Embriogênese somática

RESUMO - O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de um protocolo para a embriogênese somática do caquizeiro. Como explantes, foram utilizados embriões zigóticos em diversos estádios de desenvolvimento, retirados de frutos coletados de plantas adultas a campo, a partir de quatro semanas após o pleno florescimento até 22 semanas. O meio básico para os experimentos foi o MS½NO 3 . O meio inicial de indução foi suplementado com 20µM de 2,4-D e 2µM de cinetina. Os calos escuros obtidos foram repicados para outro meio de indução, com concentrações 10 ou 20 µM de 2,4- D e 2 µM de cinetina. Os calos com massas pró-embriogênicas obtidos foram transferidos para meio de manutenção e multiplicação com 2 µM de cinetina e 2,4-D nas concentrações 2,5; 5,0 e 10 µM. As massas embriogênicas formadas foram transferidas para meio de maturação suplementado com 0,5 µM de AIB e as concentrações 5; 10 e 20 µM de 2-iP. Os embriões formados foram isolados em dois meios de conversão, sendo o primeiro com 5 µM de 2-iP, 5 µM de AG 3 e 0,5 µM de AIB e o segundo com 0,5 µM de AG 3 e BAP, nas concentrações 0; 0,25; 0,5 e 1,0 µM. Como resultados, obteve- se o padrão indireto de embriogênese somática a partir de embriões zigóticos maduros, com mais de 22 semanas de formação, quando cultivados em meio de cultura com 10 µM de 2,4-D combinado com 2 µM de cinetina. A manutenção e a multiplicação das culturas embriogênicas foram mais eficientes com 5 µM de 2,4-D, na qual os pró-embriões avançaram para o estádio globular. Na fase de maturação, as concentrações de 2-iP testadas atuaram promovendo os embriões globulares a estádios mais avançados da ontogenia como cordiforme, torpedo e cotiledonar. A suplementação do meio de cultura com 1 µM de BAP e 0,5 µM de AG 3 gerou a formação de plantas mais desenvolvidas, com maior número e tamanho de folhas. Termos para Indexação: Diospyros kaki, cultura de tecidos, fruticultura, micropropagação.

A regeneração de plantas, por organogênese ou embriogênese somática, a partir do cultivo de células e tecidos vegetais in vitro, é a base para a utilização da biotecnologia no melhoramento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a embriogênese somática a partir de calos embriogênicos das cultivares de laranjeiras doces ‘Hamlin’, ‘Pêra’, ‘Natal’, ‘Lima Verde’ e ‘Westin’, em função da composição dos meios de cultura relacionada à fonte e concentração de diferentes carboidratos, utilizando-se meio de cultura MT modificado com 500mg L -1 de extrato de malte, acrescido de sacarose,

No início da década de 1960 Toshio Murashige, então estudante no laboratório de Folke Skoog, descobriu que a adição de um extrato aquoso de folhas de tabaco ao meio White resultou num aumento do crescimento do material cultivado. Isso levou à formulação de um novo e eficiente meio de cultura, o Murashige e Skoog (1962) ou meio MS, o qual continha, também, quelato de ferro para torná-lo mais estável e disponível ao longo do cultivo, mioinositóis e um complexo de vitaminas. De acordo com Guerra e Nodari (2006), uma das características deste meio de cultura está associada aos elevados teores de nitrato, potássio e amônio. É até hoje uma das formulações mais utilizadas em cultura de tecidos vegetais e a publicação que descreve o meio MS continua sendo uma das mais citadas no campo da Biologia Vegetal (VASIL, 2008). Em estudos de embriogênese somática o meio MS é o mais utilizado, tendo sido empregado com sucesso, por exemplo, por Paiva-Neto et al. (2003), Sharma et al. (2005), Moon et al. (2005) e Lemes da Silva et al. (2009) em diversas espécies arbóreas.

O estudo do desenvolvimento de células ou grupos de células por técnicas histológicas tem se mostrado útil para o entendimento da embriogênese em várias espécies vegetais. Em Hevea brasiliensis, o tempo adequado de subcultivos foi determinado por meio de análises histológicas. Avaliando o potencial embriogênico do calo durante o seu desenvolvimento, esses autores puderam adaptar o tempo de subcultivo para otimizar a formação de embriões. Eles verificaram que células pré- embriogênicas foram observada em calos com 15 a 30 dias de cultivo e que essas células apenas se tornaram tipicamente embriogênicas após o cultivo em meio fresco, uma vez que sem a renovação dos meios as células não apresentaram potencial para formação de embriões somáticos (Michaux-Fèrriere & Carron, 1996). Ao se utilizar embriões zigóticos de Cocos nucifera como fonte de embriogênese somática, verificou- se que o processo tem origem principalmente na plúmula (Chan et al., 1998), e o cultivo desta estrutura vem potencializando os protocolos de embriogênese dessa espécie (Pérez-Nuñez et al., 2006).

regenerativas proporcionaria oportunidade maior para escolha do genótipo mais responsivo a tal característica. Houve diferença entre os genótipos avaliados quanto à capacidade de embriogênese somática e à regeneração de plantas in vitro a partir de embriões imaturos de milho. Essa diferença indica que o genótipo está relacionado com o sucesso de indução de calos embriogênicos e de regeneração. Para a indução de calo embriogênico e regeneração, a linhagem LD82025 foi a mais promissora para utilização em programas envolvendo transformação genética de plantas.

