A SEQUÊNCIA COMPREENDIDA ENTRE OS NUCLEÓTIDOS 1263 A

1466 ALTERA A DISTRIBUIÇÃO INTRACELULAR DO ANTIGENOMA DO

HDV

De acordo com os resultados obtidos nos ensaios de transfecção transitória com o vector pDM138 e northern blot pode-se concluir que o RNA antigenómico do HDV possui um elemento cis que desempenha funções pós-transcricionais semelhantes ao PRE do HBV na acumulação de mRNAs com intrões no citoplasma. A actividade pós-transcricional do elemento de exportação do HDV (NEE) é independente das proteínas codificadas pelo vírus, tal como o PRE do HBV.

Apesar dos resultados obtidos indicarem que NEE do antigenoma do HDV é capaz de substituir funcionalmente o PRE do HBV no sistema repórter pDM138, desconhece-se o seu papel na exportação nuclear do RNA antigenómico do vírus. Para averiguar a eventual participação do NEE na exportação nuclear dos RNAs antigenómicos do HDV utilizou-se o plasmídeo pDL481. Este vector codifica exclusivamente moléculas de RNA antigenómico do HDV (Lazinski and Taylor, 1994) que na ausência dos HDAgs são detectadas simultaneamente no núcleo e citoplasma das células (Tavanez et al., 2002). A análise funcional do motivo de exportação foi realizada por deleção da sequência que codifica o NEE do pDL481, seguida da transfecção de células Huh7 com o vector resultante, o pDL481ΔNEE.

Utilizando uma interface da internet (www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/) que permite fazer predições da estrutura secundária de sequências de RNA, verificou-se que o NEE analisado isoladamente apresenta uma estrutura secundária complexa com vários hairpins (Figura II.4.3.1 A). Na tentativa de estabelecer uma relação entre a estrutura secundária prevista para o sinal de exportação identificado no antigenoma do HDV e a sua actividade, fizeram-se predições da estrutura secundária das oito sequências truncadas do sinal de exportação, anteriormente testadas por ELISA. Verificou-se, curiosamente, que as sequências truncadas capazes de induzir um aumento na expressão da proteína CAT semelhante ao PRE do HBV, possuem um motivo estrutural constituído por uma região de RNA de cadeia dupla que bifurca em duas mini- hélices. As duas mini-hélices, assinaladas em A, C, D a F da figura II.4.3.1 com um círculo a vermelho, são formadas por dois stems com 8 e 10 bp e duas ansas com 10 nucleótidos. Este motivo estrutural parece ser importante para a actividade do sinal de exportação. Deleções na sequência compreendida entre os nucleótidos 1263 e 1466 do RNA antigenómico que impossibilitam a formação desta estrutura, resultam na perda de função do sinal de exportação

nuclear, tal como observado nos ensaios de CAT-ELISA. Na figura II.4.3.1 B encontra-se representada a estrutura secundária prevista para uma das sequências truncadas considerada defectiva na exportação nuclear de mRNAs heterólogos com um intrão produzidos a partir do vector pDM138. Para esta sequência não se prevê a formação das duas mini-hélices presentes em todas as sequências de RNA antigenómico do HDV funcionais na exportação nuclear no sistema pDM138.

Figura II.4.3.1. Estruturas secundárias previstas para seis sequências compreendidas entre os nucleótidos 1263 e 1466, 1263 e 1411, 1301 e 1436, 1263 e 1436, 1277 e 1466, e 1277 e 1436 do RNA antigenómico do HDV. O círculo a vermelho aponta para as duas mini-hélices necessárias para a actividade do sinal de exportação do RNA anigenómico do HDV.

