RT-PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL

Para a quantificação do RNA do HDV nas fracções nucleares e citoplasmáticas de células Huh7 por qRT-PCR, procedeu-se, inicialmente, ao fraccionamento celular. A separação dos núcleos dos citoplasmas foi efectuada de acordo com o procedimento descrito por Wang et al. (2006). Sucintamente, 48 horas após a transfecção, as células Huh7 foram tripsinizadas, recolhidas em meio RPMI com 10% FBS e lavadas três vezes com PBS 1X pré-arrefecido a 4ºC. Após uma centrifugação a 4000 rpm durante 3 min. a 4ºC, os sedimentos celulares foram gentilmente ressupensos em 1 ml de tampão RSB (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2). Após uma breve incubação a 4ºC, seguida de uma centrifugação nas condições anteriores, as células túrgidas foram ressuspensas em quatro volumes de tampão de lise RSBG40 (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 10% (p/v) Glicerol, 0.5% Nonidet-P40, 0.5 mM DTT e 100U/ml inibidores de RNases (Ribolock, Fermentas). Seguiu-se uma nova centrifugação a 7000 rpm, durante 3 min., a 4ºC, e os sobrenadantes (primeira fracção citoplasmática) foram transferidos para um novo tubo. Os núcleos sedimentados foram ressuspensos e incubados durante 5 min. em tampão de lise suplementado com 0.3% deoxicolato de sódio. Seguidamente, os núcleos foram centrifugados e o sobrenadante resultante (segunda fracção citoplasmática) foi adicionado à fracção citoplasmática, previamente recolhida. Os núcleos foram lavados, uma última vez, em tampão de lise RSBG40

e centrifugados a 10000 rpm a 4ºC, durante 5 min. A lise celular e a integridade dos núcleos foi analisada por microscopia óptica, após incubação de uma aliquota da suspensão nuclear, com uma solução de 0.4% azul tripano.

Os extractos nucleares e citoplasmáticos foram imediatamente utilizados para extracção do RNA e das proteínas totais com o kit NucleoSpin® _{RNA/Protein (Macherey-Nagel). As proteínas} totais das fracções celulares foram analisadas por electroforese em géis de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), seguida da técnica de Western blot, para monitorizar possíveis contaminações entre as fracções citoplasmáticas e nucleares (descrito mais a frente, no ponto II.3.9 dos materiais e métodos deste capítulo).

Apesar do kit NucleoSpin® _{RNA/Protein incluir um passo que consiste na hidrólise enzimática} do DNA presente nos extractos celulares, o RNA total de ambas as fracções celulares foi, antes das reacções de síntese de cDNA, submetido a uma segunda incubação com DNAse I para assegurar a remoção completa de quaisquer vestígios de DNA das amostras. Para isso, utilizou- se o kit comercial DNA-freeTM _{(Ambion), de acordo com as instruções indicadas pelo} fabricante.

O RNA livre de DNA foi, em seguida, utilizado na síntese de cDNA por transcrição reversa (RT), utilizando o kit Revert AidTM _{first strand cDNA Synthesis (Fermentas). Antes de se} iniciarem as reacções de RT, procedeu-se à desnaturação de cerca de 5 µg de RNA total e 0.2 µg de primers aleatórios num volume total de 12.5 µl, por aquecimento a 70ºC durante 5 min. Após desnaturação, as amostras foram colocadas em gelo e adicionou-se tampão da transcriptase reversa do vírus da leucemia murina Moloney (M-MuLV), 2 mM dNTP e 20 U de inibidores de RNAses. As amostras foram então incubadas durante 5 min. à temperatura ambiente, para permitir o emparelhamento dos primers aleatórios com as sequências de RNA presentes na amostra. Por fim, adicionou-se 200 U de transcriptase reversa M-MuLV, num volume final de 20 µl e incubaram-se as amostras durante 10 min., à temperatura ambiente, seguindo-se uma incubação de uma hora, a 42ºC. Por fim a transcriptase reversa do M-MuLV foi inactivada por aquecimento a 70ºC, durante 10 min.

O cDNA resultante foi, em seguida, utilizado em reacções de PCR em tempo real para quantificação do RNA do HDV presente nas fracções nucleares e citoplasmáticas de células Huh7. O PCR em tempo real difere do convencional, na medida em que, os produtos de amplificação são analisados na fase exponencial da reacção. Durante esta fase, a quantidade de DNA obtido por amplificação reflecte a concentração de cDNA inicial presente na amostra. A acumulação do DNA, como resultado da amplificação por PCR, foi detectada através da excitação de um fluorocromo que se intercala entre as de bases do DNA, SYBR® _{Green I, e}

emite uma fluorescência directamente proporcional à quantidade de DNA de cadeia dupla presente na amostra. Os resultados do qRT-PCR foram posteriormente analisados segundo o método de quantificação relativa ΔΔCt (Livak and Schmittgen, 2001).