Para o nível de concentração 7,5 µM, a análise de regressão demonstrou que o modelo estatístico se ajustou aos dados em regressão quadrática (R 2 = 0,9865). Assim, para este nível de concentração, as médias de percentual de calos embriogênicos apresentaram um aumento, em função do tempo de permanência em meio de indução à embriogênese somática, que ocorreu de forma mais acentuada até os 60 dias (25,64 %). A partir desse período, o aumento do percentual de calos embriogênicos passou a ocorrer de forma mais gradual. Esse fato demonstra uma estabilidade na formação de calos embriogênicos, o que pode ser atribuída à uma provável perda da capacidade de indução à embriogênese somática pelo tempo prolongado de permanência dos explantes no meio de indução, com 7,5 µM de concentração dos reguladores de crescimento. É importante observar que a partir dos 45 dias de permanência no meio de cultivo, as médias obtidas pelo nível de concentração de 7,5 µM, se apresentaram superiores àquelas apresentadas pelos demais níveis de concentração, alcançando o máximo de percentual de calos embriogênicos no período de avaliação de 90 dias (30,88 %). No entanto, apesar deste período apresentar as maiores médias para todas as concentrações, estas são bem similares àquelas verificadas aos 75 dias de avaliação, o que significa uma economia de tempo de 15 dias para obtenção de calos embriogênicos a uma taxa similar.

Nas avaliações vegetativas, aos 30 meses, houve efeito significativo para diâmetro de copa das plantas. Como observado para o primeiro par de ramos plagiotrópicos, as plantas provenientes de embriogênese somática apresentaram maior diâmetro de copa que as plantas provenientes de sementes (Tabela 3). Para altura da planta, rendimento, percentagem de frutos chochos, estádio de maturação dos frutos e tamanho de grãos não houve diferenças significativas. As médias das características avaliadas estão de acordo com as obtidas em outros estudos com a cultivar Catuaí (Carvalho et al., 2006; Melo et al., 2006; Andrade et al., 2007).

Tendo em vista o potencial da aplicabilidade comercial da embriogênese somática para a produção em larga escala de plântulas de alface do genótipo Paris White, os protocolos de indução, proliferação, maturação dos embriões somáticos e conversão em plantas foram adequados, em especial, em sistema líquido, sendo este eficaz para a eficiente maturação dos embriões somáticos e conversão em plantas em curto espaço de tempo (21 dias). Para o desenvolvimento dos embriões somáticos e conversão em plantas, do genótipo Red Salad Bowl, é necessário a passagem por meio semi- sólido acrescido de carvão ativado, além de aumentar o tempo de cultivo (21 dias).

Foi utilizado o delineamento completamente casua- lizado (DCC), considerando cada placa de Petri como unidade experimental. A análise de variância foi realizada quanto à embriogênese somática, à organogênese e a calos aquosos aos 60 dias, ao número de agregados embriogênicos por calo embriogênico aos 60 e 123 dias e ao número de partes aéreas e plântulas por agregados embriogênicos. Foi verificada a correlação entre o número de agregados embriogênicos e a regeneração de plântulas, no último dia de subcultivo de cada genótipo. Todas as análises foram feitas pelo programa estatístico Statistics Analysis System (SAS Institute, 1998). As médias dos genótipos foram comparadas pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade. Foi realizada a transformação dos dados por (x + 0,5) 0,5 ,

Conclui-se que o tipo de explante e o genótipo utilizado para iniciar o cultivo in vitro de aveia influenciam na freqüência de calos embriogênicos. A influência genotípica só é observada quando se utiliza o embrião imaturo como explante. Já a adição de BAP no meio de indução não tem influência positiva sobre a freqüência desse tipo de calo. O coleóptilo pode ser considerado o explante ideal para indução de embriogênese somática em aveia devido à alta freqüência de calos formados, à alta taxa de crescimento dos mesmos, à ausência de influência genotípica, além da disponibilidade durante o ano e da rapidez no isolamento do mesmo.

