Κ, Ca²⁺ και Mg²⁺, γεγονός που συνεπάγεται την ύπαρξη διαφορετικής κατάλληλης συγκέντρωσης αυτών των ιόντων για την κάθε

ποικιλία (Zlenco et al. 1995). Αυτό φαίνεται και από τις παρατηρήσεις στις τρεις μελετούμενες ποικιλίες (Πίνακες 3.4, 3.10, 3.18), όπου διαφορετικά υποστρώματα αποδείχθηκαν ιδανικότερα για την κάθε μία. Για το Αγιωργίτικο καλύτερο αποδείχθηκε το WPM, για τη Μαλαγουζιά το GAL και για το Ξινόμαυρο το ZL.

Όπως και σε μελέτες σε άλλα φυτικά είδη (Sriskandarajah et al. 1990, Vinterhalter and Vinterhalter 1992), η αύξηση των συστατικών των μακροστοιχείων είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του σχηματισμού ριζών, γεγονός έκδηλο και στις τρεις ποικιλίες που ελέγχθηκαν. Το μήκος των ριζών για το Αγιωργίτικο και τη Μαλαγουζιά ήταν μεγαλύτερο παρουσία μακροστοιχείων WPM και GAL (Πίνακες 3.4, 3.10) που ήταν τα πιο ελαφριά υποστρώματα (Πίνακας 2.20, 4.1), ακολουθούσαν τα υποστρώματα με μακροστοιχεία QL και τέλος, οι μικρότερες ρίζες αναπτύχθηκαν στα υποστρώματα με μακροστοιχεία MS, που ήταν και αυτά με τη μεγαλύτερη συνολική ποσότητα συστατικών. Παρόμοια εικόνα έδειξε και η in vitro καλλιέργεια του Ξινόμαυρου (Πίνακας 3.18), με το μεγαλύτερο μήκος ρίζας να εντοπίζεται παρουσία υποστρωμάτων ZL και GAL, τα οποία ακολουθούνται από τα QL και WPM. Το μικρότερο μήκος ρίζας βρέθηκε στα υποστρώματα με μακροστοιχεία MS.

Ειδικά στην περίπτωση του Ξινόμαυρου, παρατηρήθηκε ότι μεγαλύτερες ρίζες αναπτύχθηκαν στα υποστρώματα με μακροστοιχεία QL από ό,τι σε αυτά με WPM, αντίθετα με την παρατήρηση ότι οι ρίζες είναι μεγαλύτερες στα πιο ελαφριά υποστρώματα. Το γεγονός αυτό ίσως οφείλεται στη μικρότερη συγκέντρωση του ΝΟ3- (Πίνακας 4.1) από τα μακροστοιχεία WPM, το οποίο φαίνεται να είναι σημαντικό στην ανάπτυξη των ριζών. Η παρατήρηση συμφωνεί με άλλους ερευνητές (από George et al. 2008), οι οποίοι από μελέτες ριζογένεσης και σε άλλα είδη εκτός από το V. vinifera, έχουν οδηγηθεί στο συμπέρασμα ότι η ανάπτυξη των ριζών ευνοείται από την παρουσία του ΝΟ3-.

4.2.4. Επίδραση των ρυθμιστών ανάπτυξης

Η in vitro ανάπτυξη και οργανογένεση των φυτών εξαρτώνται άμεσα από την αλληλεπίδραση μεταξύ των ενδογενών ρυθμιστών ανάπτυξης και αυτών που προσθέτονται στο θρεπτικό μέσο (από George et al. 2008) καθώς η κύρια

οδός μεταγωγής σημάτων στα φυτά είναι εξαρτώμενη από τις ορμόνες (Libbenga and Mennes 1995). Οι ρυθμιστές ανάπτυξης, ενδογενούς και εξωγενούς προέλευσης, είναι ιδιαίτερης σημασίας για τα φυτά καθώς αλληλεπιδρούν με το σύστημα της γενετικής τους ρύθμισης και καθορίζουν το φαινότυπο από την αλληλεπίδραση του γενοτύπου και του περιβάλλοντος. Οι μηχανισμοί αναγέννησης επιτρέπουν την επιβίωση των φυτών εκείνων στα οποία το σύστημα ρύθμισης είναι καλά ισορροπημένο (Marchenko 2003). Για τους λόγους αυτούς μελετήθηκε η επίδραση των ορμονών ΒΑ και ΝΑΑ στην ανάπτυξη των τριών ποικιλιών αμπέλου και έγινε προσπάθεια εύρεσης της καταλληλότερης συγκέντρωσης αυτών για την κάθε ποικιλία. Σύμφωνα με την υπόθεση των Grönroos et al. (1989), οι διαφοροποιήσεις που παρατηρούνται στην in vitro απόκριση των διαφόρων γενοτύπων ίσως συνδέονται με το ενδογενές περιεχόμενο ορμονών στα διάφορα φυτικά είδη. Η ίδια υπόθεση μπορεί να εξηγεί τη μεγάλη ποικιλομορφία μεταξύ των ποικιλιών Vitis vinifera (Péros et al., 1998; Roubelakis-Angelakis and Zivanovitc, 1991).

Αρχικά ελέγχθηκε η επίδραση της κυτοκινίνης ΒΑ στο μικροπολλαπλασιασμό. Η επιλογή αυτής της κυτοκινίνης έναντι άλλων, όπως για παράδειγμα της κινητίνης, έγινε λόγω της υπεροχής της σε καλλιέργειες αμπέλου από προηγούμενες μελέτες (Harris and Stevenson 1982, Chee and Pool 1982, 1985, Novák and Jůvová 1983, Lewandowski 1991, Thies and Graves 1992, Torregrosa and Bouquet 1995, Mhatre et al. 2000, Ibáñez et al. 2005), παρά το γεγονός ότι παρατηρήθηκαν διαφοροποιήσεις στην απόκριση των εκφύτων ανάλογα με τη συγκέντρωσή της, που οφείλεται στη γενετική τους παραλλαγή.

Από τα αποτελέσματα που έχουν καταγραφεί από άλλους ερευνητές (Jona and Webb 1978, Goussard 1981, Harris and Stevenson 1982, NovákandJůvová 1983, Gray and Fisher 1985, Lee and Wetzstein 1990, Torregrosa and Bouquet 1995, Mhatre et al. 2000, Ibáñez et al. 2005) φάνηκε ότι η πρόσθεση της ΒΑ στο θρεπτικό μέσο ήταν ιδιαίτερα σημαντική και απαραίτητη για τη ρύθμιση της αύξησης και της ανάπτυξης. Η συγκέντρωση της ορμόνης επηρέασε τον αριθμό των βλαστών που προέκυψαν από τους μασχαλιαίους οφθαλμούς, γεγονός κρίσιμο στη μέθοδο του μικροπολλαπλασιασμού όπου οι επανακαλλιέργειες προέρχονται από τον τεμαχισμό των αναπτυσσόμενων

μικροβλαστών (Silvestroni 1981). Αντίθετα, στις μελετούμενες ποικιλίες, ενώ παρατηρήθηκε αύξηση του αριθμού των μικροβλαστών ανά έκφυτο, του αριθμού των οφθαλμών και του ρυθμού ανάπτυξης με την αύξηση της συγκέντρωσης της ΒΑ, η μείωση του μεσογονάτιου διαστήματος και η ολοένα αυξανόμενη χλώρωση κατέστησε την προσθήκη μόνο κυτοκινίνης στο θρεπτικό μέσο ακατάλληλη για τον επιτυχημένο μικροπολλαπλασιασμό τους.

Συχνά κατά τον in vitro πολλαπλασιασμό της αμπέλου παρατηρείται το φαινόμενο της υπερυδάτωσης (Morini et al. 1985) που μπορεί να οφείλεται στην υψηλή συγκέντρωση κυτοκινίνης ή ιόντων ΝΗ4+ και στο χρησιμοποιούμενο άγαρ (Ziv 1991, από George et al. 2008). Στα πειράματα που αφορούσαν στην επίδραση της ΒΑ στην ανάπτυξη της κάθε ποικιλίας, δεδομένου ότι τα υποστρώματα ήταν ίδια για την κάθε μία και δεν εμφανίστηκε υπερυδάτωση στα φυτάρια από όλες τις συγκεντρώσεις ΒΑ αλλά μόνο στις αυξημένες, το φαινόμενο μπορεί να αποδοθεί στην παρουσία της κυτοκινίνης, όπως παρατηρήθηκε και από άλλους ερευνητές (Heloir et al. 1997, Mhatre et al.

2000).

Είναι γνωστό ότι η προσθήκη μικρής συγκέντρωσης αυξίνης στο θρεπτικό υπόστρωμα σε συνδυασμό με κάποια κυτοκινίνη μπορεί να έχει θετική επίδραση στην ανάπτυξη των βλαστών, καθώς η υψηλή συγκέντρωση κυτοκινίνης για παρατεταμένο διάστημα είναι δυνατό να προκαλέσει υπερυδάτωση στα φυτάρια κάποιων ποικιλιών (Dawn 1987). Έχει προταθεί από τους Chee and Pool (1982) ότι η προσθήκη της αυξίνης στο μέσο καλλιέργειας μπορεί να περιορίσει αυτό το πρόβλημα.

Έχει αναφερθεί ότι κάποιες ποικιλίες έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται χωρίς να απαιτείται η προσθήκη αυξίνης στο θρεπτικό υπόστρωμα (Novák and Jůvová, 1983). Κατά τους Ibañez et al. (2005) τα έκφυτα της ποικιλίας Napoleon ίσως λειτουργούν ως ενεργά κέντρα σύνθεσης αυξίνης, επομένως η προσθήκη της ορμόνης στο θρεπτικό μέσο δεν ήταν απαραίτητη. Αντίθετα η προσθήκη αυξίνης, αν και σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για την κάθε ποικιλία, κρίθηκε απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό του Αγιωργίτικου (Skiada et al. 2009), της Μαλαγουζιάς και του Ξινόμαυρου, παρατηρήσεις που καταδεικνύουν ότι το ενδογενές περιεχόμενο των ποικιλιών είναι πολύ μικρό, τα κέντρα βιοσύνθεσης αυξίνης

δεν είναι ενεργοποιημένα και επομένως η παρουσία μόνο ΒΑ ήταν ανεπαρκής για την ικανοποιητική ανάπτυξη των μικροβλαστών.

Από τις πολύ μικρές συγκεντρώσεις των ρυθμιστών ανάπτυξης που χρησιμοποιήθηκαν για την in vitro ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό και των τριών ποικιλιών αμπέλου, εξάγεται το συμπέρασμα της καταλληλότητας του επιλεγόμενου θρεπτικού μέσου. Σύμφωνα με τους NovákandJůvová (1983) και τους Zlenko et al. (1995), η επίδραση της αυξίνης στη ριζοβολία εξαρτάται από την καταλληλότητα του θρεπτικού υποστρώματος. Σύμφωνα με τους ερευνητές σε ένα ακατάλληλο υπόστρωμα, σε πειράματα ελέγχου ριζοβολίας, οι συγκεντρώσεις των αυξινών χρειάζεται να είναι πολύ υψηλότερες προκειμένου να επιτευχθεί το επιθυμητό αποτέλεσμα. Σε διεύρυνση αυτής της υπόθεσης, σε ένα ακατάλληλο θρεπτικό μέσο παρατηρήθηκε ότι οι συγκεντρώσεις των ορμονών πρέπει να είναι υψηλές προκειμένου να παρατηρηθεί ικανοποιητικός ρυθμός ανάπτυξης (Skiada et al. 2009). Δεδομένου ότι οι συγκεντρώσεις των ορμονών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ιδιαίτερα χαμηλές, συμπεραίνεται η καταλληλότητα των χρησιμοποιούμενων υποστρωμάτων.