As reacções de PCR em tempo real foram realizadas no aparelho GeneAmp® _{5700 SDS} Sequence Detection System (Applied Biosystems) e os resultados foram processados pelo

software GeneAmp® _{5700 SDS (Applied Biosystems) .}

Todas as amostras foram analisadas em triplicado, num volume de reacção de 20 µl com 3.5 mM MgCl2, 200 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP e dUTP), 0.6 µl SYBR® Green I (Eurogentec), 0.5 U DNA polimerase HotGold Star (Eurogentec), 1X tampão de reacção, 300 ηM de forward e reverse primer e 2 µl de cDNA. Após uma incubação de 10 min. a 95ºC, para activação da DNA polimerase (HotGoldStar), as amostras foram sujeitas a 40 ciclos de amplificação constituídos por uma incubação de 15 segundos, a 95ºC, para desnaturação das cadeias de DNA, seguida de uma incubação de 1 min., a 60ºC, para emparelhamento e extensão dos primers.

A quantidade de DNA em cada reacção de PCR é expressa pelo valor de Ct, que corresponde ao ciclo da fase exponencial de amplificação em que o valor de fluorescência intersecta o limiar definido pelo experimentador, sendo neste caso de 0.1.

Para aplicação do método de quantificação relativa ΔΔCt, utilizaram-se dois pares de primers nas reacções de PCR em tempo real. Um dos pares de primers foi utilizado para amplificar o cDNA complementar ao RNA do HDV, presente nas fracções nucleares e citoplasmáticas de células Huh7 e o outro par, usado para amplificar o cDNA complementar ao mRNA da β-2- microglobulina (β-2-MG), utilizado como normalizador. Utilizou-se o programa Primer ExpressTM _{1.5 para desenhar os pares de primers sintéticos utilizados nas reacções de PCR,} cujas sequências se encontram na tabela II.3.5.

cDNA

amplificado Forward primer 5’→ 3’ Reverse Primer 5’→ 3’

Código de acesso à base de dados Genebank da NBCI

β2MG GGCTATCCAGCGTACTCCAA TCACACGGCAGGCATACTC NM_004048

HDV CAGAGATTCTCCGGCGTTGT CGGTAAAGAGCATTGGAACG M21012

Tabela II.3.5. Sequência dos primers sintéticos utilizados nas reacções de amplificação por qPCR.

O método ΔΔCt requer que a eficiência de amplificação dos primers seleccionados para o gene de interesse e para o gene normalizador seja muito aproximada, com valores superiores a 95%. A eficiência dos primers foi calculada pela fórmula E = 10(-1/m)_{, sendo (m) o declive das rectas}

de regressão linear construídas com os valores de Ct obtidos na amplificação das diluições 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000 do cDNA, com os primers seleccionados. Foi ainda, traçada a recta de regressão que representa a variação dos valores de Ct (ΔCt) obtidos para o RNA do HDV em relação ao mRNA da β-2-MG, em função da concentração de cDNA. O declive desta recta de regressão, que deve ser inferior a 0.1, é um indicador de que a eficiência das reacções de amplificação com os dois pares de primers se mantém constante, independentemente da concentração do cDNA.

De acordo com o método de quantificação relativa ΔΔCt, os valores de Ct obtidos em amostras diferentes não podem ser directamente comparados. Os valores de Ct para o RNA de interesse, neste caso o RNA do HDV nas duas fracções celulares, foram primeiro comparados com os valores de Ct obtidos para o mRNA da β-2-MG, a partir da mesma amostra de cDNA. Esta comparação, ΔCt (CtRNA do HDV– Ctβ-2-MG) destina-se a normalizar a quantidade de cDNA obtida por transcrição reversa do RNA total das fracções nucleares e citoplasmáticas de células Huh7. Em seguida, os valores de Ct normalizados para o RNA do HDV no citoplasma foram comparados com os respectivos valores nucleares, obtendo-se um valor ΔΔCt para cada transfecção. As variações na proporção núcleo-citoplasmática de RNA do HDV, em relação ao valor de ΔΔCt para as células Huh7 transfectadas com o vector pDL481, são expressas pelos valores 2-ΔΔCt_{. Os resultados apresentados correspondem à média de dois ensaios} independentes.