4 A NÁLISE E INTERPRETAÇÃO DAS ENTREVISTAS

Plusieurs travaux montrent que l’apoptose peut être déclenchée dans des cellules anucléées ou

cytoblastes (Jacobson et al., 1994; Schulze Osthoff et al., 1994; Nakajima et al., 1995). Il est

maintenant bien établi qu’une voie cytoplasmique peut fonctionner indépendamment du

contrôle nucléaire. Il est même proposé que ce soit le cytoplasme lui-même qui orchestre la

désintégration du noyau (Enari et al., 1995; Lazebnik et al., 1993; Martin et al., 1995;

Newmeyer et al., 1994) (Fig. 9). Ces observations tendent à montrer que tous les facteurs

nécessaires au programme de mort cellulaire sont présents au sein du cytoplasme et que leur

activité est bloquée jusqu’à la réception d’un signal activateur. Différents composants

cytoplasmiques entrent en ligne de compte tels que la mitochondrie, les protéases de la famille

des Caspases et les membres régulateurs appartenant aux familles des protéines Bcl-2 et lAPs.

A. Les Caspases

L’apoptose étant un processus de mort cellulaire, l’engagement apoptotique mène à une

dégradation contrôlée et complète de la cellule et de ses constituants. Les protéases y jouent

un rôle central puisqu’elles sont responsables de la quasi totalité de la dégradation ciblée des

protéines essentielles à la vie cellulaire. Un groupe majeur de protéases à été identifié chez les

vertébrés sur la base de leur homologie au gène ced-3 (çell death defective) de C. elegans, un

des gènes responsables de la mort cellulaire chez ce nématode. Ces protéases ont récemment

été renommées „Caspases“ (Alnemri et al., 1996) (Tableau 1).

■>

Pro-caspase

Œ

Clivage

L

cytochrome c

O

4P

Caspase

active

Apoptosis

Inducing

Factor

Pro-caspase | ^

Clivage

Caspases amont"

TT—n

U

Caspase active

Caspases "en aval"

Nucléaires

PARP

DNA-PKc

Lamines

Ul-70kDa

RF-C

Cytosquelettiques

Fodrine

Actine

Gas-2

Gelsoline

Facteurs de

signalisation

intracellulaire

PKC-5

PKC-

t

SREBPs

D4-GDI

MEKK-1

PITSLRE Kinases

Produits de

gènes antiapoptotiques

Huntingtin

Rb

Figure 9: Voies d'activation des caspases dépendant, ou non, d'un contrôle mitochondrial.

Famille des protéases de type Caspase

Sous-famille Ced-3

Caspase-7 (Mch3, ICE-LAP3, CMH-1)

Caspase-3 (CPP32, Yama, Apopain)

Caspase-6 (Mch2)

Caspase-8 (MACH, FLICE, Mch5)

Caspase-10 (Mch4)

Sous-famille Nedd-2

Caspase-2 (ICH-1)

Caspase-9 (ICE-LAP6, Mch6)

Sous-famille ICE

Caspase-5 (ICErel-III, TY)

Caspase-4 (XX, ICH-2, ICErel-II)

Caspase-1 (ICE)

Tableau 1: Caspases identifiées à ce jour.

D'après Alnemri et collaborateurs, 1996;

Chinnaiyan et Dixit, 1996.

14

a. Nomenclature et description

Les enzymes appartenant à la famille des „ICE (Interleukine-16 Çonverting Enzymes)-like

cystein proteases" sont maintenant regroupées sous le nom générique de Caspases (Alnemri et

al., 1996) pour cystein aspartate specific-proteases. les deux caractéristiques fondamentales de

ces protéases étant la présence d’une cystéine au sein du site catalytique (séquence d’acides

aminés QAÇRG) et celle d’un acide aspartique adjacent au site de clivage. Une glycine ou un

autre acide aminé de petite taille et hydrophobe est généralement trouvé à la suite de l’acide

aspartique (Munday et al., 1995; Nicholson et al., 1995; Xue and Horvitz, 1995). Une dizaine

de Caspases ont été isolées à ce Jour; elles ont été numérotées suivant l’ordre chronologique

de leur description (Tableau 1). Il semble que ces protéases jouent un rôle central dans le

