Recenzja pracy doktorskiej mgr Jakuba Jakowieckiego zatytułowanej:
Badania wiązania ligandów do receptora kanabinoidowego CB1 oraz innych lipidowych receptorów GPCR za pomocą metod modelowania molekularnego, której promotorem jest
prof. dr hab. Sławomir Filipek
Przesłana do recenzji praca doktorska Pana mgr. Jakuba Jakowieckiego została przygotowana w formie zbioru opublikowanych i powiązanych tematycznie artykułów naukowych, zgodnie z Ustawą Prawo o szkolnictwie wyższym i nauce z dnia 20 lipca 2018 r. (Dz. U. z 2018 r. poz. 1668).
W jej skład wchodzą trzy oryginalne publikacje, z których chronologicznie pierwsza, dwuautorska, ukazała się w Journal of Chemical Information and Modeling w 2016 r., a dwie kolejne, wieloautorskie, zostały opublikowane w czasopiśmie Molecules w 2020 i 2021 r. We wszystkich pracach Pan mgr. Jakub Jakowiecki jest pierwszym autorem, natomiast autorem korespondencyjnym jest Promotor doktoratu, profesor Sławomir Filipek (w pracy nr 3 wspólnie z Doktorantem).
Całość opracowania, oprócz stanowiących podstawę pracy doktorskiej, wymienionych wyżej publikacji, zawiera także streszczenia w języku polskim i angielskim, oraz wstęp teoretyczny nawiązujący do tematyki zrealizowanych badań. Kolejno przedstawione zostały opisy postawionych hipotez i przyjętych celów naukowych, zastosowanych metod badawczych oraz streszczenia omawianych w publikacjach wyników wraz z ich dyskusją i wnioskami. W dalszej części znajduje się lista publikacji, których współautorem jest Pan mgr. Jakub Jakowiecki (obejmująca także 8 prac niewchodzących w skład doktoratu i dwa rozdziały w książkach) oraz liczący 98 pozycji spis cytowanej literatury. Zgodnie z wymogami dotyczącymi określenia udziału własnego w publikacjach wieloautorskich, do pracy doktorskiej zostały dołączone stosowne oświadczenia Doktoranta i współautorów.
Tematyka prac stanowiących rozprawę doktorską, jest związana z zastosowaniem metod modelowania i symulacji dynamiki molekularnej w celu identyfikacji możliwych ścieżek wnikania ligandów do miejsc wiążących trzech typów receptorów związanych z białkami G (GPCR) aktywowanych przez ligandy hydrofobowe (tj. receptora kannabinoidowego CB1, sfignozyno-1- fosforanowego S1P i kwasu lizofosfatydylowego LPA), oraz analizy mechanizmu modulacji allosterycznej w receptorze CB1, i jako taka wpisuje się w główny nurt badań, kierowanej przez prof.
Filipka grupy badawczej modelowania molekularnego.
2 Należ tutaj wspomnieć, że grupa profesora Filipka specjalizuje się w badaniach receptorów GPCR z wykorzystaniem zaawansowanych metod dynamiki molekularnej, m.in. nad mechanizmem aktywacji receptorów przez zmiany konformacyjne przełączników molekularnych, rolą cząsteczek wody i jonów w receptorze, czy też przewidywaniu własności agonistycznych i antagonistycznych ligandów. Zespół opracował i udostępnia również serwis internetowy do modelowania homologicznego receptorów GPCR https://gpcrm.biomodellab.eu/. Od wielu lat intensywnie współpracuje z zagranicznymi zespołami i należy do światowej czołówki w szeroko rozumianej dziedzinie badań receptorów GPCR in silico.
We wstępie teoretycznym Doktorant w syntetyczny sposób przedstawił zagadnienia związane z tematyką badawczą, charakteryzując najpierw receptory GPCR, ich budowę, mechanizm aktywacji i główne przełączniki molekularne występujące w receptorach klasy A. Następnie wymienione zostały typy ligandów, według podziału ze względu na wpływ na aktywność receptora oraz miejsce wiązania.