Figura 2. Produção de plantas de A. sisalana Per. via embriogênese somática. A, B e C - calos embriogênicos semicompactos (A e B) e friáveis (C), formados a partir da base de bulbilhos cultivados em meio de cultura MS ½ suplementado com 2,4-D (13,6 µM) e BAP (88,8 µM). Barra (A e C) = 0,016 mm, Barra (B) = 0,098 mm; D a F - formação de embriões globulares (seta em E). Barra (D) = 1,47 mm, Barra (E) = 1,2 mm e Barra (F) = 1,2 mm; G a J - embriões somáticos em diferentes estádios de desenvolvimento. G (a) torpedo e (b) globular; J - embriões com raiz. Barra (G) = 1,5 mm, Barra (H) = 1,2 mm, Barra (I) = 1,2 mm e Barra (J) = 1 cm; L - plântulas em meio MS ½. Barra (L) = 2 cm; M e N - plântulas antes da aclimatização; O a Q - processo de aclimatização de plantas de A. sisalana Per.

Paralelamente aos estudos realizados para a de! nição de um método seguro para a propagação in vitro de genótipos elite de híbridos entre capim-elefante e milheto, a Embrapa Gado de Leite tem trabalhado para a obtenção de materiais hexaploides por meio da duplicação cromossômica de híbridos triploides (Abreu et al., 2006; Barbosa et al., 2007). Como as estratégias adotadas para duplicação cromossômica geralmente utilizam protocolos de exposição de explantes in vitro a agentes antimitóticos (Gu et al., 2005; Yang et al., 2006; Zhang et al., 2007), a obtenção de protocolos de embriogênese somática, para híbridos triploides de capim-elefante e milheto, além de representar uma possibilidade de multiplicação de genótipos elite, representa uma alternativa para indução in vitro de duplicação cromossômica, que visa à obtenção de híbridos hexaploides férteis.

Formação de embriões somáticos anormais, baixa freqüência de regeneração, falta de sincronização no desenvolvimento, não-conversão desses embriões em plantas e não-repetibilidade dos resultados são grandes entraves que têm limitado a obtenção de um protocolo eficiente de embriogênese somática para Eucalyptus grandis e outras espécies do gênero. Estratégias de pesquisa têm sido desenvolvidas para a superação desses obstáculos, assim como para a produção de culturas embriogênicas de árvores adultas, em adição àquelas desenvolvidas para material juvenil.

formulações para cultura podem se adequar aos diferentes genótipos, não existindo, ainda, um meio de cultura capaz de propagar todas as famílias. O modelo reprodutivo característicos dessa espécie, já descrito anteriormente, sugere a necessidade de otimização dos meios de cultura para cada família ou mesmo genótipos. Tem-se observado, também, que a embriogênese somática em gimnospermas é mais difícil do que nas angiospermas, pela recalcitrância de muitas espécies às condições in vitro (PULLMANe BUCALO, 2011; SHIN e KIM, 2012). Em muitos casos, a embriogênese somática ocorre apenas com a utilização de sementes imaturas contendo embriões zigóticos em estágios iniciais, a exemplo de Pinus taeda (TANG e NEWTON, 2005; PULLMAN et al., 2006; SHIN e KIM, 2012) e Pinus rigida X Pinus taeda (KIM e MOON, 2007).

Estudos têm demonstrado que o ácido salicílico e o ácido acetil salicílico desempenham ampla gama de funções nas plantas. Em várias espécies estes compostos são conhecidos por estimular o florescimento, formação de gemas e iniciação de raízes adventícias (Leslie e Romani, 1986). O ácido salicílico é uma importante molécula sinalizadora envolvida em respostas de defesa a patógenos e estresses abióticos. Estas substâncias têm sido utilizadas em trabalhos com embriogênese somática em espécies como milho, aveia, café e gerânio. Hao et al.(2006) observaram um aumento na embriogênese somática em aveia em meio enriquecido com ácido salicílico. Em cafeeiro, concentrações da ordem de picomolares de ácido salicílico proporcionaram um efeito positivo em culturas de suspensão celular, resultando em um incremento de duas vezes no crescimento celular e embriogênese somática, como também melhorou a sincronização do processo embriogênico (Figueroa et al., 2001).

processo de aquisição de competência embriogênica. Para que seja possível o aumento da eficiência dos processos de regeneração de plantas, é preciso compreendê-los melhor. Dessa forma, os objetivos do presente trabalho foram determinar se o gene está presente no genoma da soja e analisar a sua expressão durante a indução de embriogênese somática. Genes que codificam três novos membros da superfamília de receptores cinase ricos em leucina (LRR-RLK - Leucine-rich repeat receptor like kinase# foram identificados. Esses genes foram denominados !