processus d’apoptose puisque leur surexpression par transfection dans des cellules de

mammifères induit la mort cellulaire. Le 1er membre de la famille à avoir été décrit est l’ICE

ou Caspase-1, isolé par Thomberry et collaborateurs en 1992 pour son activité protéolytique

sur la pro-Interleukine-l-B (Thomberry et al., 1992). La Caspase-1 est la mieux connue des

enzymes de la famille: sa structure tridimensionnelle ainsi que le fonctionnement de son site

catalytique sont aujourd’hui établis (Wilson et al., 1994). Le gène homologue du C. elegans

est le gène ced-3 capable d’induire l’apoptose dans des cellules de mammifères, ce qui montre

la forte conservation des voies de transduction de la mort cellulaire au cours de l’évolution

(Miura et al., 1993).

b. Spécificité et activité des Caspases

La surexpression de chacune des Caspases dans des cellules de mammifères peut initier la

mort cellulaire par apoptose (Miura et al., 1993). Bien qu’elles soient indicatives de la

fonction de ces protéases, ces études doivent être interprétées avec circonspection. En effet,

l’activité protéolytique des Caspases exogènes pourrait infliger à la cellule un dommage qui

enclencherait alors une réponse apoptotique exécutée seulement par des enzymes endogènes.

Deux approches permettent d’étudier plus finement le rôle de chacune des Caspases dans le

processus apoptotique: l’utilisation d’inhibiteurs et la construction de souris „knockout“. En

effet, si la famille des Caspases remplit un rôle essentiel dans l’exécution de la mort cellulaire

programmée (Enari et al., 1995; Los et al., 1995), il semblerait que chaque Caspase prise

individuellement ne soit pas essentielle et qu’une forte redondance existe entre elles. En effet,

des études récentes montrent que des cellules dérivées de souris ,4cnockout“ pour la caspase-1

(Kuida et al., 1995; Li et al., 1995) et la caspase-3 (Kuida et al., 1996) se comportent

normalement en ce qui concerne l’induction de la mort cellulaire par de nombreux agents.

Bien qu’un rôle central ait été attribué à la Caspase-1 dans la voie d’apoptose activée par le

récepteur Fas/APOl, cette enzyme ne semble pas essentielle à d’autres morts programmées

(Kuida et al., 1995). Ainsi, des cellules dérivées de souris „knockout“ pour la caspase-1

restent sensibles à tous les inducteurs d’apoptose testés excepté l’antigène Fas/Apol.

Cependant, il est important de signaler que ces souris ne présentent pas le phénotype Ipr (qui

résulte de l’absence de sélection négative médiée par Fas/Apol lors, du développement du

système immunitaire), ce qui voudrait dire qu’m vivo, une autre Caspase entrerait en jeu lors

de l’activation du récepteur. L’étude des souris „knockout“ pour la caspase-3 montre

l’importance fondamentale de cette protéase pour la mort cellulaire programmée ayant lieu

durant le développement morphogénique du cerveau (Kuida et al., 1996): un excès de cellules

neurales est observé, les cellules surnuméraires étant dans une phase post-mitotique et

normalement différenciées; cette caractéristique est partagée par les souris „knockout“ pour la

15

caspase-3 et le mutant ced-3 de C. elegans. Il a d’ailleurs été proposé que l’équivalent

fonctionnel de ced-3 soit la caspase-3 (Femandes Alnemri et al., 1994; Xue et al., 1996; Yuan

et al., 1993). Les thymocytes prélevés chez ces souris restent susceptibles à divers stimuli

apoptotiques dont le récepteur Fas/Apol (Kuida et al., 1996), alors que l’activation

protéolytique de la Caspase-3 a été montrée lors de la stimulation de ce récepteur dans des

cultures cellulaires in vitro (Enari et al., 1996). Il est possible que dans ces conditions la

fonction de la Caspase-3 soit assurée par ses proches homologues, les Caspases-6 (Mch2) et -

7 (Mch3). Ces observations montrent la forte redondance des voies de mort cellulaire dans les

systèmes biologiques complexes, la dizaine de membres de la famille des Caspases

caractérisés à ce jour étant coexprimés dans la plupart des tissus testés. Il est donc difficile

d’identifier de manière univoque l’enzyme ou les enzymes requises pour l’exécution de

l’apoptose et celles impliquées dans la régulation de ces exécuteurs.