Kolejno, Doktorant opisuje receptory wiążące hydrofobowe ligandy wskazując na drogi ich wnikania do miejsca ortosterycznego. Spośród stanowiących przedmiot badań typów receptorów, najwięcej miejsca poświęca receptorowi kannabinoidowemu CB1 i przykładom znanych modulatorów allosterycznych. Szczegółowo zostają opisane właściwości kannabidiolu (CBD), zwłaszcza pod kątem oddziaływań zachodzących podczas jego wiązania w miejscu allosterycznym receptora CB1.
Teoretyczną część pracy kończy krótki rozdział, dotyczący wpływu N-końca receptora CB1 na wiązanie ligandów allosterycznych oraz ortosterycznych.
Przechodząc do opisu badań własnych, Doktorant przedstawia postawione hipotezy badawcze i założone w stosunku do nich cele naukowe. Pierwsza z nich, odnosi się do drogi wnikania ligandów do ortosterycznego miejsca wiążącego receptorów lipidowych CB1, S1P i LPA1, bezpośrednio z błony komórkowej przez kanał zlokalizowany między helisami TM1 i TM7. W związku z tym, wyznaczonym w ramach pracy doktorskiej celem było przeprowadzenie symulacji dynamiki molekularnej dla potwierdzenia jej słuszności.
Punktem wyjścia do sformułowania drugiej hipotezy były wyniki, otrzymane przez Lapraire i wsp.
w eksperymentach mutagenezy, sugerujące że N-końcowe, zewnątrzkomórkowe reszty Cys98 i Cys107 mogą częściowo regulować aktywność allosteryczną CBD w receptorze CB1 bezpośrednio, albo poprzez komunikację pomiędzy miejscami allosterycznym i ortosterycznym. Założono na tej podstawie lokalizację miejsca allosterycznego w receptorze CB1 w pobliżu wiązania disulfidowego C98-C107 i określono cele naukowe obejmujące: otrzymanie stabilnej struktury receptora CB1 z pełną domeną N- końca, ustalenie jej wpływu na wiązanie ligandów ortosterycznego THC i allosterycznego CBD, wyznaczenie miejsca wiązania CBD, opis oddziaływań podczas tworzenia allosterycznego kompleksu CBD-receptor CB1 oraz zmian zachodzących w sieci oddziaływań receptora po związaniu CBD.
3 Dla weryfikacji postawionych hipotez i osiągnięcia celów badawczych zaprojektowano szereg eksperymentów in silico z wykorzystaniem wielu metod modelowania molekularnego, takich jak modelowanie homologiczne (do konstrukcji modelu receptora CB1), przygotowanie struktur krystalicznych kompleksów ligand-receptor, modelowanie pętli wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, dokowanie ligandów do miejsc wiążących (orto- i allosterycznych), pełnoatomowe symulacje dynamiki molekularnej – standardowej, sterowanej (steered molecular dynamics, SMD) i nadzorowanej (supervised molecular dynamics, SuMD), a także metody REST2 (do modelowania konformacji N-końca receptora CB1). Do analizy i wizualizacji otrzymanych wyników używano różnych narzędzi: VMD, getContacts, Pytraj, Flareplot, Gnuplot, jak również własnych skryptów i programów.
Wyniki zaprezentowane w publikacjach 1 i 2 jasno dowodzą, że w odróżnieniu od np. receptorów aminergicznych, do których ligandy wnikają bezpośrednio z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, w przypadku badanych receptorów lipidowych, droga ligandów do miejsca ortosterycznego wiedzie z błony komórkowej. Już wstępne eksperymenty dynamiki molekularnej pokazały, że wszystkie cząsteczki THC w układzie błony otoczonej wodą przechodzą do fazy lipidowej. Porównanie sił i energii dla różnych kierunków wejścia i wyjścia ligandów w modelu homologicznym receptora CB1 (publikacja 1) lub też strukturach krystalicznych wszystkich trzech receptorów lipidowych (publikacja 2), jednoznacznie wskazuje ścieżkę prowadzącą przez kanał między helisami 1 i 7. Ponieważ w procesie wiązania ligandów do receptora CB1 biorą udział aminokwasy N-końca, a zarówno model homologiczny z publikacji 1, jak i udostępnione później struktury krystaliczne nie zawierały początkowego fragmentu białka, w trzeciej publikacji Doktorant opracował stabilną strukturę pełnej, 111-aminokwasowej domeny N-końcowej receptora CB1. Szczegółowa analiza serii długich symulacji kompleksów receptora CB1 z THC w miejscu ortosterycznym oraz dodatkowo z CBD w miejscu allosterycznym, pozwoliła na zidentyfikowanie kluczowych oddziaływań w obu kieszeniach, a także aminokwasów zaangażowanych w komunikację między nimi. Pomimo iż opracowany model receptora CB1 i wyniki symulacji mają pośrednie potwierdzenie w danych eksperymentalnych (np. wykazano negatywny wpływ związania CBD na energię oddziaływania THC w miejscu ortosterycznym), jak Autor słusznie zauważa, konieczna jest dalsza weryfikacja jego poprawności i faktycznej użyteczności w projektowaniu modulatorów allosterycznych.