4.2.5. Επίδραση της θερμοκρασίας

Η επίδραση δύο θερμοκρασιών καλλιέργειας, των 21 και 26^oC, μελετήθηκε στην ανάπτυξη και των τριών ποικιλιών (Αγιωργίτικο, Μαλαγουζιά, Ξινόμαυρο). Η αυξημένη θερμοκρασία ήταν ευνοϊκή για την καλλιέργεια και των τριών ποικιλιών αμπέλου, αν και επιτάχυνε τον εκφυλισμό και γήρανση των φυταρίων, κυρίως του Αγιωργίτικου. Και στις τρεις ποικιλίες παρατηρήθηκε αναστολή του φαινομένου της κυριαρχίας της κορυφής, που είχε ως αποτέλεσμα τη βλάστηση και των μασχαλιαίων οφθαλμών, και γρηγορότερη ανάπτυξη των νέων μικροβλαστών.

Η διαφορετική θερμοκρασία δεν προκάλεσε αύξηση του μεσογονάτιου διαστήματος, όπως συμβαίνει σε άλλα φυτικά είδη (από George et al. 2008), αντίθετα είχε ως αποτέλεσμα τη γρηγορότερη επίτευξη της ανώτερης τιμής του.

Η μείωση του μήκους του μεσογονάτιου διαστήματος που παρατηρήθηκε από τις 50 και 30 ημέρες καλλιέργειας στους 21 και 26^oC αντίστοιχα, πιθανόν οφείλεται στον εκφυλισμό και γήρανση των φυταρίων, καθώς και στην ύπαρξη των δευτερευόντων βλαστών.

Από την καμπύλη του ρυθμού ανάπτυξης των τριών ποικιλιών στις δύο θερμοκρασίες παρατηρήθηκε ότι η αυξημένη θερμοκρασία επιδρά θετικά προκαλώντας αύξηση κατά 126,84% για το Αγιωργίτικο, 59,66% για τη Μαλαγουζιά και 59,51% για το Ξινόμαυρο. Μάλιστα ο ρυθμός ανάπτυξης του Αγιωργίτικου σταθεροποιείται μετά από τις 50 ημέρες καλλιέργειας στους 21^oC, κάτι που δεν παρατηρήθηκε για καμία άλλη ποικιλία σε οποιαδήποτε θερμοκρασία. Η μεγαλύτερη ανάπτυξη εντοπίστηκε μετά από τις 50 ημέρες καλλιέργειας στους 21^oC για τη Μαλαγουζιά και το Ξινόμαυρο. Ο ρυθμός ανάπτυξης κατά την καλλιέργεια στους 26^oC παίρνει την ανώτερη τιμή του μετά από 30 ημέρες για το Αγιωργίτικο και μετά από 40 ημέρες για τις δύο άλλες ποικιλίες. Επομένως, συμπεραίνεται ότι η αύξηση της θερμοκρασίας δημιουργεί νέα δυναμική στα φυτάρια λόγω της προσαρμογής τους στις νέες συνθήκες και προωθεί την ανάπτυξή τους.

Η θερμοκρασία δεν φάνηκε να επιδρά στον αριθμό των ριζών των ποικιλιών Αγιωργίτικο και Μαλαγουζιά, αφού ο αριθμός τους δεν εμφάνισε διαφορές μεταξύ των 20 και 60 ημερών καλλιέργειας. Εξαίρεση αποτέλεσε το Ξινόμαυρο, όπου ρίζες αναπτύχθηκαν μετά από τις 20 ημέρες στους 21^oC και παρατηρήθηκαν διαφορές κατά τη διάρκεια καλλιέργειας στις δύο θερμοκρασίες. Αντίθετα με τον αριθμό ριζών, η αυξημένη θερμοκρασία επηρέασε θετικά το μήκος τους, κυρίως όμως κατά τις πρώτες 20 ημέρες της καλλιέργειας. Αυτές οι παρατηρήσεις δημιουργούν την υπόθεση ότι το υπόγειο σύστημα των φυταρίων είναι πιο σταθερό και δεν υπόκειται σε περιβαλλοντικές μεταβολές.

Από τις παρατηρήσεις δημιουργείται η υπόθεση ότι η άμπελος, δεδομένου ότι βλαστάνει κατά τους εαρινούς μήνες και καρποφορεί κατά τους θερινούς, διαθέτει μηχανισμούς προσαρμογής στις υψηλότερες θερμοκρασίες προωθώντας την ανάπτυξη των φυταρίων, κατάσταση η οποία είναι σε συμφωνία με τις συνθήκες καλλιέργειας που υπάρχουν στις αμπελοπαραγωγικές χώρες, όπως η Ελλάδα (από Σπινθιροπούλου 2000, από Τσακίρης 2003). Η παρατήρηση ότι η αυξημένη θερμοκρασία προκαλεί ταχύτερη ανάπτυξη των εκφύτων θα μπορούσε να εφαρμοστεί κατά το μαζικό μικροπολλαπλασιασμό του είδους, με τις υψηλότερες θερμοκρασίες να χρησιμοποιούνται όταν απαιτείται γρήγορη παραγωγή νέων βλαστών και τις

χαμηλότερες κατά τη διατήρηση του βασικού πολλαπλασιαστικού υλικού, χωρίς να υπάρχει ανάγκη επανακαλλιέργειας.

4.2.6. Ριζοβολία in vitro και εγκλιματισμός

Η μελέτη της ριζοβολίας in vitro των ποικιλιών Αγιωργίτικο, Μαλαγουζιά και Ξινόμαυρο έγινε με την εφαρμογή διαφορετικών συγκεντρώσεων ΝΑΑ και ΙΒΑ σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες, στους 22 και 26^οC. Σύμφωνα με τους Julliard (1973), Dubois et al. (1988) και Kristiansen (1992) υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της ριζοβολίας in vitro και in vivo, και μάλιστα η ικανότητα ριζοβολίας μπορεί να προβλεφθεί από in vitro πειράματα και επομένως τα στοιχεία που προκύπτουν μπορούν να αξιοποιηθούν ώστε να προκύψουν βιώσιμα και εκμεταλλεύσιμα φυτά μετά από τη διαδικασία του μικροπολλαπλασιασμού.

Η επιλογή του υποστρώματος MS για τα πειράματα ριζοβολίας έγινε με βάση τα συμπεράσματα άλλων ερευνητών (Chee et al. 1984, Li and Eaton 1984), που το χαρακτήρισαν ως απαραίτητο για την έκπτυξη των ριζών των φυταρίων αμπέλου. Η αντίδραση των ποικιλιών Αγιωργίτικο και Μαλαγουζιά σε αυτό το υπόστρωμα ήταν θετική, αντίθετα όμως το Ξινόμαυρο εμφάνισε χλώρωση, περιορισμένη νέκρωση κορυφών και νεκρωτικές κηλίδες.

Η ριζοβολία των φυταρίων θεωρείται ότι εξαρτάται από τη φύση της αυξίνης που εφαρμόζεται (Heloir et al. 1997). Στην παρούσα μελέτη, το NAA οδήγησε στη δημιουργία ριζών χαμηλότερης ποιότητας από ό,τι το IBA, σε όλες τις ποικιλίες, ενώ οι υψηλές συγκεντρώσεις του ΝΑΑ προκάλεσαν τοξικότητα, ειδικά στη βάση του βλαστού, αποτελέσματα που συνάδουν με αυτά των De Klerk et al. (1997) στο Malus. Οι αρνητικές επιδράσεις του ΝΑΑ επιδεινώθηκαν από την υψηλότερη θερμοκρασία. Αντίθετα, παρουσία του ΙΒΑ, ακόμη και στις υψηλότερες συγκεντρώσεις τέτοια προβλήματα δεν παρουσιάστηκαν. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το ρυθμό οξείδωσης του ΙΒΑ, ο οποίος είναι μικρότερος από αυτόν του ΝΑΑ, το οποίο είναι πιο σταθερό (Dunlap et al. 1986, Nissen and Sutter 1990). Η τοξικότητα που παρατηρήθηκε στο μικροβλαστό συνοδεύτηκε από την κακή μορφολογική κατάσταση των ριζών, πιθανόν εξαιτίας της εντονότερης εμμονής του ΝΑΑ σε σχέση με τις άλλες αυξίνες (De Klerk et al., 1997) που επηρεάζει ιδιαίτερα την ποιότητα των φυταρίων.

Η υψηλότερη θερμοκρασία στις ποικιλίες Αγιωργίτικο και Μαλαγουζιά προκάλεσε την αύξηση του αριθμού και του μήκους των ριζών στις μεταχειρίσεις που χρησιμοποιήθηκε το ΙΒΑ, ενώ βραχύτερες και παχύτερες ρίζες παράχθηκαν παρουσία ΝΑΑ. Αντίθετα, στην περίπτωση του Ξινόμαυρου η αύξηση της θερμοκρασίας επέδρασε αρνητικά, καθώς επιταχύνθηκε η εμφάνιση της τοξικότητας, κυρίως από το ΝΑΑ. Βέβαια, η εφαρμογή του ΝΑΑ, ως ισχυρότερη ορμόνη από το ΙΒΑ (από George 1993), προκάλεσε εκτός από την τοξικότητα, και τα μεγαλύτερα ποσοστά ριζοβολίας. Από προηγούμενες μελέτες έχει αναφερθεί ότι εμφανίζεται διαφορά στον τρόπο που επηρεάζει κάθε αυξίνη τα φυτάρια, γεγονός που πιθανόν οφείλεται στις διαφορές στον τρόπο πρόσληψης, μεταφοράς και μεταβολισμού τους από τα έκφυτα (De Klerk et al. 1997).

Επομένως, θα ήταν δυνατό να εξαχθεί η υπόθεση ότι η υψηλότερη θερμοκρασία προωθεί την αυξημένη πρόσληψη και μεταβολισμό των αυξινών από τα έκφυτα.

Η υπόθεση αυτή θα μπορούσε επίσης να εξηγήσει την αυξημένη τοξικότητα που επάγεται από το ΝΑΑ, η οποία τελικά προκαλεί αναστολή της επιμήκυνσης των ριζών λόγω της μεγαλύτερης διάρκειας καλλιέργειας κατά την εφαρμογή χαμηλότερης θερμοκρασίας, και επομένως τα φυτάρια παραμένουν εκτεθειμένα στις τοξικές συγκεντρώσεις του ΝΑΑ για μεγαλύτερο διάστημα (Skiada et al.

2009).

Η προσθήκη αυξίνης στο θρεπτικό υπόστρωμα σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις από τις κατάλληλες είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία κάλλων, κάτι που παρατηρήθηκε εντονότερα παρουσία ΝΑΑ. Οι αυξίνες είναι γνωστό ότι επάγουν τη ριζογένεση αλλά συγχρόνως αναστέλλουν την επιμήκυνση των ριζών, ειδικά σε υψηλές συγκεντρώσεις (Chee et al. 1984). Οι υψηλές συγκεντρώσεις ΙΒΑ προκαλούν τη δημιουργία παχύτερων ριζών, ενώ οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις προωθούν την ικανοποιητική ανάπτυξη τόσο του ριζικού όσο και του βλαστικού συστήματος (Roubelakis-Angelakis and Zivanovitc 1991).

Τα ποσοστά ριζοβολίας και στις δύο θερμοκρασίες καλλιέργειας για το Αγιωργίτικο και τη Μαλαγουζιά ήταν υψηλότερα στις μεταχειρίσεις με ΝΑΑ παρά με ΙΒΑ, ενώ το αντίθετο παρατηρήθηκε στην περίπτωση του Ξινόμαυρου, γεγονός που πιθανόν οφείλεται στην έντονη γενετική ποικιλότητα που παρουσιάζεται στο γένος Vitis (Peros et al. 1998; Roubelakis-Angelakis and

Zivanovitc 1991) και πιθανό να σχετίζεται με την ανοχή που επιδεικνύει η κάθε ποικιλία στην τοξικότητα που προέρχεται από το ΝΑΑ. Εντούτοις, η ριζοβολία και των τριών ποικιλιών υπερτερούσε παρουσία ΙΒΑ σε σχέση με το ΝΑΑ, αποτέλεσμα που συμφωνεί και με αυτά άλλων ερευνητών (Chee and Pool 1987), εξαιτίας και πάλι των τοξικών επιπτώσεων του τελευταίου στα φυτάρια.