C. Auto et Transactivation des Caspases

L’activation des Caspases requiert le clivage protéolytique de proenzymes correspondantes en

sous-unités actives. H s’agit d’un autoclivage en des sites qui ressemblent à ceux reconnus par

les Caspases dans leurs cibles hétérologues (Martin and Green, 1995; Nicholson et al., 1995;

Tewari et al., 1995; Vaux and Strasser, 1996). Ce clivage est suivi de la formation d’un

tétramère qui constitue l’enzyme active (Gu et al., 1995) (Fig. 9). Etant donné que les

Caspases constituent leur propre substrat physiologique, des phénomènes d’auto et/ou de

transactivation peuvent se mettre en place entre les différents membres de la famille

(Femandes Alnemri et al., 1994, 1996; Faucheu et al., 1995; Gu et al., 1995; Muzio et al.,

1997; Tewari et al., 1995). H est aussi fort probable qu’une ou plusieurs autres protéases

soient à l’origine de l’activation finale des Caspases. Par exemple, la Granzyme B, une sérine

protéase larguée dans la cellule cible par les cellules T c5dotoxiques lors du „baiser de la

mort“, peut activer la Caspase-3 (Darmon et al., 1995). Ce phénomène de transactivation

suggère que ces protéases agissent dans une cascade d’événements protéolytiques. Ainsi,

certains modèles mettent en avant une possible activation en chaîne: par exemple, l’activation

de la Caspase-8 (FLICE-MACH) par le récepteur du TNF-a (TNFRI) et le récepteur Apol

(Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996), conduirait directement ou indirectement à

l’activation de la Caspase-1 (Los et al., 1995), elle-même responsable de l’activation

protéolytique de la Caspase-3 (Enari et al., 1996). La Caspase-8 apparaît ainsi être le premier

lien connectant des événements de signalisation membranaire au programme d’exécution

apoptotique. Il est également probable que lors du déclenchement d’un processus apoptotique,

plusieurs Caspases soient activées parallèlement et clivent différents substrats. La Caspase-3

peut être clivée en deux sites distincts (Nicholson et al., 1995), le premier clivage donnant

deux fragments de 20 et 11 kDa (p20 et pli), le deuxième convertissant la p20 en pl7. Les

deux fragments p20 et pl7 possèdent une activité catalytique équivalente (Erhardt and

Cooper, 1996; Martin et al., 1996). Une forme tronquée de la Caspase-2 (ICH-IS) semble

avoir un effet inhibiteur sur l’apoptose lorsqu’elle est surexprimée (Wang et al., 1994),

probablement par suite de sa faculté à s’oligomériser avec d’autres membres de la famille. Il a

été proposé que des enzymes hybrides et actives soient formées par l’échange de sous-unités

entre les Caspases (Alnemri, 1997; Femandes Alnemri et al., 1995). Si une telle hypothèse

s’avérait correcte, un réseau de régulation pourrait s’établir au sein même de la famille, avec

une spécificité de substrat différentielle suivant les hétéro-oligomères formés, ce qui rendrait

encore plus complexe le rôle joué par ces Caspases dans la mort cellulaire programmée (Fig.

9).

16

d. Substrats connus

De plus en plus de protéines sont identifiées comme substrats des Caspases. Le clivage de ces

protéines intervient d’une manière ou d’une autre dans les modifications biochimiques et

morphologiques caractéristiques de la mort apoptotique, bien qu’il ne soit pas toujours évident

de déterminer le rôle exact du clivage de certaines d’entre-elles, et que l’on ne puisse pas

exclure que d’autres substrats actuellement non déterminés soient les cibles principales des

protéases. En effet, aucune de ces protéines n’est en soi essentielle à la survie de la cellule. Il

est donc tentant de considérer que c’est le clivage ordonné et bien orchestré d’un grand

nombre de substrats protéiques qui conduit à la mort cellulaire et aux caractéristiques

morphologiques du noyau et du cytoplasme typiques de l’apoptose (Fig. 9 et Tableau 2).