Warte odnotowania, że we wszystkich trzech pracach otrzymane wyniki są dyskutowane w odniesieniu do opublikowanych przez innych autorów. Zwraca także uwagę doskonała prezentacja graficzna przeprowadzonych analiz, wyważona interpretacja wyników oraz ostrożność wyciąganych wniosków. Świadczy to o znakomitym warsztacie Doktoranta oraz Jego dojrzałości naukowej.
Wszystkie prace ukazały się w odpowiednich czasopismach – pierwsza w najlepszym czasopiśmie z dziedziny modelowania molekularnego (choć niestety zupełnie niedocenionym w Polsce, gdyż pomimo
4 ciągłej obecności w Q1 otrzymało tylko 100 punktów MNiSW), a druga i trzecia w wydaniach specjalnych czasopisma Molecules, odpowiednio – Computational Methods for Drug Discovery and Design oraz Endocannabinoid System Modulators in a Medicinal Chemistry Perspective. Akurat to czasopismo, wg mojej oceny zostało z kolei w Polsce przecenione i, szczególnie w porównaniu z Journal of Chemical Information and Modeling, na 140 punktów nie zasługuje.
Chciałbym jeszcze przedstawić kilka uwag i pytań jakie nasunęły mi się podczas lektury doktoratu.
• Co skłoniło Autora do zacytowania jako pierwszej publikacji, która odnosi się do receptorów GPCR u muszki owocówki? Została ona ponownie zacytowana na stronie 16, a zaczerpnięty z niej fragment dotyczy receptorów węchowych, co wcale nie wynika z tekstu w rozprawie. I jeszcze jedno odniesienie na stronie 18, opisujące mechanizm aktywacji receptorów GPCR.
• Podpisy pod początkowymi rysunkami często nie zawierają źródła pochodzenia, a w przypadku Ryc. 2. zamiast ref. 3 powinno być ref. 4. Niestety podpis jest bardzo zdawkowy i nie tłumaczy szczegółów z ryciny. Oryginalny podpis miał 5,5 linijki gęstego tekstu.
• Proszę o wyjaśnienie skąd pochodzi informacja że „...receptor w formie APO (niezwiązany z żadnym ligandem) również posiada pewną aktywność konstytutywną (jest zdolny do wiązania białka G i uruchamiania kaskady sygnałowej, jednak w znacznie mniejszym stopniu niż receptor w pełni aktywowany).”
• Czy termin „neutralny agonista” występujący na Ryc. 7 jest poprawny?
• Jaki był powód używania różnych programów do dokowania ligandów ortosterycznych – Glide oraz allosterycznych – Gold?
• Czy rozważane było użycie metody „induced fit docking” w celu otrzymania struktury startowej do symulacji dynamicznych?
• Dlaczego wychodzenie liganda z miejsca wiążącego było symulowane przy użyciu sterowanej MD, a wchodzenia przez dynamikę z nadzorem?
• Czy jest planowane użycie opracowanego modelu receptora CB1 z pełną domeną N-końcową do szerokiego sprawdzenia istniejących modulatorów allosterycznych, aby po sposobie wpływu na energię oddziaływania liganda ortosterycznego zweryfikować poprawność oceny rodzaju modulacji?