Η μορφολογία των φυταρίων στο τέλος της in vitro ριζοβολίας προσδιορίζει την ex vitro επιβίωσή τους (Chee et al. 1984). Η καλή φυσιολογική κατάσταση που επιδείκνυαν τα φυτάρια και των τριών ποικιλιών κατά το τέλος των πειραμάτων ριζοβολίας στα υποστρώματα όπου χρησιμοποιήθηκε το ΙΒΑ, αντανακλάται στα αποτελέσματα του εγκλιματισμού τους. Γενικά, δεν παρουσιάστηκε κάποιο πρόβλημα κατά τη διαδικασία εγκλιματισμού και των τριών ποικιλιών, μάλιστα τα ποσοστά επιτυχίας κυμαίνονταν από 63,2% έως 100% για το Αγιωργίτικο, από 60% έως 100% για τη Μαλαγουζιά και από 30%

έως 100% για το Ξινόμαυρο.

Το πρόβλημα που πρέπει να αντιμετωπιστεί κατά τη διαδικασία του εγκλιματισμού είναι η απώλεια υγρασίας κυρίως με τη μορφή της διαπνοής.

Κατά τη διάρκεια του εγκλιματισμού, τα φύλλα παχαίνουν, δημιουργώντας ισχυρή εφυμενίδα, ενώ αναπτύσσεται το μόνιμο αγωγό σύστημα στις ρίζες (από George et al. 2008), στοιχεία που βοηθούν τα φυτά να ανταπεξέλθουν στις συνθήκες του φυσικού περιβάλλοντος. Στην άμπελο, ακόμη και τα φυτάρια που δεν είχαν αναπτύξει ριζικό σύστημα ή που είχαν αναπτύξει κάλλο πριν από τη μεταφορά τους στους δίσκους στο θερμοκήπιο, κατάφεραν να επιβιώσουν κατά ένα μεγάλο ποσοστό, ίσως λόγω της ευκολίας που επιδεικνύει γενικότερα το είδος στη ριζοβολία.

Τα φυτάρια εξελίχθηκαν σε φυτά και μετά από διάστημα ενός μηνός μεταφέρθηκαν σε μεγαλύτερες γλάστρες σε σκίαστρο.

4.3. Εξυγίανση

Η υγειονομική κατάσταση της αμπέλου είναι ιδιαίτερα υποβαθμισμένη και η εφαρμογή προγραμμάτων για τη βελτίωσή της είναι πλέον επιτακτική ανάγκη (Rumbos et al. 2000, Martelli 2003). Τα δεδομένα καταδεικνύουν την παρουσία 11 ιών και ασθενειών που οφείλονται σε ιούς, από τις οποίες η ασθένεια της συστροφής των φύλλων (grapevine leafroll disease) και της βοθρίωσης του κορμού (rugose wood) είναι οι κρισιμότερες (Rumbos et al.

2000). Στα κράτη-μέλη της Ευρωπαϊκής Ένωσης απαιτείται πλέον η παραγωγή και διακίνηση πολλαπλασιαστικού υλικού απαλλαγμένου από τους ζημιογόνους ιούς (Rowhani et al. 2005).

Προς αυτή την κατεύθυνση και προκειμένου να παραχθούν φυτά αμπέλου απαλλαγμένα από ιούς έχει δοκιμαστεί πληθώρα τεχνικών. Εξυγιασμένα φυτά έχουν προκύψει μετά από εφαρμογή θερμοθεραπείας (Goheen and Luhn 1973, Doazan et al. 1979), συνεχή μικροπολλαπλασιασμό αναπτυσσόμενων μικροβλαστών (Stellmach 1980), μικροεμβολιασμό (Engelbrecht and Schwerdtfeger 1979, Benin and Grenan 1984), in vitro καλλιέργεια μεριστωμάτων, βλαστικών κορυφών και τμημάτων βλαστού με οφθαλμούς (Barlass et al. 1982, Barlass 1987, Jákó 1989, Mannini and Gribaudo 1999, Buciumeanu and Visoiu 2000), καλλιέργεια εμβρύων (Goussard et al. 1991) και χημειοθεραπεία (Weiland et al. 2003, Panattoni et al. 2007a, b). Σε πολλές εργασίες έχουν συνδυαστεί αυτές οι μέθοδοι με θερμοθεραπεία πριν ή μετά την in vitro εγκατάσταση των φυτών (Gifford and Hewitt 1961, Galzy 1964, Harris and Stevenson 1979, Monette 1986a, Savino et al. 1990, Barba et al. 1992, Staudt and Kassemeyer 1994, Leonhardt et al. 1998, Γραμματικάκη και συν.

2005, Skiada et al. 2009).

Για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων εξυγίανσης είναι απαραίτητο να υπάρχει ένας αξιόπιστος και ευαίσθητος ιολογικός έλεγχος. Όπως έχει ήδη αναφερθεί (κεφάλαια 2-4), τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ελέγχθηκαν με ένθετη RT-PCR (Dovas and Katis 2003a, b) για τη διάγνωση των ιών GLRaV-1 και GRSPaV.

4.3.1. Συνδυασμός θερμοθεραπείας και καλλιέργειας μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών

Η καλλιέργεια μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών σε συνδυασμό με θερμοθεραπεία που δοκιμάστηκε σε αυτή τη μελέτη ήταν επιτυχής, με αποτέλεσμα τη δημιουργία φυτών Αγιωργίτικου και Μαλαγουζιάς απαλλαγμένων από τους ιούς GLRaV-1 και GRSPaV. Η εξυγίανση του Ξινόμαυρου δεν κατέστη δυνατή εξαιτίας του πολύ μικρού ποσοστού επιβίωσης των φυταρίων μετά το τέλος της θερμοθεραπείας.

Η απαλλαγή από τον GLRaV-1 ήταν ευκολότερη από αυτήν του GRSPaV, με οποιονδήποτε από τους δύο τύπους καλλιέργειας ιστών και αν ακολουθήθηκε, αποτελέσματα που συμφωνούν με αυτά των Mannini (2003) και Gribaudo et al. (2006). Έχει αναφερθεί ότι, γενικά η απαλλαγή από τους Clostero-ιούς, όπως για παράδειγμα από τον GLRaV-1, είναι ευκολότερη από αυτήν του GRSPaV (από Gribaudo et al. 2006). Η δυσκολία εξυγίανσης από τον GRSPaV με in vitro και in vivo θερμοθεραπεία και μεριστωματική καλλιέργεια είναι γνωστή και έχει αναφερθεί και κατά το παρελθόν (Minafra and Boscia 2003, Gribaudo et al. 2006). Η δυσκολία εξάλειψης του GRSPaV έγκειται στο γεγονός ότι αυτός εντοπίζεται στο παρέγχυμα και έχει τη δυνατότητα να εισέρχεται στα μεριστωματικά κύτταρα. Από προηγούμενες μελέτες έχει δειχθεί ότι ο ιός εντοπίζεται ακόμη και στους γυρεόκοκκους των μολυσμένων φυτών και μπορεί να μεταδοθεί και με τα σπέρματα (Rowhani et al. 2000, Lima et al. 2006, Nolasco et al. 2006).

Η διαδικασία της θερμοθεραπείας εμπλέκει τη διατήρηση των φυτών σε υψηλές θερμοκρασίες, πάντα όμως μέσα στα όρια της φυσιολογικής αντοχής τους, που μπορεί να διαφέρουν μεταξύ των διαφορετικών ποικιλιών για χρονικές περιόδους που κυμαίνονται από μερικές εβδομάδες έως μήνες. Κατά το διάστημα αυτό, τμήματα των φυτών ή και ολόκληρα τα φυτά μπορούν να απαλλαγούν από τους ιούς. Γενικά, η υψηλότερη θερμοκρασία και η μεγαλύτερη διάρκεια έκθεσης επάγουν τη μεγαλύτερη μείωση στον τίτλο του ιού. Πρακτικά, η επιλεγόμενη θερμοκρασία που εφαρμόζεται κατά τη διάρκεια της θερμοθεραπείας, προκύπτει από το συγκερασμό της επιβίωσης του φυτού και της εξάλειψης του ιού (Stein et al. 1991, Spiegel 1996).

Έχει υποστηριχθεί (Gribaudo et al. 1997, 2006) ότι η εξάλειψη του GRSPaV μέσω θερμοθεραπείας δεν είναι αποδοτική, σε αντίθεση με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης (Skiada et al. 2009), που αφορούν στις δύο ποικιλίες (Αγιωργίτικο και Μαλαγουζιά) που εξυγιάνθηκαν. Αυτό ίσως οφείλεται στο γεγονός ότι οι θερμοκρασίες που εφαρμόστηκαν από άλλους ερευνητές ήταν χαμηλότερες (34^oC) από αυτές της παρούσας μελέτης (στο Αγιωργίτικο μέχρι 40^oC και στη Μαλαγουζιά 36^oC). Η επιλογή της ανώτερης θερμοκρασίας φάνηκε αφενός να εξαρτάται από την αντοχή της κάθε ποικιλίας και αφετέρου από την καταλληλότητα του υποστρώματος που είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή λιγότερο καταπονημένων φυταρίων, ικανών να αντιμετωπίσουν τις υψηλές θερμοκρασίες. Αντίστοιχη ήταν και η επίδραση του χρόνου εφαρμογής της θερμοθεραπείας, η οποία διήρκησε έξι εβδομάδες και εξαρτήθηκε από την αντίδραση των αναπτυσσόμενων φυταρίων.

Πολλοί ερευνητές (Roistacher and Kitto 1977, Roistacher 1979, Gabova 1988, Juarez et al. 1992, Robert et al. 1998) υποστηρίζουν ότι η επιτυχής εξυγίανση από τους ιούς εξασφαλίζεται από το συνδυασμό της θερμοθεραπείας με καλλιέργεια ιστών, όμως το πρόγραμμα της θερμοθεραπείας φαίνεται να διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο. Η εφαρμογή θερμοθεραπείας με διαφορετικές θερμοκρασίες (εύρους 5^οC) κατά τη διάρκεια της ημέρας και της νύχτας που ακολουθήθηκε από καλλιέργεια ιστών, ήταν αποτελεσματική στην εξυγίανση των μανταρινιών από τον Citrus tatter leaf virus (CTLV) (από Koizumi 1984).

Επιπρόσθετα, οι Ramirez-Malagon et al. (2006) παρήγαγαν δύο εμπορικές ποικιλίες σκόρδου απαλλαγμένες από τους Potyvirus εφαρμόζοντας θερμοθεραπεία με θερμοκρασίες που αυξάνονταν σταδιακά ανά εβδομάδα. Οι Valero et al. (2003) παρατήρησαν ότι στη φύση, στη Murcia της Ισπανίας, επιτυγχάνεται μια μορφή θερμοθεραπείας στην ποικιλία αμπέλου Napoleon, κατά τους καλοκαιρινούς μήνες όταν η θερμοκρασία της ημέρας αγγίζει τους 38-40^oC και τη νύχτα κατεβαίνει στους 20-22^oC. Επομένως, η διαφορά της θερμοκρασίας μεταξύ ημέρας και νύχτας φαίνεται να επιδρά θετικά στην εξάλειψη των ιών. Στην παρούσα μελέτη η θερμοκρασία ήταν διαφορετική για τη διάρκεια της ημέρας και της νύχτας και αυξανόταν σταδιακά κάθε εβδομάδα.