1 ) Apoptose et inflammation: la pro-Interleukine-lfi

Apparemment, la pro-IL-16 est un substrat entièrement spécifique de la Caspase-1 puisque

aucune autre Caspase ne semble pouvoir médier cette protéolyse (Li et al., 1995). L’IL-IB est

un des agents principaux de la réponse inflammatoire et n’est pas considérée comme un

substrat „apoptotique“ à proprement parlé. Pourtant, cette double activité de la Caspase-1 est

troublante. Les travaux de Chen et collaborateurs (Chen et al., 1996) montrent que la bactérie

Shigella, l’agent étiologique de la dysenterie, tue les macrophages de l’hôte par apoptose.

Cette mort cellulaire est médiée par l’IpaB (Invasion plasmid antigen B) qui semble réguler

positivement l’activité de la Caspase-1 suite à sa fixation sur l’enzyme, provoquant ainsi

l’apoptose des macrophages cibles, et par conséquent l’évasion des bactéries. Parallèlement à

la mort cellulaire, la maturation et la sécrétion d’IL-16 mènent à une réponse inflammatoire

caractéristique de la dysenterie. La protéine CrmA (Cytokine response modifier), produite par

la famille des Poxvirus, est capable d’inhiber l’activité de la Caspase-1 (Ray et al., 1992). A

nouveau, cette inhibition s’exerce à deux niveaux, puisqu’en plus d’un effet négatif sur

l’apoptose, le processus d’inflammation est lui aussi altéré par suite de l’absence de

maturation de la pro-IL-16; la cellule infectée ne pouvant plus utiliser la c5dokine comme

signal de détresse. Ces deux systèmes illustrent la nature bifonctionelle de la Caspase-1

comme molécule proinflammatoire et proapoptotique. L’activation de la Caspase-1 au cours

du suicide cellulaire permettrait à la protéase de participer au processus apoptotique, ce qui

évite une inflammation locale, et de produire de l’IL-16 utilisée comme messager de

signalisation extracellulaire afin de prévenir le système immunitaire qu’une infection est en

cours.

2) Modifications nucléaires

La fragmentation intemucléosomale de l’ADN visualisée sur gel d’agarose par la classique

„échelle d’ADN“ est un critère courant bien que non systématique de l’apoptose. Par contre,

le clivage du génome en grands fragments semble se passer dans tous les cas d’apoptose

recensés mais sa détection est moins aisée. L’intérêt du clivage de l’ADN en de nombreux

fragments pourrait être multiple. Cette dégradation peut avant tout assurer l’irréversibilité du

phénomène de mort cellulaire, minimiser le risque de recombinaison avec l’ADN des cellules

phagocytaires, et alléger le travail de ces cellules généralement non professionnelles. Plusieurs

modifications structurelles ou biochimiques sous-tendent la fragmentation de l’ADN: ainsi,

les processus de réparation de l’ADN sont inhibés et la structure des lamines désorganisée.

Substrats Fonction de la protéine Caspases Références

protéiques Impliquées

connus

Pro-IL-IB réponse inflammatoire -1 Thornberry ef a/., 1992

IGIF réponse inflammatoire -1 Guet ai, 1997

DNA-PKcs réparation de l'ADN génomique -3 Sougetai, 1996; Gasciola-Roseneta/., 1996

PARP réparation de l'ADN génomique -3, -4, -6, -7 Kaufmann et ai, 1993; Tewari et ai, 1995

RF-C réplication de l'ADN génomique -3 Rhéaumee/ûf/., 1997

Ul-70kDa épissage des ARN messagers -3 Gasciola-Roseneta/., 1994, 1996

Lamines structure de la lamina nucléaire -6 Orthe/a/., 1996

DFF fragmentation de l'ADN génomique -3 lÂu et ai, 1997

SREBPs régulateurs du taux de cholestérol -3,-7 Wang et ai, 1995, 1996; Pai et ai, 1996