Contudo, as previsões informáticas para a sequência completa do RNA antigenómico do HDV sugerem uma conformação diferente para o sinal de exportação. No contexto do RNA antigenómico completo, o sinal de exportação identificado situa-se na região central de cadeia dupla da estrutura de bastonete do antigenoma do HDV, para a qual não se prevêem bifurcações, exceptuando a presença de duas mini-hélices com 2 e 3 bp de comprimento (FIgura II.4.3.2). 1263-1466 
 1263-1411 
 1301-1436 
 A B C 1277-1466 
 1277-1436 
 1263-1436 
 D E F

Figura II.4.3.2. Estrutura secundária prevista para o sinal de exportação identificados (nucleótidos 1263 a 1466) na sequência completa do RNA antigenómico do HDV.

Estes dados podem sugerir que a sequência que, por complementaridade de bases, emparelha com o sinal de exportação nuclear, está também envolvida no transporte do RNA antigenómico do núcleo para o citoplasma.

Tendo em conta as previsões feitas para a estrutura secundária do NEE construíram-se mais dois mutantes de deleção do plasmídeo pDL481, o pDL481ΔNEEδ e o pDL481Δδ. O plasmídeo pDL481ΔNEEδ codifica para o RNA antigenómico do HDV sem o elemento de exportação (nt 1263 a 1466) e sem a sequência prevista de formar emparelhamentos intramoleculares com o NEE (nt 301 a 507) , enquanto a construção pDL481Δδ codifica para um mutante do RNA antigenómico do vírus, apenas sem a sequência que emparelha com o referido sinal de exportação.

Os RNAs produzidos pelo vector pDL481ΔNEEδ, de acordo com as ferramentas informáticas utilizadas, formam uma estrutura de bastonete sem ramificações, semelhante à conformação assumida pelas moléculas de RNA antigenómico do tipo selvagem. Deste modo foi possível estudar o papel da sequência identificada, utilizando o sistema repórter pDM138, na exportação nuclear do RNA antigenómico do HDV, preservando-se a conformação mais provável para RNA do vírus. Os RNAs antigenómicos mutantes produzidos a partir dos plasmídeos pDL481ΔNEE e pDL481Δδ, formam uma estrutura de bastonete interrompida numa pequena extensão da sequência por mini-hélices que ramificam da região de RNA de cadeia dupla (resultados não apresentados).

Os vectores construídos foram utilizados para transfectar células Huh7 e a distribuição intracelular dos RNAs sintetizados foi comparada com a do RNA antigenómico do tipo selvagem. No caso do NEE estar envolvido na exportação nuclear do antigenoma do HDV, seria natural registar-se uma alteração na distribuição intracelular dos RNAs mutantes em relação ao RNA do tipo selvagem, verificando-se uma acumulação no núcleo das células. Nas transfecções utilizou-se ainda o plasmídeo pDL542, que codifica para o RNA genómico do HDV, o qual se localiza tanto no núcleo como no citoplasma das células. Recorde-se que,

genoma do HDV tão forte quanto o NEE do RNA antigenómico na exportação nuclear de mRNAs com intrões. No entanto, sabe-se que as RNPs do HDV formadas pelo RNA genómico do vírus e os HDAgs são continuamente exportados do núcleo para o citoplasma das células, sendo este processo mediado pelo RNA do vírus (Tavanez et al., 2002).

A análise da distribuição núcleo-citoplasmática do RNA do HDV, após transfecção, foi efectuada por RT-PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR).

Para quantificação relativa do RNA do HDV nas fracções celulares por qPCR, os citoplasmas das células Huh7 transfectadas foram separados dos núcleos e o RNA de ambas as fracções foi isolado, purificado e utilizado na síntese de cDNA. Para avaliar a eficácia do método adoptado no fraccionamento celular, as proteínas das fracções nucleares e citoplasmáticas foram analisadas por electroforese em géis de SDS-PAGE seguida da técnica de Western Blot, em que se empregou um anticorpo específico para uma proteína celular predominantemente citoplasmática, GAPDH.

Como se pode observar na figura II.4.3.3, utilizando quantidades equivalentes de proteína total, a proteína GAPDH é detectada predominantemente nas fracções citoplasmáticas. Estes resultados mostram que o método utilizado no fraccionamento celular permite a obtenção de fracções nucleares quase livres de contaminação por proteínas citoplasmáticas, permitindo a sua utilização em ensaios de qRT-PCR.