Η παραγωγή εξυγιασμένων φυτών πιστοποίησε την επιτυχία του

θερμοκρασιακού προγράμματος που ακολουθήθηκε, ακόμη και έναντι ενός δύσκολου στην απαλλαγή ιού, όπως ο GRSPaV.

Ο ρυθμός αντιγραφής πολλών ιών που προσβάλλουν τα φυτά μειώνεται σημαντικά όταν ο ξενιστής αναπτύσσεται σε αυξημένες θερμοκρασίες. Η επίδραση της αυξημένης θερμοκρασίας για παρατεταμένο χρονικό διάστημα στο ιικό γονιδίωμα δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως (Sharma et al. 2008). Οι Nyland and Goheen (1969) έχουν προτείνει ένα πιθανό μηχανισμό της ιικής καταστολής. Δεδομένου ότι οι ιοί διαθέτουν χαμηλότερο θερμικό σημείο θανάτου από τα κύτταρα του ξενιστή, η επίδραση της θερμοκρασίας σε αυτούς είναι διαφορετική, επιτρέποντας την ανάκαμψη και εξυγίανση του φυτού στο τέλος της διαδικασίας. Κατά τη διάρκεια της θερμοθεραπείας ο πολλαπλασιασμός του παθογόνου αναστέλλεται και το επάκριο μερίστωμα απαλλάσσεται από τον ιό. Αυτός είναι και ο λόγος της ανεπάρκειας της μεθόδου μετά από την εφαρμογή της σε βλαστούς σε κατάσταση λήθαργου (Cooper and Walkey 1978).

Η επιτυχία της μεθόδου στηρίζεται στην αρχή της άνισης κατανομής του ιού στα φυτικά τμήματα (Krylova et al. 1973). Σύμφωνα με τους Ding (1998), Oparka et al. (1999) και Lucas (2006), η κατανομή των ιών σχετίζεται με την ανάπτυξη των πλασμοδεσμών και την ικανότητά τους να υποστηρίξουν την κίνησή τους. Οι πλασμοδέσμες ρυθμίζουν την επικοινωνία των κυττάρων και εξυπηρετούν τη μεταξύ των κυττάρων μετακίνηση των ιών. Λόγω του ότι η μεριστωματική περιοχή της κορυφής του βλαστού μέσω ταχύτατης ανάπτυξης απομακρύνεται από τα προσβεβλημένα κύτταρα γρηγορότερα από τη μετακίνηση που επιτυγχάνουν τα ιικά σωμάτια (Monette 1983), υπάρχει δυνατότητα αποκοπής των νέων βλαστικών κορυφών και καλλιέργειά τους προκειμένου να επιτευχθεί η αναγέννηση φυτών απαλλαγμένων από τους ιούς (Gella and Errea 1998).

Υπάρχει όμως και άλλη υπόθεση για την επεξήγηση της δυνατότητας εξυγίανσης μέσω της θερμοθεραπείας. Σύμφωνα με μελέτη των Wang et al.

(2008), όπου στα φυτά εφαρμόστηκε θερμοθεραπεία για πέντε ημέρες, παρατηρήθηκε δραστική μείωση του τίτλου του RNA του Raspberry bushy dwarf virus (RBDV) από τις βλαστικές κορυφές και τα φύλλα των φυτών, ο οποίος ήταν μόλις ανιχνεύσιμος για τις επόμενες οκτώ ημέρες. Ο ιός θεωρείται

ιδιαίτερα δύσκολος στην εξάλειψη, δεδομένης της παρουσίας του στις μεριστωματικές περιοχές, όπως και ο GRSPaV. Τα αποτελέσματα συνηγορούν στο γεγονός ότι το ιικό RNA τελικά αποδιοργανώθηκε στα φύλλα και στις βλαστικές κορυφές κατά τη διάρκεια της θερμοθεραπείας, αφού ο χρόνος εφαρμογής της μεθόδου ήταν μικρός για να επιτευχθεί η ανάπτυξη του φυτού.

Τα δεδομένα θα μπορούσαν να εξηγηθούν από την ενίσχυση της σίγησης του RNA (RNA silencing), τον κυτταρικό μηχανισμό στόχευσης και αποδόμησης του ιικού RNA στα φυτά.

Σε προηγούμενη μελέτη (Chellappan et al. 2005), όπου ερευνήθηκε η αποδοτικότητα της σίγησης του ιικού RNA, βρέθηκε ότι αυτή ενισχύεται σημαντικά με την αύξηση της θερμοκρασίας. Η σίγηση του RNA είναι αποτελεσματική ακόμη και στην περίπτωση της εξάλειψης των ιών από τα μεριστώματα (Foster et al. 2002, Mochizuki and Ohki 2004, Qu et al. 2005, Schwach et al. 2005). Βέβαια, η σίγηση του RNA δεν είναι εφικτή στις περιπτώσεις όπου το ιικό γονιδίωμα είναι καψιδιωμένο (encapsidated) (Szittya et al. 2003, Chellappan et al. 2005, Qu et al. 2005). Από τα παραπάνω προκύπτει ότι πιθανόν η εξήγηση του μηχανισμού εξάλειψης ιών με τη βοήθεια της θερμοθεραπείας να είναι ο συνδυασμός της ταχύτερης ανάπτυξης των φυτών από τον πολλαπλασιασμό των ιών και της σίγησης του ιικού RNA.

Έχει παρατηρηθεί άμεση καταστολή της σύνθεσης του φυτικού και ιικού RNA, καθώς και της δραστικότητας της ιικής ρεπλικάσης διαφόρων ιών μετά από έκθεση φυτών στους 40^οC· εντούτοις, με μεταφορά των φυτών μετά από μερικές ώρες στη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης, η σύνθεση του RNA του ξενιστή επανέκαμψε άμεσα, ενώ του ιού καθυστέρησε (Dawson and Lozoya Saldana 1984). Η επίδραση στη σύνθεση του ιικού RNA θα μπορούσε να ενισχυθεί με εφαρμογή επαναλαμβανόμενων κύκλων χαμηλότερης και υψηλότερης θερμοκρασίας, οπότε θα προέκυπταν εξυγιασμένα φυτικά τμήματα σε μικρό χρονικό διάστημα (Stein et al. 1991), πρακτική που ακολουθήθηκε και στην παρούσα μελέτη, αν και σε μικρότερο θερμοκρασιακό εύρος, και φάνηκε αποτελεσματική στην περίπτωση τόσο του GLRaV-1 όσο και του GRSPaV.

Από τα αποτελέσματά μας προκύπτει ότι και για τους δύο ιούς υπάρχει δυνατότητα εξυγίανσης τόσο από μικρά (0,1-0,2 mm) όσο και από μεγαλύτερα (0,5 mm) τμήματα του βλαστού, τα μεριστώματα και τις βλαστικές κορυφές,

αντίστοιχα, με υψηλότερα ποσοστά εξυγίανσης και για τους δύο ιούς μετά από τη μεριστωματική καλλιέργεια. Η εφαρμογή της καλλιέργειας μεριστωμάτων (Barlass et al. 1982, Staudt and Kassemeyer 1994) σε συνδυασμό με θερμοθεραπεία (Gifford and Hewitt 1961, Valat and Mur 1976), είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της αποδοτικότητας των μεθόδων εξυγίανσης και σε προηγούμενες μελέτες (Savino et al. 1990, Gribaudo et al. 1997, Credi and Babini 1997, Bottalico et al. 2003). Το μέγεθος του μεριστώματος είναι κρίσιμο στοιχείο της επιτυχίας της μεθόδου (Boxus and Druat, 1986). Συνήθως χρησιμοποιούνται μεριστώματα μεγέθους 0,2-0,5 mm, ενώ σύμφωνα με τους Wang et al. (2003) αυτά που είναι μικρότερα από 0,1 mm εμφανίζουν αδυναμία αναγέννησης νέων φυτών. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν μεριστώματα μεγέθους 0,1-0,2 mm, τα οποία εμφάνισαν παρόμοια μεταξύ τους ικανότητα αναγέννησης νέων φυταρίων, όμως το ποσοστό επιβίωσής τους ήταν διαφορετικό και ανάλογο του μεγέθους τους, αφού τα μεγαλύτερα μεριστώματα είχαν μεγαλύτερο ποσοστό επιβίωσης. Η επιβίωση εξαρτήθηκε και από την παρουσία των καταβολών των φύλλων, όπου η απουσία τους είχε ως αποτέλεσμα τη νέκρωση του μεριστώματος (απο George 1993).

Ο συνδυασμός θερμοθεραπείας και μεριστωματικής καλλιέργειας, παρά το ότι θεωρείται ως μια αποτελεσματική μέθοδος για την εξάλειψη ζημιογόνων ιών σε μητρικά πρέμνα, χαρακτηρίζεται από ενδογενείς δυσκολίες που σχετίζονται με το είδος του ιού και τη δυνατότητα απόκρισης της ποικιλίας στις ιδιαιτερότητες της μεθόδου, τις δυσκολίες στο χειρισμό ο οποίος μπορεί να γίνει μόνο από έμπειρο και εξειδικευμένο προσωπικό, καθώς και το μεγάλο χρονικό διάστημα ανάπτυξης των μεριστωμάτων. Επιπρόσθετα, σε αυτές τις καλλιέργειες συχνά χρησιμοποιούνται αυξημένες συγκεντρώσεις κυτοκινίνης, που μπορεί να επάγει σωματοκλωνικές μεταλλάξεις (Leonhardt et al. 1998), και τελικά να προκύψουν τελείως διαφορετικά φυτά από αυτά που επιλέχθηκαν από τη διαδικασία της κλωνικής επιλογής. Εντούτοις, το χαμηλό ποσοστό επιβίωσης των μεριστωματικών κορυφών θεωρείται το πρόβλημα με τη μεγαλύτερη συχνότητα (Barba et al. 1992, Bottalico et al. 1997).

Χαρακτηριστικά είναι τα αποτελέσματα από την καλλιέργεια μεριστωμάτων των τριών ποικιλιών, όπου το Αγιωργίτικο εμφάνισε μεγαλύτερα ποσοστά επιβίωσης (55,7%) και ακολούθησε η Μαλαγουζιά (30%) και το

Ξινόμαυρο (21,42%). Η διαφορά που παρατηρήθηκε αποδίδεται κυρίως στη μη θετική ανταπόκριση των μεριστωμάτων της Μαλαγουζιάς και του Ξινόμαυρου στην καλλιέργεια.

Η αποδοτικότητα της εξυγίανσης εξαρτάται από τον ιό και το γενότυπο του ξενιστή (Kassanis 1950, Bernett et al. 1975, Walkey and Cooper 1975), που στην περίπτωση της αμπέλου σημαίνει ότι η εξυγίανση είναι εξαρτημένη από την ποικιλία αλλά και από την αλληλεπίδραση ιού-ξενιστή. Από τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προκύπτει μεγάλη διαφορά και στα ποσοστά της εξυγίανσης, που πιθανό οφείλεται στη σχέση ιού-ποικιλίας και ενισχύει τα συμπεράσματα των προηγούμενων ερευνητών.

Προκειμένου να αποφευχθούν οι δυσκολίες που αναφέρθηκαν με την καλλιέργεια μεριστωμάτων, χρησιμοποιήθηκαν οι βλαστικές κορυφές, χρήση των οποίων έχει πραγματοποιηθεί επιτυχώς και προηγουμένως για εξυγίανση από αμπελο-ιούς (Barlass and Skene 1982, Buciumeanu and Visoiu 2000).

Παρά το γεγονός ότι τα ποσοστά εξυγίανσης ήταν χαμηλότερα από αυτά της μεριστωματικής καλλιέργειας, προέκυψαν περισσότερα υγιή φυτά τόσο από τον GLRaV-1 όσο και από τον GRSPaV, ομοίως και για τη μεικτή μόλυνση (Skiada et al. 2009). Αυτό εξηγείται από το σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό επιβίωσης των φυταρίων από την καλλιέργεια των βλαστικών κορυφών.