D4-GDI régulateur négatif des protéines Rho -3 (?) Nae/a/., 1996

PKC-5 transduction de signaux ^? Emotoefa/., 1995

PKC-x transduction de signaux -3 Dattaeta/., 1997

PITSLRE Kinases transduction de signaux -1,-3 Beyaert ef a/., 1997

MEKK-1 transduction de signaux -3 Cardone ef a/., 1997

PAK-2 transduction de signaux _{-3 (?)} Rudel and Bokoch, 1997

Rababtin-5 fusion des endosomes ? _{Cosulichef a/., 1997}

Actine cytosquelette -3 Kayalar ef a/., 1996; Mashimaef a/., 1997

Gas-2 cytosquelette ? _{Brancolini ef a/., 1995}

Fodrine cytosquelette (calpain, ?) Martin ef a/., 1995

Gelsolin cytosquelette -3 Kothakota et ai, 1997

Rb régulateur négatif du facteur E2F -3 An and Dou, 1996; Jànicke et ai, 1996

Huntingtin protéine anti-apoptotique -3 Goldberg e/a/., 1996

17

Ces différents substrats étant nucléaires, on suppose que les caspases peuvent être

transloquées dans le noyau.

(i) Première cible, les processus de réparation de l’ADN: intervention des protéines PARP et

DNA-PKcs?

La Poly(ADP-ribose)Polymerase (PARP) est une protéine associée à la chromatine, qui

catalyse la liaison covalente d’unités d’ADP-ribose, provenant du substrat NAD+, à de

nombreuses protéines nucléaires, incluant la PARP elle-même (processus

d’automodification). Ce processus est appelé la Poly(ADP-ribos)ylation et représente une

modification post-traductionelle seulement exécutée par la PARP (de Murcia and Menissier-

de Murcia, 1994). Cette enzyme contient 3 domaines fonctionnels: a) un domaine NH2-

terminal de liaison à l’ADN, comprenant deux régions en doigts de zinc et impliqué dans la

reconnaissance des cassures double brin de l’ADN, b) un domaine central d’automodification

et c) la région COOH terminale contenant le site catalytique. Le clivage de l’enzyme par la

Caspase-3 (Tewari et al., 1995) mène à la séparation du domaine catalytique des domaines de

liaison à l’ADN et d’automodification, ce qui a pour conséquence finale l’inactivation de la

protéine. Le gène codant pour la PARP est très conservé et présent dans pratiquement toutes

les cellules eucaryotes excepté la levure (de Murcia and Menissier de Murcia, 1994). Etant

donné que la PARP constitue le premier substrat d’une Caspase à avoir été isolé (Kaufmann et

al., 1993), beaucoup d’auteurs se sont posés la question du rôle de cette inactivation dans le

processus d’apoptose. La construction de souris „knockout“ pour le gène de la PARP a permis

d’obtenir un début de réponse (Wang et al., 1995; 1997). Les souris homozygotes pour la

mutation sont viables et fertiles, ce qui montre que ni la PARP ni la poly(ADP-ribos)ylation

ne sont requises pour la prolifération et la différenciation cellulaires in vivo. Des anomalies

apparaissent dans les animaux adultes, touchant essentiellement la peau, ce qui suggère un

rôle important de la PARP dans la réponse au stress environnemental. Les auteurs de ces

travaux montrent également que les mécanismes de réparation de l’ADN génomique ne sont

pas affectés dans les cellules homozygotes pour la mutation PARP. Cette observation, ainsi

que d’autres travaux démontrant que les voies de réparation de l’ADN sont indépendantes de

la PARP (Smulson et al., 1994), suggèrent que cette enzyme agit comme une molécule de

„protection des cassures" afin de prévenir des événements de recombinaison accidentels en

attendant que les processus de réparation puissent intervenir. Un rôle possible du clivage de la

PARP dans l’apoptose a été étudié par Wang et al (Wang et al., 1997), qui ont mesuré la

sensibilité de fibroblastes et de lymphocytes, issus de souris PARP-/-, à l’induction

d’apoptose par l’anticorps anti-Fas et le TNF-a. Aucune différence majeure de sensibilité aux

inducteurs n’a pu être observée entre les cellules sauvages et mutantes, ce qui indique que

l’inactivation de la PARP ou les produits du clivage de l’enzyme apparaissant durant le

phénomène apoptotique, ne contribuent pas au déclenchement du programme d’apoptose. La

PARP peut être clivée in vitro par d’autre Caspases que la Caspase-3 (CPP32) telles que les

Caspases-6 (Mch2, [Femandes Alnemri et al., 1995]), -4 (Tx, [Gu et al., 1995]), -7

(Mch3/CMH-1, [Femandes Alnemri et al., 1995; Lippke et al., 1996]) ainsi que l’homologue

murin de la Caspase-2 (Ich-1), Nedd2 (Gu et al., 1995). Cependant, la Caspase-3 reste

l’enzyme la plus efficace pour cette protéolyse et la plus sensible à l’inhibiteur Ac-DEVD-

CHO qui mime le site de clivage de la PARP.