Figura II.4.3.3. Análise de extractos nucleares e citoplasmáticos de células Huh7, por Western blot com um anticorpo anti-GAPDH (Ambion). Células Huh7 foram transfectadas com os vectores pDL481, pDL542, pDL481ΔNEE, pDL481ΔNEEδ e pDL481Δδ. Após fraccionamento celular e isolamento do RNA total, as proteínas das fracções nucleares e citoplasmáticas foram precipitadas e dissolvidas em tampão de amostra. Quantidades equivalentes de extractos nucleares (colunas assinaladas com a letra N) e citoplamáticos (colunas assinaladas com a letra C) foram separados por electroforese em gel de poliacrilamida a 12% e transferidos para uma membrana de nitrocelulose e incubados com um anticorpo anti-GAPDH. À esquerda encontram-se indicados os pesos moleculares, em kDa, de uma mistura comercial de proteínas cujas dimensções são conhecidas.

M n c n c n c n c n c 117 85 48 34 26 19

Os resultados do qRT-PCR foram analisados segundo o método de quantificação relativa ΔΔCt, utilizando-se o gene da β-2-MG como normalizador (Livak and Schmittgen, 2001). Na figura II.4.3.4 apresentam-se as rectas de regressão e as respectivas equações utilizadas para determinar a eficiência dos primers usados nas reacções de amplificação do cDNA do HDV e da β-2-MG.

Figura II.4.3.4. Determinação da eficiência de amplificação (E) nas reacções de qPCR. Para cada par de primers traçou-se uma recta de regressão linear dos valores de Ct obtidos por amplificação de cinco diluições sucessivas 1:10 do cDNA sintetizado por transcrição reversa. O declive (m) das rectas foi utilizado para cálculo da eficiência dos primers pela fórmula E = 10(-1/m).

Os valores de Ct utilizados na determinação da eficiência dos primers foram ainda usados para traçar uma recta de regressão que representa a variação de Ct (ΔCt) do gene de interesse em relação ao gene normalizador em função da concentração de cDNA. A aplicação do método ΔΔCt implica a utilização de primers nas reacções de qRT-PCR com eficiências superiores a 95% e também um declive inferior a 0.1 para a recta de regressão que representa as variações de Ct do gene de interesse em relação ao gene normalizador em função da concentração de cDNA. Neste caso obtiveram-se eficiências de 96% para os dois pares de primers utilizados nas reacções de amplificação do cDNA do gene da β-2-MG e do cDNA do HDV (Figura II.4.3.4) e a inclinação da recta tem um valor de -0.0092.

Para analisar o efeito do NEE na distribuição intracelular do RNA antigenómico do HDV, determinou-se inicialmente o valor de ΔCt (Ct RNA do HDV – Ct RNA do β-2-MG) para todas as fracções nucleares e citoplasmáticas. Na figura II.4.3.5 apresenta-se um exemplo das curvas de amplificação do cDNA do HDV e do gene normalizador β-2-MG obtidas nas reacções de PCR em tempo real.

Figura II.4.3.5. Exemplo das curvas de amplificação do cDNA do HDV (A) e do gene normalizador β-2-MG (B) obtidas por PCR em tempo real. Após fraccionamento celular, as fracções nucleares e citoplasmáticas de células Huh7 transfectadas foram utilizadas para extracção do RNA total. A quantificação do RNA do HDV e do gene normalizador, a partir do cDNA complementar foi efectuada por qPCR na presença de SYBR green e os resultados analisados com o programa GeneAmp 5700 SDS Sequence Detection System (Applied Biosystems). O threshold corresponde ao ciclo de amplificação em que o valor de fluorescência emitido pelo SYBR green, proporcional à quantidade de DNA presente na amostra, intersecta um determinado limiar, neste caso de 0.1.