WNIOSEK KOŃCOWY
Pan mgr Jakub Jakowiecki jest pierwszym autorem we wszystkich pracach stanowiących rozprawę doktorską. Opublikowane wyniki badań, przedstawione w tych artykułach zostały już uprzednio
5 pozytywnie ocenione w procesie redakcyjnym czasopism z listy Journal Citation Reports. Bez wątpienia stanowią oryginalne rozwiązania postawionych problemów naukowych i zawierają istotne elementy nowości. Oświadczenia współautorów wskazanych artykułów, dowodzą wiodącej roli Doktoranta w ich powstaniu. Warto jednocześnie odnotować, że Pan mgr Jakowiecki jest także współautorem kolejnych 8 publikacji i 2 rozdziałów w anglojęzycznych monografiach naukowych, co świadczy o Jego wysokiej aktywności naukowej. Sumarycznie, całość opracowania oceniam wysoko, a uwagi, które wymieniłem mają charakter jedynie polemiczny i nie umniejszają mojej oceny.
W związku z powyższym stwierdzam, że przedstawiona do oceny rozprawa doktorska, spełnia wymagania prawne zapisane w Ustawie z dnia 20 lipca 2018 r. Prawo i szkolnictwie wyższym i nauce (tekst jednolity Dz. U. z 2022 r., poz. 574 z późn. zm.), i z pełnym przekonaniem przedkładam Wysokiej Radzie Naukowej Dyscypliny Nauki Chemiczne, Uniwersytetu Warszawskiego, wniosek o dopuszczenie Pana mgr Jakuba Jakowieckiego do dalszych etapów postępowania w sprawie nadania stopnia doktora.
Jednocześnie, biorąc pod uwagę wysoką wartość merytoryczną przedstawionych wyników, różnorodność i zaawansowanie zastosowanych metod symulacji dynamiki molekularnej i ich wielowymiarowe analizy, wnoszę o wyróżnienie rozprawy doktorskiej. Szczegółowe merytoryczne uzasadnienie przedstawiam w odrębnym wniosku.
Wniosek o wyróżnienie pracy doktorskiej mgr Jakuba Jakowieckiego zatytułowanej:
Badania wiązania ligandów do receptora kanabinoidowego CB1 oraz innych lipidowych receptorów GPCR za pomocą metod modelowania molekularnego, której promotorem jest
prof. dr hab. Sławomir Filipek
Pracę doktorską Pana mgr. Jakuba Jakowieckiego stanowi zbiór trzech oryginalnych artkułów naukowych opublikowanych w czasopismach z listy Journal Citation Reports tj. w Journal of Chemical Information and Modeling (2016) i Molecules (2020, 2021). We wszystkich pracach Doktorant jest pierwszym autorem, a jego wkład w ich powstanie jest wiodący i dotyczy praktycznie wszystkich aspektów merytorycznych i technicznych oraz przygotowania manuskryptów.
W mojej opinii szczególnie wysoką wartość naukową reprezentuje pierwsza, dwuautorska publikacja, w której zastosowane metody sterowanej i nadzorowanej dynamiki molekularnej należały w 2016 roku do pionierskich w obrębie receptorów GPCR. Ze względu na niedostępne wówczas struktury krystaliczne receptora CB1, wszystkie symulacje były prowadzone z użyciem opracowanego przez Doktoranta modelu homologicznego. Otrzymane wyniki zostały następnie zweryfikowane dla struktur krystalicznych receptora CB1, a badania rozszerzone na dwa inne receptory lipidowe S1P i LPA1 w ramach kierowanego przez Pana mgr Jakuba Jakowieckiego projektu Preludium 12. Ich wyniki zostały opublikowane w kolejnych dwóch publikacjach, z których w ostatniej przedstawiono najbardziej zaawansowany, pełny model receptora CB1 ze zdefiniowanymi miejscami wiązania ortosterycznych ligandów i allosterycznych modulatorów. Wartość poznawcza otrzymanych rezultatów jest decydująca dla możliwości projektowania nowych modulatorów allosterycznych do zyskującego coraz większe znaczenie jako cel terapeutyczny receptora CB1, a zastosowana metodologia może być rozszerzona dla innych białek receptorowych GPCR.
Na podkreślenie zasługuje także samodzielność Doktoranta w podejmowanych przez niego badaniach, świadcząca o Jego dojrzałości naukowej.
Podsumowując, kieruję do Wysokiej Rady Naukowej Dyscypliny Nauki Chemiczne, Uniwersytetu Warszawskiego, wniosek o wyróżnienie pracy doktorskiej mgr Jakuba Jakowieckiego.