Επομένως, με χρήση αρχικά μεγάλου αριθμού φυταρίων, που συνεπάγεται τον αντίστοιχα μεγάλο αριθμό βλαστικών κορυφών, είναι δυνατό να επιτευχθεί αυξημένος απόλυτος αριθμός εξυγιασμένων φυταρίων σε περιορισμένο χρόνο, καθώς ο ρυθμός επιβίωσής τους είναι μεγάλος. Και σε αυτή την περίπτωση καταγράφηκε διαφορά μεταξύ του ποσοστού εξυγίανσης του Αγιωργίτικου και της Μαλαγουζιάς, που πιθανό να οφείλεται στην εξαρτημένη σχέση ιού-ξενιστή και την εξαρτώμενη από την ποικιλία δυνατότητα εξυγίανσης που αναφέρθηκε και νωρίτερα και που όπως φαίνεται από την παρούσα μελέτη, ισχύει στην άμπελο όπως και σε άλλα φυτικά είδη (Kassanis 1950, Bernett et al. 1975, Walkey and Cooper 1975).

4.3.2. Χρήση αντι-ιικών ουσιών

Με στόχο την εξυγίανση των ποικιλιών Αγιωργίτικο και Μαλαγουζιά από τον GRSPaV, δοκιμάστηκε η χρήση των αντι-ιικών ουσιών Ribavirin,

Tiazofurin και Mycophenolic acid. Η χημειοθεραπεία με ουσίες που διαθέτουν αντι-ιική δράση στους ιούς των ζώων έχουν χρησιμοποιηθεί για την εξάλειψη φυτο-ιών λόγω του παρόμοιου μηχανισμού δράσης. Εντούτοις, τα αποτελέσματα εξυγίανσης είναι ελάχιστα όσον αφορά στους ιούς που προσβάλλουν ξυλώδη φυτά (Verma et al. 2005, Paunovic et al. 2007, Panattoni et al. 2007a, b). Σύμφωνα με τις ως τώρα γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη εφαρμογή αντι-ιικών ουσιών στην καταπολέμηση του GRSPaV, ενώ υπάρχουν ελάχιστες αναφορές για απαλλαγή ποικιλιών αμπέλου από ιούς GLRaV (Monette 1983, Stevenson and Monette 1983, Barba et al. 1990), από τους GVA και GLRaV-3 (Panattoni et al. 2007a, b), καθώς και από τον GFLV (Weiland et al. 2003).

Ο μηχανισμός δράσης των αντι-ιικών στοχεύει στη διακοπή ή μείωση της αντιγραφής των φυτο-ιών, επομένως επιδρούν στα βήματα του ιικού κύκλου πολλαπλασιασμού, στον οποίο εμπλέκονται και ένζυμα του ξενιστή. Σύμφωνα με τον De Clercq (2001b) το ένζυμο μονοφωσφορική δεϋδρογενάση της ινοσίνης (inosine monophosphate dehydrogenase – IMPDH) μπορεί να λειτουργήσει ως στόχος ουσιών με δράση αναστολέα της ιικής δραστηριότητας.

Η IMPDH καταλύει τη μετατροπή της 5-μονοφωσφορικής ινοσίνης σε 5- μονοφωσφορική ξανθοσίνη κατά τη βιοσύνθεση των νουκλεοτιδίων που έχουν ως βάση τη γουανίνη, δράση που έχει ως έμμεσο αποτέλεσμα να επηρεάζεται αρνητικά και η βιοσύνθεση των νουκλεοτιδίων με αδενίνη (Shu and Nair 2008).

Η αναστολή της σύνθεσης των πουρινών προκαλεί διακοπή της σύνθεσης του DNA και RNA (Franchetti at al. 1996), που έχει ως αποτέλεσμα τη φυτοτοξικότητα.

Η επίδραση των αντι-ιικών είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση της αναμενόμενης τοξικότητας στα φυτάρια που σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης ήταν διαφορετική για την κάθε ποικιλία, και τα συμπτώματά της ήταν εντονότερα με την αύξηση της συγκέντρωσης της αντι-ιικής ουσίας, παρατήρηση που συμφωνεί και με αυτήν των Panattoni et al. 2007a. Και για τις δύο ποικιλίες πιο φυτοτοξικό αποδείχθηκε το Tiazofurin, ακολούθησε το Ribavirin, ενώ το Mycophenolic acid προκάλεσε το μικρότερο τοξικό αποτέλεσμα. Συγκρίνοντας την απόκριση της κάθε μίας ποικιλίας μετά από εφαρμογή του ίδιου αντι-ιικού, η Μαλαγουζιά αποδείχθηκε πιο ανθεκτική από

το Αγιωργίτικο στη μεμονωμένη επίδραση των Tiazofurin και Mycophenolic acid, σε όλες τις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν. Ενισχύεται και πάλι η παρατήρηση των Torregrosa and Bouquet (1996) ότι οι διαφορετικές ποικιλίες αμπέλου αποκρίνονται διαφορετικά λόγω της γενετικής παραλλακτικότητας που παρουσιάζει το είδος V. vinifera. Αυτός μπορεί να είναι ο λόγος της διαφορετικής ανθεκτικότητας των δύο ποικιλιών στην ίδια ουσία, όπως επίσης και η πιθανή ενεργοποίηση άλλων μηχανισμών αποτοξίκοποίησης. Ωστόσο, μετά από εφαρμογή του συνδυασμού των αντι-ιικών η Μαλαγουζιά αποδείχθηκε πιο ευαίσθητη από το Αγιωργίτικο, έκφυτα του οποίου επιβίωσαν παρουσία 20 μg/ml Tiazofurin και 40 μg/ml Mycophenolic acid. Αξιοσημείωτη είναι η παρατήρηση της μείωσης της θνησιμότητας του Αγιωργίτικου μετά από τη συνδυασμένη χρήση 20 μg/ml Tiazofurin και 40 μg/ml Mycophenolic acid, συγκρινόμενη με τη μεταχείριση μόνο 20 μg/ml Tiazofurin (Πίνακες 3.27, 3.28). Μία πιθανή εξήγηση, που όμως χρίζει περαιτέρω διερεύνησης, είναι η ενεργοποίηση ενός επιπλέον μηχανισμού αποτοξίκοποίησης παρουσία των δύο αντι-ιικών.

Η παρατήρηση της διαφορετικής εκδήλωσης φυτοτοξικότητας μεταξύ των διαφόρων ποικιλιών έχει αναφερθεί και από τους Panattoni et al. (2007a, b) στις ιταλικές ποικιλίες Sangiovese και Sagrantino. Όπως και στα δικά μας αποτελέσματα, το Tiazofurin αποδείχθηκε τοξικότερο στο Sangiovese από το Mycophenolic acid (Panattoni et al. 2007a). Βέβαια, στη συγκεκριμένη ποικιλία ολική θνησιμότητα καταγράφηκε στα 150 μg/ml της ουσίας, που είναι ιδιαίτερα υψηλότερη από τα 20 μg/ml που προκάλεσαν 100% θνησιμότητα τόσο στο Αγιωργίτικο όσο και στη Μαλαγουζιά. Επιπρόσθετα, το Mycophenolic acid στη συγκέντρωση των 250 μg/ml προκάλεσε 80% θνησιμότητα στα έκφυτα της ποικιλίας Sangiovese (Panattoni et al. 2007a), παρατήρηση που καταγράφηκε μόλις στα 30 μg/ml στο Αγιωργίτικο. Σε αντίθεση με τις τοξικές επιπτώσεις των Tiazofurin και Mycophenolic acid που διέφεραν από τις παρατηρήσεις άλλων ερευνητών, η τοξικότητα του Ribavirin στο Αγιωργίτικο ήταν παρόμοια με αυτήν στο Sagrantino (Panattoni et al. 2007b), όπου οι συγκεντρώσεις της ουσίας από τα 40 μg/ml και πάνω προκάλεσαν 100% θνησιμότητα στα έκφυτα και των δύο ποικιλιών. Τα στοιχεία που προαναφέρθηκαν ενισχύουν τις παρατηρήσεις των Torregrosa and Bouquet (1996) για τη διαφορετική απόκριση

των ποικιλιών αμπέλου που οφείλεται στη γενετική τους ποικιλότητα, αλλά δημιουργούν και ερωτηματικά για την επίδραση των διαφορετικών ιών στον ξενιστή, δεδομένου ότι υπάρχει σχέση εξάρτησης ιού-ξενιστή (Kassanis 1950, Bernett et al. 1975, Walkey and Cooper 1975), μεταβάλλοντας την απόκρισή του στα διάφορα ερεθίσματα του περιβάλλοντος, όπως για παράδειγμα την ανθεκτικότητά του σε επίδραση τοξικών ουσιών.

Μετά το τέλος των 80 ημερών εφαρμογής των αντι-ιικών, εξυγιασμένα φυτάρια προέκυψαν και για τις δύο ποικιλίες. Η αύξηση της συγκέντρωσης της αντι-ιικής ουσίας είχε ως αποτέλεσμα γενικά την αύξηση του ποσοστού εξυγίανσης, εκτός από τις περιπτώσεις όπου πολύ μικρός αριθμός εκφύτων επιβίωσε της φυτοτοξικότητας και προκάλεσε ερωτηματικά στα αποτελέσματα της επιβίωσης. Παράδειγμα αποτελεί το Αγιωργίτικο, το οποίο σε συγκέντρωση 15 μg/ml Tiazofurin και 60-80 μg/ml Mycophenolic acid εμφάνισε μικρότερα ποσοστά εξυγίανσης από τις αμέσως προηγούμενες συγκεντρώσεις των αντίστοιχων αντι-ιικών. Αυτή η παρατήρηση θα μπορούσε να εξηγηθεί από τον πολύ μικρό αριθμό φυταρίων που επιβίωσαν και δεν ήταν εφικτό να υπάρχει μια αξιόπιστη σύγκριση.

Μεγαλύτερα ποσοστά εξυγίανσης από την εφαρμογή των μεμονωμένων αντι-ιικών παρατηρήθηκαν στο Αγιωργίτικο από ό,τι στη Μαλαγουζιά. Η σχέση εξάρτησης του ρυθμού εξυγίανσης από την ποικιλία και τον ιό πιθανόν οφείλεται στη διαφορετική επίδραση του ιού στις διαφορετικές ποικιλίες και στη σχέση ιού-ξενιστή που έχει ήδη αναφερθεί και σε άλλα φυτά (Kassanis 1950, Bernett et al. 1975, Walkey and Cooper 1975). Μία άλλη πιθανή εξήγηση για τη διαφοροποίηση των αποτελεσμάτων εξυγίανσης βασίζεται και πάλι στη γενετική ποικιλότητα των ποικιλιών αμπέλου (Torregrosa and Bouquet 1996).

Όπως ήδη αναφέρθηκε, η τοξική επίδραση που εκδηλώθηκε στη Μαλαγουζιά δεν ήταν τόσο έντονη όπως στην περίπτωση του Αγιωργίτικου, πιθανό λόγω της διαφορετικής ικανότητας του φυτού να μεταβολίζει την τοξική ουσία. Αυτό θα μπορούσε να συνεπάγεται την απενεργοποίηση του αντι-ιικού στη Μαλαγουζιά, που ακολούθως το καθιστά αδύναμο στην αντιμετώπιση ενός ιού και μάλιστα έμμονου στην εξυγίανση, όπως ο GRSPaV. Μια τρίτη εκδοχή θα μπορούσε να αποδοθεί στη γενετική παραλλακτικότητα των στελεχών που συνθέτουν τους πληθυσμούς του GRSPaV άλλων συμπτωματικών και άλλων όχι (Meng et al.