Após quantificação relativa do cDNA do HDV em cada uma das fracções celulares, os os valores de ΔCt das fracções citoplasmáticas foram comparados com os valores de ΔCt determinados para as fracções nucleares correspondentes, obtendo-se um valor de ΔΔCt para cada um dos vectores testados. Finalmente estes valores, que traduzem a abundância relativa de RNA do HDV entre os dois compartimentos celulares, foram comparados com o valor de ΔΔCt do plasmídeo pDL481, usado como calibrador dos ensaios. As variações na proporção de RNA do HDV entre o núcleo e o citoplasma, produzido a partir dos vectores pDL481ΔNEE, pDL481ΔNEEδ, pDL481Δδ e pDL542, em relação ao pDL481 são expressas pelos valores 2-ΔΔCt (Figura II.4.3.6).

Figura II.4.3.6. Distribuição núcleo-citoplasmática do RNA do HDV em células Huh7 transfectadas com os vectores pDL542, pDL481ΔNEE, pDL481ΔNEEδ e pDL481Δδ. O RNA do vírus das fracções citoplasmáticas e nucleares (C/N) foi quantificado por qRT-PCR e os resultados foram analisados pelo método de quantificação relativa ΔΔCt. Os resultados apresentados correspondem à media de 2 experiências independentes. As barras verticais a branco correspondem ao desvio padrão.

Os resultados obtidos por qRT-PCR mostram que o elemento de exportação nuclear identificado no antigenoma do HDV altera a distribuição núcleo-citoplasmática do RNA antigenómico do HDV. Células Huh7 transfectadas com vectores pDL481ΔNEE e o pDL481ΔNEEδ, que codificam para moléculas de RNA antigenómico do HDV sem o elemento de exportação nuclear, apresentam uma diminuição de 60% na proporção de RNA antigenómico no citoplasma em relação ao núcleo. Esta redução na proporção de RNA antigenómico no citoplasma em relação ao núcleo, sugere que o NEE, para além de promover a exportação nuclear de mRNAs heterólogos com intrões, encontra-se envolvido no mecanismo de exportação nuclear do RNA antigenómico do HDV. Consequentemente, o RNA antigenómico sem NEE é menos eficiente na exportação nuclear.

Em relação à sequência predita de emparelhar com o NEE na estrutura de bastonete do RNA antigenómico do HDV, os resultados obtidos sugerem que esta sequência não se encontra directamente envolvida na exportação nuclear. A variação na distribuição núcleo-

pDL481ΔNEEδ é similar à variação observada para células que expressam antigenomas mutantes apenas para o elemento de exportação. Por outro lado, obtiveram-se evidências que os RNAs antigenómicos sem a sequência que forma emparelhamentos intramoleculares com NEE, são mais eficientes na exportação nuclear do que as moléculas de RNA antigenómico do tipo selvagem. Em relação ao vector pDL481, as células transfectadas com o vector pDL481Δδ apresentam uma maior quantidade de RNA antigenómico no citoplasma.

Segundo um estudo anterior (Macnaughton and Lai, 2002), o RNA genómico do HDV é preferencial e continuamente exportado do núcleo para o citoplasma, logo após a síntese e processamento, enquanto que o RNA antigenómico é detectado predominantemente no núcleo das células. Sendo o RNA genómico a única espécie de RNA do HDV detectada nos viriões, a exportação nuclear diferencial dos RNAs do HDV poderia intervir num mecanismo que contribui para a exclusão do RNA antigenómico do processo de formação de partículas virais. Neste sistema experimental os resultados obtidos por qRT-PCR contestam as evidências anteriores de que os RNAs do HDV apresentam uma distribuição núcleo-citoplasmática distinta. Não se registaram diferenças significativas na proporção de RNA do HDV no citoplasma em relação ao núcleo, em células transfectadas com um vector que codifica exclusivamente para o RNA genómico do vírus (pDL542). A alteração média na proporção de RNA genómico em células transfectadas com o vector pDL542, em relação ao vector pDL481 foi apenas de 0.9 vezes (FIgura II.4.3.6). Estes resultados mostram que, na ausência dos HDAgs, o RNA antigenómico e genómico do HDV são exportados do núcleo para o citoplasma em quantidades semelhantes.