Protocolos regenerativos baseados na embriogênese somática tem sido relatados com sucesso para algumas espécies de palmeiras, utilizando-se como fonte de explantes, principalmente, embriões zigóticos (Guerra e Handro, 1988; Tabai, 1992; Teixeira et al., 1993; Huong et al., 1999; Ledo et al., 2002; Rajesh et al., 2003; Moura, 2007; Steinmacher, 2007); tecidos foliares juvenis (Chan et al., 1998; Sarasan et al., 2002; Fernando et al., 2003; Pérez-Núñez et al., 2006) e inflorescências (Branton e Blake, 1983; Bhaskaran e Smith, 1992; Teixeira et al., 1994; Verdeil et al., 1994; Guerra e Handro, 1998; Karun et al., 2004). Para a macaúba, a primeira tentativa de indução de embriogênese somática foi realizada por Tabai (1992), estudo no qual é relatada a formação de estruturas pró-embriogênicas, utilizando-se embriões zigóticos como fonte de explantes. No entanto, o trabalho conduzido por Moura (2007) apresentou resultados mais promissores da aplicação da embriogênese somática para esta palmeira, no qual é descrito um protocolo para a obtenção de muitos pró- embriões e embriões somáticos. Apesar disso, é comentada a dificuldade de maturação e germinação, dos embriões, comprometendo a produção de mudas clonais desta espécie em larga escala.

O presente trabalho apresenta a primeira descrição de embriogênese somática em macaúba (Acrocomia aculeata). Processos de embriogênese somática iniciados a partir de embriões zigóticos têm sido descritos para algumas palmeiras, como Elaeis guineensis (Teixeira et al., 1993; Kanchanapoom & Domyoas, 1999), Phoenix canariensis (Huong et al., 1999), Euterpe oleracea (Ledo et al., 2002) e Hyophorbe lagenicaulis (Sarasan et al., 2002). Para estas espécies, o 2,4-D tem sido a principal auxina utilizada na indução da embriogênese somática. No presente trabalho, tanto 2,4-D quanto picloram se mostraram eficientes na indução da embriogênese somática, originando calo tipo II (Figura 2). O picloram é uma auxina sintética derivada do ácido picolínico e tem sido empregada em algumas espécies para a indução da embriogênese somática (Dineshkumar et al., 1995; Groll et al., 2001; Akutsu & Sato, 2002; Perán-Quesada et al., 2004). Dentre as palmáceas, há relatos de uso do picloram com sucesso no processo de embriogênese somática em Phoenix canariensis e Areca catechu (Huong et al., 1999; Karun et al., 2004).

Na embriogênese somática de Elaeis guineensis, Besse et al. (1992) também verificaram a formação de um calo primário caracteristicamente compacto, organizado e nodular, além de um calo tipicamente embriogênico, caracterizado por apresentar aspecto friável, coloração esbranquiçada e rápido crescimento. No entanto, diferentemente do observado no presente trabalho, verificou-se na análise anatômica desse último propágulo que os mesmos eram constituídos por pequenos agrupamentos de células meristemáticas, associados a um número mais elevado de células alargadas e vacuoladas. Além disso, verificou-se também nesse estudo que esses calos de crescimento rápido, por manterem-se em multiplicação intensa por longos períodos de tempo, estiveram diretamente envolvidos na formação de indivíduos mantled. Assim, para se evitar o aparecimento de tais anomalias foi sugerido por estes autores que estes calos, assim como realizado no presente protocolo, não sejam multiplicados por muitos subcultivos.

O presente estudo teve como objetivos avaliar os efeitos de diferentes tipos de explantes e reguladores de crescimento nas diferentes fases da embriogênese somática de cana-de-açúcar, cultivar RB867515 e caracterizar anatomicamente as fases deste processo nesta cultivar. Além disso, foi avaliada a regeneração in vitro, via embriogênese somática, nas cultivares RB855536 e RB92579. Na primeira etapa do trabalho foram avaliados o uso de dois tipos de explantes iniciais: folhas imaturas e ápices caulinares na indução da embriogênese somática da cultivar RB867515, através da utilização das auxinas (2,4-D, picloram ou dicamba) nas concentrações (2, 4, 6, e 8 mg.L -1 ). Os calos embriogênicos primários formados no meio de indução foram transferidos para diferentes meio de multiplicação com a mesma composição do meio de indução (tipo de regulador e concentração), que foi definida de acordo com o regulador que apresentou a maior porcentagem de formação de calos embriogênicos. Acrescido de 4 mg.L -1 do ácido indol-3-acético (AIA), 100 mg.L -1 de L-asparagina e a combinação destes dois. Para a etapa de maturação dos embriões somáticos foram testados os efeitos da concentração de sacarose (30 e 60 g.L -1 ) e do agente solidificante fitagel (2,5 e 5,0 g.L -1 ), acrescidos ao meio MS. Para a conversão dos embriões somáticos em plantas foram testados dois tipos de meio de regeneração: meio MS basal e também o meio MS suplementado com 1 mg.L -1 de BAP e 1 mg.L -1 de GA 3 . A porcentagem de conversão de