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Tabela 1 – Potenciais redox padrão [Skoog et al. 1997]. 38
Tabela 2.1 – Locais e características da recolha de material biológico. 162 Tabela 2.2 – Tipo de separações cromatográficas, com as respectivas fases estacionárias e suas características. 170
Tabela 2.3 – Padrões de massa molecular utilizados na cromatografia de exclusão molecular. 172
Tabela 2.4 – Padrões de elevada massa molecular para SDS-PAGE. 176 Tabela 2.5 – Estrutura de compostos fenólicos utilizados nas reacções de iodação enzimática, via V-BrPO. 182
Tabela 2.6 – Variação de condições/substratos da reacção enzimática catalisada pela V-BrPO. 185 Tabela 3.1 – Agrupamento das esponjas por espécies e resultado dos respectivos testes de actividade enzimática como
haloperoxidase. (-) Representa a ausência de actividade enzimática como haloperoxidase, (+) representa a existência de actividade como iodoperoxidase - IPO, (++) representa a existência de actividade como bromoperoxidase - BrPO.
210
Tabela 3.2 – Massa de esponja e volumes de tampão de extracção utilizados para a produção de extracto bruto. 213 Tabela 3.3 – Actividade enzimática total dos extractos brutos obtidos para os diferentes exemplares da espécie E.
discophorus.
214
Tabela 3.4 – Actividade enzimática específica dos extractos brutos obtidos para as diferentes esponjas pertencentes à
espécie E. discophorus.
218
Tabela 3.5 – Proteínas utilizadas como padrões na electroforese SDS-PAGE, designação e respectivas massas
moleculares.
219
Tabela 3.6 – Características das fracções separadas em matriz DEAE-Sephacel, para o extracto enzimático da
esponja E. discophorus B125.
228
Tabela 3.7 – Características das fracções separadas em matriz DEAE-Sephacel, para o extracto enzimático da
esponja E. discophorus B172.
230
Tabela 3.8 – Características das fracções separadas em matriz DEAE-Sephacel, para o extracto enzimático da
esponja E. discophorus B206.
234
Tabela 3.9 – Características das fracções separadas em matriz DEAE-Sephacel, para o extracto enzimático da
esponja E. discophorus B351.
Tabela 3.10 – Características das fracções separadas em matriz DEAE-Sephacel, para o extracto enzimático da
esponja E. discophorus B358.
240
Tabela 3.11 – Características das fracções separadas em matriz DEAE-Sephacel, para o extracto enzimático da
esponja E. discophorus B397.
243
Tabela 3.12 – Características das fracções separadas em matriz DEAE-Sephacel, para o extracto enzimático da
esponja E. discophorus F005.
246
Tabela 3.13 – Características das fracções separadas em Mono-Q, para o extracto enzimático da esponja E.
discophorus B125 após uma passagem pela DEAE-Sephacel.
248
Tabela 3.14 – Características das fracções separadas em Mono-Q, para o extracto enzimático da esponja E.
discophorus B125 após uma passagem pela DEAE-Sephacel e concentração dos extractos com actividade enzimática como IPO.
251
Tabela 3.15 – Características de proteínas usadas como padrão na coluna em matriz Sephacryl S300. 254 Tabela 3.16 – Características das fracções separadas em Mono-Q, para o extracto enzimático da esponja E.
discophorus B125 após uma passagem pela DEAE-Sephacel.
257
Tabela 3.17 – Características das fracções separadas em matriz Sephacryl S300, para o extracto enzimático da
esponja E. discophorus B125 após uma passagem pela DEAE-Sephacel.
260
Tabela 3.18 – Características das fracções separadas em matriz Sephacryl S300, para o extracto enzimático da
esponja E. discophorus B206 após uma passagem pela Sephacryl S300.
264
Tabela 3.19 – Características das fracções separadas em matriz Sephacryl S300, para o extracto enzimático da
esponja E. discophorus B206 após segunda passagem pela Sephacryl S300.
266
Tabela 3.20 – Características das fracções separadas em matriz Sephacryl S300, para o extracto enzimático da
esponja E. discophorus B358 após uma passagem pela Sephacryl S300.
269
Tabela 3.21 – Características das fracções separadas em matriz Sephacryl S300, para o extracto enzimático da esponja
E. discophorus F005 após uma passagem pela Sephacryl S300.
272
Tabela 3.22 – Características das fracções separadas em matriz Sephacryl S300, para o extracto enzimático da esponja
E. discophorus F005 após uma passagem pela Sephacryl S300.
274
Tabela 3.23 – Condições de extracção utilizadas para a produção de extracto bruto da L. saccharina. 281 Tabela 3.24 – Actividade enzimáticas para o extracto bruto da alga L. saccharina. 282
Tabela 3.25 – Doseamento proteico e actividades enzimáticas e específicas para as fracções cromatográficas da alga L.
saccharina.
Tabela 3.26 – Doseamento proteico e actividades enzimáticas e especificas para o EB Ls, mistura após cromatografias,
mistura dialisada e extracto purificado concentrado.
287
Tabela 3.27 – Valores de absorvância determinados a partir de reacções onde se fez a variação de componentes da
reacção enzimática entre L-tirosina, iodeto de potássio e peróxido de hidrogénio, na presença de V- BrPO.
Preâmbulo
Nos últimos anos foram descobertos inúmeros metabolitos halogenados com actividades biológicas de grande relevância, sendo uma larga quantidade extraídos de organismos marinhos, nomeadamente algas e esponjas [Teuten e Reddy 2007, Dembitsky e Tolstikov 2003, Proksch et al. 2002]. Estes compostos halogenados são maioritariamente produzidos por enzimas que possuem a capacidade de oxidar os iões halogeneto e através da substituição nucleofílica introduzir estas espécies oxidadas em compostos orgânicos, potenciando deste modo a capacidade de actuarem como anti-virais, anti-cancerígeno, anti- tumoral e anti-microbianos [Thakur e Müller 2004, Thakur e Anil 2000]. A extracção, purificação e caracterização de proteínas que apresentem a capacidade catalítica de halogenação torna-se, deste modo, a melhor forma para se entender o mecanismo de produção de compostos orgânicos halogenados, para posterior utilização destes mecanismos em síntese de fármacos.
Nos últimos anos foram descobertos e caracterizados vários enzimas halogenantes [Baden e Corbett 1980, Wever et al. 1985, Almeida et al. 2001, Colin et al. 2003], no entanto, embora tenham sido isolados vários metabolitos bioactivos de esponjas marinhas [Thakur e Müller 2004], ainda não se conseguiu caracterizar estruturalmente nenhum catalisador halogenantes destes organismos, a não ser de uma forma preliminar [Nicolai et al. 2008, Baden e Corbett 1967].
Uma vez que o trabalho desenvolvido nesta tese, teve como objectivo a extracção e caracterização de macromoléculas com actividade enzimática halogenante de organismos marinhos, nomeadamente esponjas e algas e a utilização destes em algumas reacções de halogenação, o capítulo da introdução pretende dar uma panorâmica geral sobre os halogéneos e a sua importância no meio marinho, distinguir os diferentes enzimas halogenantes e diferenciá-los de enzimas oxidantes com actividade como polifenoloxidase, uma vez que ambos podem catalisar reacções de produção da macromolécula melanina, em diferentes condições reaccionais.