La DNA-PKcs (DNA-Protein ^nase çatalytic subunit) est une protéine de 460 kDa environ,

possédant une activité kinasique PI3-like et intervenant dans les processus de réparation de

l’ADN génomique (Hartley et al., 1995). Lors du processus apoptotique, le domaine

catalytique de la protéine est clivé ce qui provoque son inactivation (le domaine de liaison à

l’ADN [Ku] restant intact). Le clivage du site catalytique est catalysé par la Caspase-3, au sein

18

de la séquence DEVD-N (Casciola Rosen et al., 1996; Song et al., 1996) proche du motif

consensus de clivage par cette Caspase (DXXD). Casciola-Rosen et collaborateurs ont montré

que la Caspase-3 inactive les protéines PARP et DNA-PKc avec une efficacité comparable

(Casciola Rosen et al., 1996). Etant donné que ces deux protéines participent aux processus de

réparation de l’ADN, il est proposé que la Caspase-3 ait un rôle central durant le phénomène

d’apoptose par l’abolition ciblée de ces facteurs cellulaires essentiels à l’intégrité génomique.

Il est intéressant de constater que, en plus de la PARP et de la DNA-PKcs, d’autres protéines,

intervenant elles aussi dans les processus de réparation de l’ADN, comportent également un

site consensus de reconnaissance par la Caspase-3 (Mol et al., 1995; Savitsky et al., 1995). On

peut supposer que ces différentes machineries cellulaires, nécessaires à la détection et à la

réparation des dommages de l’ADN, soient détruites lorsque la cellule s’engage dans la voie

de la mort programmée.

(ii) Deuxième cible, la lamina nucléaire: intervention des Lamines A et B

Le clivage des Lamines, au cours du processus d’apoptose, entraîne leur solubilisation et la

dissociation irréversible de la lamina nucléaire, à la différence de la mitose où un stock de

Lamine est conservé afin de permettre la reformation de la lamina. Cette dissociation permet

la réorganisation et le bourgeonnement ultérieur de la chromatine condensée, en corps

apoptotiques. La protéolyse des Lamines est exercée par un membre de la famille des

Caspases, la Caspase-6 (Mch2, [Orth et al., 1996]).

(iii) Troisième cible, l’ADN génomique: nucléases?

Si la fragmentation internucléosomique de l’ADN génomique, formant sur un gel d’agarose la

classique „échelle d’ADN“, est une caractéristique courante de l’apoptose, elle ne constitue

toutefois pas un critère systématique. En effet, plusieurs cas d’apoptose sans échelle d’ADN

ont été observés (Schulze Osthoff et al., 1994). Par contre, le clivage de l’ADN en fragments

de 50 à 300 kb, précédant la fragmentation internucléosomique et apparaissant lors de la

condensation de la chromatine, semble être un événement très précoce du processus

apoptotique (Brown et al., 1993). Les tailles observées pour ces fragments pourraient être dues

à leur structure d’origine en boucles (30-50 Kbp) et en rosettes (200-300 Kbp). Il est possible

que la Topoisomérase II soit responsable de la formation de ces fragments d’ADN de grande

taille. L’identité de la ou des endonucléase(s) responsable(s) de la fragmentation

internucléosomique caractéristique de la mort cellulaire programmée est encore au coeur du

débat. Plusieurs travaux démontrent que la DNasel est un candidat potentiel (Peitsch et al.,

1992, 1993a, 1993b) mais une autre nucléase a également été proposée (Compton and

Cidlowski, 1987; Gaido and Cidlowski, 1991). L’agent activateur des nucléases n’est pas non

plus connu mais, étant donné la responsabilité importante qu’assument les Caspases dans

l’exécution de la mort cellulaire, il est tentant de postuler que celles-ci soient responsables de

l’activation des nucléases. Certains facteurs de la mitochondrie pourraient aussi jouer un rôle

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