2005, Nolasco et al. 2006), που μπορεί να επηρεάζουν την εμμονή των ιών, προάγοντας διαφορετική αντίδραση στις μεθόδους εξυγίανσης.

Μετά την εφαρμογή μεμονωμένων αντι-ιικών, το υψηλότερο ποσοστό εξυγίανσης από τον GRSPaV για το Αγιωργίτικο καταγράφηκε στα 10 μg/ml Tiazofurin (80%), 30 μg/ml Ribavirin (62,5%) και 20 μg/ml Mycophenolic acid (85,7%) (Πίνακας 3.27). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν μεγαλύτερη αποδοτικότητα της χημειοθεραπείας από ό,τι ο συνδυασμός θερμοθεραπείας και καλλιέργειας μεριστωμάτων (67,6%) ή βλαστικών κορυφών (50,5%) (Skiada et al. 2009). Επομένως, η χημειοθεραπεία με χρήση Tiazofurin, Ribavirin και Mycophenolic acid φαίνεται να είναι η πιο πρόσφορη τεχνική για την εξάλειψη του GRSPaV. Η εξυγίανση από άλλους ιούς, όπως ο GLRaV-1 μέσω θερμοθεραπείας και καλλιέργειας μεριστωμάτων ή βλαστικών κορυφών οδηγεί στην παραγωγή μεγαλύτερου ποσοστού εξυγιασμένων φυτών, αλλά για τον GRSPaV οι συμβατικές μέθοδοι εξυγίανσης συνήθως δεν παρέχουν ικανοποιητικά αποτελέσματα (Gribaudo et al. 2006). Μέχρι πρόσφατα (Gribaudo et al. 2006) μόνο μέσω της σωματικής εμβρυογένεσης έχει επιτευχθεί 100% εξυγίανση για τον GRSPaV. Το ίδιο ποσοστό καταγράφηκε στο Αγιωργίτικο μετά τη συνδυασμένη εφαρμογή 20 μg/ml Tiazofurin και 40 μg/ml Mycophenolic acid (Πίνακας 3.28). Η ενίσχυση της εξυγίανσης μετά από τη σύγχρονη εφαρμογή των δύο ουσιών παρατηρήθηκε και από τους Panattoni et al. 2007b στην ποικιλία Sagrantino, που εξηγείται από τη διαφορετική δράση των δύο αναστολέων στο ίδιο ένζυμο (IMPDH) (κεφάλαιο 1.4.2)

Τα αποτελέσματα φυτοτοξικότητας και εξυγίανσης της παρούσας μελέτης διαφέρουν από αυτά άλλων ερευνητών που μελέτησαν την εξυγίανση της αμπέλου από ιούς μέσω χημειοθεραπείας (Weiland et al. 2003, Panattoni et al.

2007a, b) λόγω της διαφορετικής σχέσης μεταξύ των ιών και των ξενιστών (Kassanis 1950, Bernett et al. 1975, Walkey and Cooper 1975), την πολυπλοκότητα που εμφανίζουν οι διαφορετικοί ιοί στην απόδοση των μεθόδων εξυγίανσης (Gribaudo et al. 2006, βλέπε Gribaudo et al. 2006, Panattoni et al.

2007b) και στο διαφορετικό αρχικό δείγμα εκφύτων στο οποίο εφαρμόζεται η χημειοθεραπεία. Επιπρόσθετα, τα διαφορετικά αποτελέσματα πιθανόν οφείλονται και στο διαφορετικό χρόνο εφαρμογής των ουσιών. Εξαιτίας αυτών των παρατηρήσεων, το πειραματικό μέρος επαναλήφθηκε δύο φορές, όπου

χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 60 έκφυτα και η διάρκεια της θεραπείας ήταν 80 ημέρες, στοιχεία μεγαλύτερα των μέχρι τώρα εφαρμογών.

Από τη σύγκριση των μεθόδων εξυγίανσης που εφαρμόστηκαν για την απαλλαγή των ποικιλιών αμπέλου Αγιωργίτικο και Μαλαγουζιά από τους ιούς GLRaV-1 και GRSPaV προέκυψαν θετικά και αρνητικά στοιχεία για την κάθε μία. Η θερμοθεραπεία σε συνδυασμό με τη μεριστωματική καλλιέργεια είναι μία τεχνική που, ενώ εγγυάται υψηλό ρυθμό εξυγίανσης, ο βαθμός επιβίωσης των εκφύτων που συνεπάγεται και τον απόλυτο αριθμό των φυταρίων είναι μικρός. Επίσης, ενώ πρόκειται για μια τεχνική η οποία έχει ξεφύγει πλέον από το πειραματικό στάδιο, δεν είναι εύκολο να χρησιμοποιηθεί σε καταστάσεις ρουτίνας για μαζική εξυγίανση φυτών, καθώς είναι χρονοβόρα και χρειάζεται λεπτούς χειρισμούς από εξειδικευμένο προσωπικό. Επιπρόσθετα, οι σωματοκλωνικές μεταλλάξεις που μπορεί να προκύψουν τόσο από την εφαρμογή υψηλών θερμοκρασιών αλλά και συγκεντρώσεων κυτοκινίνης στα μεριστώματα, συγκαταλέγονται στα αρνητικά της μεθόδου.

Παρόμοιο κίνδυνο με τις σωματοκλωνικές μεταλλάξεις εξαιτίας της υψηλής θερμοκρασίας διατρέχουν και τα φυτάρια που προέρχονται από εφαρμογή θερμοθεραπείας και καλλιέργειας βλαστικών κορυφών. Η μέθοδος αυτή, ενώ δεν προσφέρει υψηλά ποσοστά εξυγίανσης, μπορεί να παρέχει μεγάλο απόλυτο αριθμό εξυγιασμένων φυτών, ακόμη και από δύσκολους στην εξυγίανσή τους ιούς, όπως ο GRSPaV, λόγω α) του μεγάλου ρυθμού επιβίωσης των φυταρίων και β) της ευκολίας των χειρισμών που συνεπάγεται την εφαρμογή της μεθόδου σε πολύ μεγάλο αριθμό εκφύτων, εκμηδενίζοντας έτσι το μικρό ρυθμό εξυγίανσης.

Η χημειοθεραπεία με τη χρήση αντι-ιικών ουσιών είναι μία νέα μεθοδολογία στην αντιμετώπιση ιών των ξυλωδών φυτών. Με την επίτευξη της κατάλληλης συγκέντρωσης της κατάλληλης ουσίας μπορεί να επιτευχθεί ακόμη και 100% εξυγίανση των φυτών. Όμως, εξαιτίας της επαγόμενης φυτοτοξικότητας, το ποσοστό επιβίωσης των εκφύτων είναι μικρό. Στα αρνητικά της μεθόδου συγκαταλέγονται επίσης το μεγάλο κόστος των εφαρμοζόμενων ουσιών, που τις καθιστά απαγορευτικές για μαζικούς ελέγχους, όπως επίσης και η τοξικότητα που προκαλούν στον άνθρωπο και απαιτούν πολύ ακριβείς και λεπτούς χειρισμούς, καθώς και πληθώρα προφυλάξεων κατά τη

χρήση και απόρριψή τους. Οι περισσότερες από αυτές τις ουσίες είναι παράγοντες που χρησιμοποιούνται σε χημειοθεραπείες κατά της οξείας λευχαιμίας (Jayaram et al. 2002), του AIDS, της ηπατίτιδας Β, του δάγγειου πυρετού (Gong et al. 1999, Diamond et al. 2002) κλπ. Άγνωστη παραμένει επίσης η επίδρασή τους στα φυτά, αν και από την ηλεκτρονική μικροσκοπία (κεφάλαιο 3.4.3) παρατηρήθηκε η εμφάνιση πλαστοσφαιριδίων στους χλωροπλάστες, ένδειξη έντονης καταπόνησης.

Κάτι ακόμη που χρήζει διερεύνησης είναι το αν οι αντι-ιικές ουσίες συσσωρεύονται στη γύρη και στους ιστούς των φυτών και αν επηρεάζουν το γενότυπο με μεταλλάξεις (Panattoni et al. 2007a) και τον καρπό τους, αντίστοιχα. Η επίδραση στο γενότυπο θα μπορούσε να προκαλέσει σοβαρά προβλήματα σωματοκλωνικών μεταλλάξεων στις ποικιλίες. Έτσι, στην περίπτωση της αμπέλου μπορεί να επηρεαστούν ακόμη και τα οινολογικά χαρακτηριστικά του παραγόμενου κρασιού. Επομένως, η χρήση τέτοιων ουσιών πρέπει να διερευνηθεί εμπεριστατωμένα, αρχικά στο εργαστήριο και στη συνέχεια σε μικρές, απόλυτα ελεγχόμενες καλλιέργειες, πριν χρησιμοποιηθούν σε μεγάλο εύρος, προκειμένου να αποφευχθούν τα πιθανά προβλήματα.

Από τα παραπάνω συνάγεται ότι η ασφαλέστερη, λιγότερο χρονοβόρα και περισσότερο οικονομική μέθοδος εξυγίανσης φαίνεται να είναι ο συνδυασμός της θερμοθεραπείας με την καλλιέργεια βλαστικών κορυφών. Και από αυτήν τη μεθοδολογία πάντως πρέπει να ακολουθήσουν ιολογικοί έλεγχοι με τη χρήση βιοδεικτών, σύμφωνα με τις οδηγίες της EPPO (1998) και τέλος, απομένει να διαπιστωθεί η ποιότητα του παραγόμενου κρασιού.

4.4. Μικροσκοπία

Πραγματοποιήθηκε συγκριτική μορφομετρική και ανατομική μελέτη σε νεαρά και ώριμα φύλλα της ποικιλίας Αγιωργίτικο που προήλθαν από προσβεβλημένο και εξυγιασμένο - μέσω θερμοθεραπείας - φυτού γλάστρας και από προσβεβλημένο και εξυγιασμένο - μέσω χημειοθεραπείας - φυτού ιστοκαλλιέργειας. Από τα αποτελέσματα της οπτικής μικροσκοπίας αποκαλύφθηκαν αρκετές διαφορές μεταξύ των κατηγοριών μελέτης (κεφάλαιο 3.4.2). Η κυριότερη από αυτές ήταν η στατιστικά σημαντική διαφορά της έκτασης που καταλαμβάνουν οι χλωροπλάστες του δρυφακτοειδούς και σπογγώδους παρεγχύματος στο ώριμο φύλλο του εξυγιασμένου - μέσω θερμοθεραπείας - και προσβεβλημένου φυτού γλάστρας, με αυτούς του πρώτου να καλύπτουν μεγαλύτερη επιφάνεια από αυτούς του δευτέρου.

Από προηγούμενες μελέτες (Sampol et al. 2003) έχει βρεθεί μείωση του ρυθμού της φωτοσύνθεσης στην άμπελο ακόμη και στο 50% εξαιτίας της παρουσίας διαφόρων ιών. Η επακόλουθη μείωση της παραγωγής έχει συσχετιστεί με αυτήν την πτώση του ρυθμού φωτοσύνθεσης. Επιπρόσθετα, έχουν παρατηρηθεί αλλαγές στο ρυθμό της αναπνοής, της ενζυμικής δραστικότητας καθώς και της ισορροπίας των ρυθμιστών ανάπτυξης, σε φυτά αμπέλου προσβεβλημένα από ιούς (Pozsar et al. 1969, Walter 1988). Όμως παρά τις παρατηρήσεις αυτές, ο επαγώμενος από τους ιούς μηχανισμός της αναστολής της φωτοσύνθεσης δεν έχει διευκρινιστεί. Υποθέσεις υπάρχουν για πρόσδεση της καψιδιακής πρωτεΐνης του ιού στις μεμβράνες των χλωροπλαστών και στα θυλακοειδή (Zaitlin 1987, Reinero and Beachy 1989, Rahoutei et al. 2000), αναστέλλοντας τη μεταφορά ηλεκτρονίων του φωτοσυστήματος ΙΙ. Μία άλλη πιθανή εξήγηση που προκύπτει από την παρούσα μελέτη και μπορεί να ισχύει συγχρόνως με τις προηγούμενες υποθέσεις, είναι η μείωση του αριθμού των χλωροπλαστών στα μολυσμένα φυτά. Η μείωση αυτή θα μπορούσε να ερμηνεύσει τη μείωση του ρυθμού φωτοσύνθεσης, που συνεπάγεται τη μείωση στην παραγωγή, παρατήρηση που ισχύει στην περίπτωση της ασθένειας της βοθρίωσης του κορμού της αμπέλου και μπορεί να ανέλθει ακόμη και στο 70% της παραγωγής (Garau 1985).

Η παρατήρηση της μείωσης του αριθμού των χλωροπλαστών παρουσία ιολογικών προσβολών, σε συνδυασμό με την ανάγκη μελέτης των φυτών μετά

από εφαρμογή χημειοθεραπείας και των τυχόν αλλοιώσεων που μπορεί να εμφανίστηκαν, προώθησε τη λεπτομερέστερη σύγκριση των δειγμάτων, μόνο όμως των ώριμων φύλλων, αφού σε αυτά εμφανίστηκαν οι κυριότερες διαφορές, με την ηλεκτρονική μικροσκοπία. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν μία σημαντική διαφοροποίηση. Το προσβεβλημένο φυτικό υλικό και το εξυγιασμένο μετά από εφαρμογή χημειοθεραπείας εμφάνισαν πλαστοσφαιρίδια στους χλωροπλάστες, που δεν παρατηρήθηκαν στα πλαστίδια του εξυγιασμένου φυτού μετά από την εφαρμογή θερμοθεραπείας. Τα σωμάτια αυτά ήταν παρόντα στους χλωροπλάστες και των δύο τύπων παρεγχύματος, με μεγαλύτερη συχνότητα σε αυτούς του δρυφακτοειδούς.

Τα πλαστοσφαιρίδια είναι λιποπρωτεϊνικής φύσεως σωμάτια που παράγονται από τα πλαστίδια, με αριθμό που ποικίλλει ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο και το ρυθμό του μεταβολισμού του πλαστιδίου (Austin et al. 2006). Πρόκειται για ένα τύπο απόκρισης στην οξειδωτική καταπόνηση της φωτοσυνθετικής συσκευής, που μπορεί να προκληθεί εξαιτίας της καλλιέργειας σε έδαφος με υψηλές συγκεντρώσεις χαλκού (Panou-Filotheou et al. 2001), της ξηρασίας (Munne-Bosch and Alegre 2004), της γήρανσης (Austin et al. 2006), αλλά και των ιικών προσβολών (Hernandez et al. 2004).

Σε προηγούμενη μελέτη (Lichtenthaler, 1969) διατυπώθηκε η υπόθεση ότι η αύξηση του αριθμού ή του μεγέθους των πλαστοσφαιριδίων στους χλωροπλάστες κατά τη γήρανση μπορεί να οφείλεται στα λιπίδια (καροτενοειδή κλπ) που δεν καταστρέφονται κατά την αποικοδόμηση των θυλακοειδών, αλλά συσσωρεύονται στα πλαστοσφαιρίδια. Σε προέκταση αυτής της υπόθεσης, η Esau (1977) διατύπωσε την άποψη ότι η συσσώρευση πλαστοσφαιριδίων που συμβαίνει σε κάποιες των περιπτώσεων με την ιική προσβολή, μπορεί να θεωρηθεί ένδειξη της καταστροφής των μεμβρανών των θυλακοειδών.

Εμφάνιση πλαστοσφαιριδίων ή αύξηση του αριθμού τους παρουσία ιών έχει παρατηρηθεί και από άλλους ερευνητές κατά το παρελθόν, όπως από τους Russo and Martelli (1982) στο Chenopodium quinoa παρουσία του Saquaro cactus virus, από τους Zechmann et al. (2003) στα φυτά της κολοκύθας Styrian από τον zucchini yellow mosaic virus, όπου η εμφάνιση των πλαστοσφαιριδίων συνοδευόταν και από μείωση του αριθμού των θυλακοειδών. Σε συμφωνία με τις προηγούμενες μελέτες, η παρουσία πληθώρας πλαστοσφαιριδίων στους

χλωροπλάστες του προσβεβλημένου φυτού μπορεί να ερμηνευθεί ως απόρροια της ιολογικής προσβολής και των επαγόμενων διαφοροποιήσεων της δομής του κυττάρου. Αντίστοιχα, η παρουσία αυτών των σωματίων στα εξυγιασμένα μέσω χημειοθεραπείας φυτά μπορεί να οφείλεται στην φυτοτοξικότητα που προκαλείται από την εφαρμογή της μεθόδου. Χαρακτηριστική είναι η Εικόνα 3.73 με το διαταραγμένο και άθικτο χλωροπλάστη, σε συνδυασμό με αυτά που προαναφέρθηκαν για τη μείωση του αριθμού των θυλακοειδών. Η διαταραχή των χλωροπλαστών μπορεί να αποδοθεί είτε στην επίδραση της στερέωσης είτε στη φυτοτοξικότητα εξαιτίας των αντι-ιικών ουσιών. Το φαινόμενο αυτό χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.

5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

• Για την επιτυχία της απολύμανσης καθοριστική ήταν η συλλογή βλαστών απαλλαγμένων από το βαρύ φορτίο των παθογόνων. Μεγαλύτερη επιτυχία σημειώνεται όταν τα έκφυτα προέρχονται από τα ανώτερα τμήματα των νέων βλαστών των μητρικών φυτών.

• Κατά την εγκατάσταση οι ποικιλίες εκδήλωσαν αλλαγή στις θρεπτικές απαιτήσεις, προτιμώντας αρχικά πιο «ελαφριά» υποστρώματα ως προς τα διάφορα μακροστοιχεία, πιθανόν εξαιτίας της καταπόνησής τους από την αποκοπή και την απολύμανση και στη συνέχεια πιο «βαριά» αφού τα πρώτα δεν επαρκούσαν για τη συνέχιση της καλλιέργειας. Το ίδιο συμπέρασμα ισχύει και για τους ρυθμιστές ανάπτυξης, αλλά και τη συγκέντρωσή τους.

• Κάθε μία ποικιλία αμπέλου εμφανίζει διαφορετικές απαιτήσεις, κυρίως σε μακρο- και μικρο-στοιχεία, αλλά και σε ρυθμιστές ανάπτυξης με αποτέλεσμα να χρειάζεται διαφορετικό θρεπτικό υπόστρωμα για την καλλιέργειά της. Το συμπέρασμα ισχύει για όλα τα στάδια του μικροπολλαπλασιασμού.

• Η αύξηση των συστατικών των μακροστοιχείων είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του σχηματισμού ριζών. Σημαντικός παράγοντας της ριζογένεσης φάνηκε να είναι και η συγκέντρωση του ΝΟ3-.

• Το Αγιωργίτικο, η Μαλαγουζιά και το Ξινόμαυρο είναι εξαρτημένες από την προσθήκη ΒΑ και ΝΑΑ στο θρεπτικό υπόστρωμα προκειμένου να επιτευχθεί ικανοποιητική ανάπτυξη.

• Τα υποστρώματα που βρέθηκαν πιο κατάλληλα ήταν:

Αγιωργίτικο: WPM + 0,25 μΜ ΒΑ + 0,3 μΜ ΝΑΑ Μαλαγουζιά: GAL + 0,25 μΜ ΒΑ + 0,3 μΜ ΝΑΑ Ξινόμαυρο: ZL + 0,05 μΜ ΒΑ + 0,03 μΜ ΝΑΑ

Δεδομένου ότι η συγκέντρωση των ρυθμιστών ανάπτυξης είναι πολύ μικρή, επιβεβαιώνεται η καταλληλότητα του προτεινόμενου υποστρώματος.

• Η ποικιλία Ξινόμαυρο δεν μπορεί να αναπτυχθεί in vitro απουσία ριζικού συστήματος. Τα έκφυτα παρουσιάζουν μαρασμό και νέκρωση.

• Η αύξηση της θερμοκρασίας επέδρασε θετικά στην ανάπτυξη.

Συμπεραίνεται ότι οι υψηλότερες θερμοκρασίες μπορεί να χρησιμοποιούνται όταν απαιτείται ταχεία παραγωγή νέων βλαστών και οι χαμηλότερες κατά τη διατήρηση του βασικού πολλαπλασιαστικού υλικού.

• Η αυξημένη θερμοκρασία προκάλεσε την ταχύτερη έκπτυξη νέων ριζών στις ποικιλίες Αγιωργίτικο και Μαλαγουζιά και γενικά χαρακτηρίστηκε θετική η επίδρασή της, κυρίως όταν συνδυάστηκε με το ΙΒΑ. Η υψηλότερη θερμοκρασία ήταν επιβλαβής για το Ξινόμαυρο, αφού προκάλεσε τοξικότητα και μαρασμό στα φυτάρια, είτε με εφαρμογή ΝΑΑ είτε με ΙΒΑ.

• Οι υψηλές συγκεντρώσεις του ΝΑΑ και στις δύο θερμοκρασίες ριζοβολίας προκάλεσαν τοξικότητα στα φυτάρια, δημιουργία κάλλου και ανάπτυξη μη φυσιολογικών ριζών, παρατηρήσεις που δεν σημειώθηκαν με την εφαρμογή ΙΒΑ.

• Δεδομένης της αυξημένης τοξικότητας που επάγεται από το ΝΑΑ, η υψηλότερη θερμοκρασία μπορεί να προωθεί την αυξημένη πρόσληψη και μεταβολισμό των αυξινών από τα έκφυτα.

• Παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της φυσιολογικής κατάστασης των φυταρίων κατά τη διάρκεια της ριζοβολίας και την αντίδρασή τους κατά τη σκληραγώγηση και την ex vitro επιβίωσή τους.

• Ο συνδυασμός της θερμοθεραπείας με την καλλιέργεια μεριστωμάτων ή βλαστικών κορυφών ήταν ικανοποιητικός για την εξυγίανση των ιών GRSPaV και GLRaV-1. Η εξυγίανση ήταν επιτυχής για το Αγιωργίτικο που εμφάνιζε μεικτή μόλυνση (GRSPaV και GLRaV-1), αλλά και τη Μαλαγουζιά όπου εντοπίστηκε μόνο ο GRSPaV.

• Το πρόγραμμα της θερμοθεραπείας που συνίσταται από σταδιακή αύξηση της θερμοκρασίας, εναλλαγή της μεταξύ ημέρας και νύχτας, καθώς και η μεγάλη διάρκεια της μεθόδου αποδείχθηκαν αποδοτικά, ακόμη και στην εξάλειψη του GRSPaV, που εντοπίζεται μέχρι και στις μεριστωματικές ζώνες.

• Η απαλλαγή από τον GLRaV-1 ήταν ευκολότερη από αυτήν του GRSPaV, με όποιον από τους δύο τύπους ιστοκαλλιέργειας και αν χρησιμοποιήθηκε, τα μεριστώματα (0,1-0,2 mm) ή τις βλαστικές κορυφές (0,5 cm).

• Το ποσοστό εξυγίανσης και για τους δύο ιούς ήταν μεγαλύτερο μετά τη μεριστωματική καλλιέργεια, όμως το ποσοστό επιβίωσης των εκφύτων ήταν υψηλότερο μετά την καλλιέργεια βλαστικών κορυφών, που είχε ως τελικό αποτέλεσμα να παραχθούν περισσότερα εξυγιασμένα φυτάρια.

• Σύγκριση της επιτυχίας εξυγίανσης του Αγιωργίτικου και της Μαλαγουζιάς από τον GRSPaV έδειξε ότι η απαλειφή του ιού από την πρώτη ποικιλία ήταν ευκολότερη.

• Η εξυγίανση του Αγιωργίτικου και της Μαλαγουζιάς από τον GRSPaV επιτεύχθηκε και με εφαρμογή χημειοθεραπείας, με χρήση των αντι- ιικών Tiazofurin, Ribavirin και Mycophenolic acid, μία νέα μέθοδο στην εξάλειψη φυτο-ιών που πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά για την απαλλαγή των συγκεκριμένων ποικιλιών αμπέλου από τον ιό αυτό.

• Μετά την επίδραση αντι-ιικών ουσιών καταμετρήθηκαν υψηλά ποσοστά εξυγίανσης και για τις δύο ποικιλίες, υψηλότερα παρά με θερμοθεραπεία και ιστοκαλλιέργεια. Το ποσοστό εξυγίανσης παρουσίασε εξάρτηση από την ποικιλία και τη συγκέντρωση του αντι-ιικού, μέχρι ενός ορίου.

• Η επίδραση των αντι-ιικών προκάλεσε φυτοτοξικότητα στα φυτάρια, διαφορετική για την κάθε ποικιλία, και τα συμπτώματά της ήταν εντονότερα με την αύξηση της συγκέντρωσής τους. Η σειρά τοξικότητας των αντι-ιικών ήταν Tiazofurin > Ribavirin > Mycophenolic acid.

• Η Μαλαγουζιά εμφανίζεται πιο ανθεκτική από το Αγιωργίτικο στις μεμονωμένες επιδράσεις. Όμως, οι συνδυασμοί των αντι-ιικών αποδείχθηκαν επιβλαβείς για τα φυτάρια της Μαλαγουζιάς, αφού προκάλεσαν την ολική νέκρωσή τους. Στην περίπτωση του Αγιωργίτικου παρατηρήθηκε ότι στο συνδυασμό του Tiazofurin με το Mycophenolic acid η φυτοτοξικότητα μειώθηκε, ενώ στο συνδυασμό Ribavirin και Mycophenolic acid αυξήθηκε. Μία πιθανή εξήγηση θα μπορούσε να είναι η επαγωγή ενός μηχανισμού ανοχής ή αποτοξικοποίησης που πιθανόν επάγεται από το συνδυασμό αυτών των αντι- ιικών, ή ενισχυτικής δράσης, μία τέτοια υπόθεση όμως χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.

• Η χημειοθεραπεία μπορεί να αποτελέσει μία εναλλακτική ή συμπληρωματική τεχνική στις πιο συμβατικές μεθόδους εξυγίανσης. Ωστόσο, η

υψηλή τοξικότητα, το κόστος και η πιθανή επαγωγή μεταλλαξιγένεσης των αντι-ιικών ουσιών αποτελούν ανασταλτικούς παράγοντες στην πρακτική τους εφαρμογή.

• Η πυκνότητα όγκου των χλωροπλαστών του δρυφακτοειδούς παρεγχύματος είναι μεγαλύτερη στα φυτά που έχουν καλλιεργηθεί σε γλάστρες από ό,τι σε αυτά που προέρχονται από ιστοκαλλιέργεια και περισσότερο στα ώριμα φύλλα.

• Η πυκνότητα όγκου των χλωροπλαστών στα φυτά που έχουν προσβληθεί από τον GRSPaV είναι μικρότερη από αυτήν των εξυγιασμένων.

• Τα κύτταρα του μεσοφύλλου στα εξυγιασμένα φυτά ιστοκαλλιέργειας από χημειοθεραπεία είναι πυκνότερα από ό,τι τα εξυγιασμένα φυτά γλάστρας από θερμοθεραπεία.

• Ο αριθμός των κυττάρων ταννίνης ανά μονάδα επιφάνειας του φύλλου (mm²) των προσβεβλημένων φυτών ήταν μεγαλύτερος του αντιστοίχου των εξυγιασμένων.

• Η παρουσία πλαστοσφαιριδίων στους χλωροπλάστες των προσβεβλημένων και των εξυγιασμένων μέσω χημειοθεραπείας φυτών πιθανόν οφείλεται στην καταπόνησή τους από την παρουσία του ιού και τη μέθοδο εξυγίανσης (φυτοτοξικότητα), αντίστοιχα. Η παρατήρηση χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.

• Συμπερασματικά, παρατηρήθηκε εξάρτηση της εξυγίανσης από την ποικιλία, που πιθανόν οφείλεται: 1. Στη σχέση ιού-ξενιστή. 2. Στη γενετική ποικιλότητα των ποικιλιών αμπέλου, που μπορεί να συνεπάγεται τη διαφορετική ανοχή στην καταπόνηση της θερμοθεραπείας ή το διαφορετικό ρυθμό μεταβολισμού της τοξικής ουσίας. 3. Στο μεγάλο αριθμό στελεχών που συνθέτουν τους πληθυσμούς του GRSPaV και που μπορεί να επηρεάζουν την εμμονή των ιών.

• Ακροτελεύτια, η ασφαλέστερη, ευκολότερη, λιγότερο χρονοβόρα και περισσότερο οικονομική μέθοδος εξυγίανσης είναι ο συνδυασμός της θερμοθεραπείας με την καλλιέργεια βλαστικών κορυφών.

6.1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ

ΕΞΥΓΙΑΝΣΗ ΕΛΛΗΝΙΚΩΝ ΟΙΝΟΠΟΙΗΣΙΜΩΝ ΠΟΙΚΙΛΙΩΝ ΑΜΠΕΛΟΥ ΑΠΟ ΙΟΥΣ ΜΕ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ, ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥ

ΜΙΚΡΟΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ ΤΟΥΣ Διδακτορική Διατριβή

Φωτεινή Γ. Σκιαδά

Τομέας Βοτανικής, Τμήμα Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης

Δεδομένης της προοδευτικής υποβάθμισης της καλλιέργειας αμπέλου (Vitis vinifera L.) από την παρουσία διαφόρων ιών, κρίνεται απαραίτητος ο έλεγχος των ιολογικών προσβολών μέσω της διακίνησης εξυγιασμένου πολλαπλασιαστικού υλικού. Πληθώρα τεχνικών έχει εφαρμοστεί, με αποτελεσματικότητα που κυμαίνεται και εξαρτάται τόσο από τη φύση των υπό εξάλειψη ιών όσο και από την ποικιλία αμπέλου. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η εξυγίανση τριών πολύ σημαντικών ελληνικών οινοποιήσιμων ποικιλιών αμπέλου, του Αγιωργίτικου, της Μαλαγουζιάς και του Ξινόμαυρου, από δύο σοβαρές ιώσεις.

Αρχικά εφαρμόστηκε ιολογικός έλεγχος με τη μέθοδο ELISA (DAS- και TAS-ELISA) και στη συνέχεια με εστιασμένη RT-PCR (nested RT-PCR) για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό των προσβολών. Από τα αποτελέσματα των ελέγχων βρέθηκε ότι το Αγιωργίτικο εμφάνιζε μεικτή μόλυνση από τον ιό Grapevine leafroll associated virus 1 (GLRaV-1) και τον ιό Grapevine rupestris stem pitting associated virus (GRSPaV), ενώ στη Μαλαγουζιά και το Ξινόμαυρο η προσβολή ήταν μόνο από τον GRSPaV. Ο GLRaV-1 σχετίζεται με την ασθένεια της συστροφής των φύλλων της αμπέλου (grapevine leafroll disease, GLRD), ενώ ο GRSPaV με την ασθένεια της βοθρίωσης του κορμού του Rupestris (rugose wood, RW), αλλά και με αυτήν της νέκρωσης των αγγείων της αμπέλου (grapevine vein necrosis, GVN). Πρόκειται για τρεις από τις πιο ζημιογόνες ιολογικής αιτιολογίας ασθένειες του φυτού, με επιπτώσεις τόσο στο πρέμνο όσο και στην καλλιέργεια. Από αυτούς, ο GLRaV-1 εντοπίζεται στο φλοίωμα και θεωρείται σχετικά εύκολος στην εξάλειψη, σε αντίθεση με τον GRSPaV που έχει βρεθεί ακόμη και σε μεριστωματικά κύτταρα και στη γύρη και εμφανίζει εμμονή στις μεθόδους εξυγίανσης.

Οι μέθοδοι απαλλαγής από τους ιούς που εφαρμόστηκαν και για τις τρεις ποικιλίες ήταν ο συνδυασμός θερμοθεραπείας και μεριστωματικής καλλιέργειας, αλλά και καλλιέργειας βλαστικών κορυφών. Για τις ποικιλίες Αγιωργίτικο και Μαλαγουζιά εφαρμόστηκε επίσης και χημειοθεραπεία.

Σημαντικό στοιχείο για την αποτελεσματικότητα της μεθόδου αποτέλεσε το πρόγραμμα της θερμοθεραπείας που ακολουθήθηκε. Φάνηκε ότι η παρατεταμένη διάρκεια της θερμοθεραπείας σε συνδυασμό με τις υψηλές θερμοκρασίες, με διακύμανση μεταξύ ημέρας και νύχτας, ήταν ικανοποιητική για την εξυγίανση. Τα αποτελέσματα ήταν ενθαρρυντικά για την εξάλειψη και των δύο ιών, με όποια μέθοδο και αν χρησιμοποιήθηκε.

Εξυγιασμένα φυτά μέσω θερμοθεραπείας προέκυψαν για τις ποικιλίες Αγιωργίτικο και Μαλαγουζιά. Για το Ξινόμαυρο τα αποτελέσματα ήταν αρνητικά εξαιτίας του πολύ μικρού διαθέσιμου δείγματος και της μη επιβίωσης επαρκούς αριθμού μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών για αξιόπιστο έλεγχο. Ο ρυθμός εξυγίανσης και για τις δύο ποικιλίες ήταν μεγαλύτερος μετά από την καλλιέργεια μεριστωμάτων από ό,τι μετά την καλλιέργεια βλαστικών κορυφών. Το αντίθετο όμως ισχύει για το ρυθμό επιβίωσης, ο οποίος είχε ως τελικό αποτέλεσμα περισσότερα εξυγιασμένα φυτά να προκύψουν από την καλλιέργεια των μεγαλύτερων φυτικών τμημάτων. Το ποσοστό απαλλαγής από τον GLRaV-1 ήταν μεγαλύτερο από ό,τι αυτό του GRSPaV, αποδεικνύοντας τη μεγαλύτερη ευκολία εξάλειψης του πρώτου ιού παρά του δευτέρου. Από τις δύο ποικιλίες που εξυγιάνθηκαν, το Αγιωργίτικο εμφάνισε υψηλότερα ποσοστά απαλλαγής από τον GRSPaV παρά η Μαλαγουζιά, επιβεβαιώνοντας τη σχέση ιού-ξενιστή που διευκολύνει ή δυσχεραίνει την εξυγίανση ανάλογα με την περίπτωση.

Η επίδραση της χημειοθεραπείας με τη χρήση των αντι-ιικών ουσιών Tiazofurin, Ribavirin και Mycophenolic acid εφαρμόστηκε για πρώτη φορά σε φυτά αμπέλου μολυσμένα με GRSPaV και είχε ως αποτέλεσμα την απαλλαγή από τον ιό και των δύο ποικιλιών που μελετήθηκαν. Πρόβλημα όμως αποτέλεσε η εμφάνιση φυτοτοξικότητας και στις δύο ποικιλίες, η ένταση της οποίας ήταν ανάλογη με τη συγκέντρωση του αντι-ιικού. Πιο φυτοτοξικό αποδείχθηκε το Tiazofurin και για τις δύο ποικιλίες και ακολούθησε το Ribavirin και το Mycophenolic acid, με τη Μαλαγουζιά να αποδεικνύεται πιο ανεκτική στις τοξικές επιδράσεις των μεμονωμένων αντι-ιικών, όχι όμως και στο συνδυασμό

No documento ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCES (páginas 82-85)