Janeiro, Brasil
CRISSIUMA, A; FAVACHO, A; GERSHONY, L; MENDES-DE-ALMEIDA, F; GOMES, R; MARES-GUIA, A; ROZENTAL, T; BARREIRA J; LEMOS E; LABARTHE, N. Prevalence of Bartonella species DNA and antibodies in cats (Felis catus) submitted to a spay/neuter program in Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Feline Medicine and Surgery, aceito, aguardando publicação (doi:10.1016/j.fms.2010.08.010)
4.1.1 Introdução
O gênero Bartonella consiste de bactérias Gram-negativas, intra-eritrocitárias facultativas (Chomel et al. 2009), do subgrupo de α2 Proteobacterias (Birtles & Raoult 1996). O gênero é agente etiológico de diversas doenças de gatos e de humanos (Boulouis et al. 2005). As espécies de Bartonella encontram-se distribuídas por todo mundo (Breitschwerdt & Kordick 2000)e são consideradas patógenos emergentes(Karem, Paddock & Regnery 2000,
Boulouis et al. 2005) tanto na medicina humana quanto na veterinária (Boulouis et al. 2005). Ctenocephalides felis felis é comumente encontrada parasitando gatos domésticos e sabe-se que alberga bactérias do gênero Bartonella (Lappin et al. 2006). As pulgas podem transmitir infecções por Bartonella henselae entre gatos, podendo ainda ter importância na transmissão de espécies de Bartonella entre gatos e humanos(Chomel et al. 1996, Lappin et al. 2006).
Bactérias do gênero Bartonella, por serem transmitidas por artrópodes, são favorecidas por altas temperaturas e umidade ambientes (Jameson et al. 1995) portanto, mudanças climáticas globais poderão propiciar condições favoráveis para o aumento e dispersão de populações de vetores e, consequentemente, alterar padrões de transmissão e infecção. Bartonelose humana é relatada em todo o mundo(Breitschwerdt & Kordick 2000, Boulouis et al. 2005, Chomel et al. 2006), já tendo sido especificamamente documentada no Rio de Janeiro (Lamas et al. 2007), onde as condições ambientes são quentes e úmidas (MAPA 2010).
Neste estudo a circulação de bactérias do gênero Bartonella foi estudada em gatos (Felis catus) residentes na cidade do Rio de Janeiro, Brasil, com o objetivo de gerar dados atualizados para análise de risco de infecção na cidade.
4.1.2 Material e Métodos
Quarenta gatos clinicamente sadios foram incluídos neste estudo, 13 machos e 27 fêmeas, com idade variando entre 4 e 24 meses ( X =10,38; σ= 7,34), apresentados a um programa de esterilização cirúrgica (Desengata®) na cidade do Rio de Janeiro, Brasil. Amostras sanguineas foram obtidas de todos os gatos, com e sem EDTA. Os gatos foram, então, penteados pelo corpo todo (Fleacomb; Lambert Kay Twinco, USA) por 5 minutos, sobre uma bandeja coletora, para obtenção dos ectoparasitas encontrados neles. Todas as pulgas coletadas foram mortas pelo frio a -20 ºC, identificadas de acordo com o critério de classificação entomológica (KRÄMER & MENCKE 2001) e mantidas a - 20 ºC, em pools de até quatro pulgas que foram, então, acondicionados em microtubos de 1,5 ml. até o processamento. Os pools de pulgas foram submetidos à desinfecção da superfície externa através da adição de 500 µl de hipoclorito de sódio a 10%, seguida de lavagem com 1 ml de etanol a 70% e posteriormente por duas lavagens seguidas com 1 ml de água destilada estéril. Os pools de pulgas foram, então, submetidos à trituração com auxílio de um pilão para início
do procedimento de extração de DNA. QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen; Hilden, Germany) foi utilizado para a extração do DNA de todos os pools de pulgas, sangue total e coágulos sanguíneos dos gatos. DNA de bactérias do gênero Bartonella foi identificado no sangue e no coágulo utilizando-se a reação em cadeia de polimerase (PCR) e primers específicos CAT1
[50-GATTCAATTGGTTTGAA(G/A)GAGGCT-30] e CAT2
[50-TCACATCACCAGG(A/G)CGTATTC-30] para genes selecionados (htrA,60 kDa heat shock protein)(ANDERSON et al. 1994). Fragmentos de DNA foram amplificados usando 8µL de uma solução de DNA eluído em um total de 25µL de mix de PCR caracterizado por desnaturação a 95ºC por 5 minutos, seguido de 40 ciclos a 95ºC por 30 segundos, 60ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto; seguiu-se com extensão final de 5 minutos a 72ºC. Os produtos amplificados foram corridos em gel de agarose e visualizados com uso de brometo de etídio e luz ultravioleta para verificar a presença de fragmento. Utilizou-se um controle sabidamente positivo em todas as PCRs e água destilada foi usada como controle negativo. Os gatos foram considerados portadores da bactéria sempre que o DNA do gênero Bartonella era encontrado no sangue ou no coágulo.
Amostras séricas foram testadas para a presença de imunoglobulinas G (IgG) contra B.
henselae por meio da imunofluorescência indireta (IFA) (cutoff 1:64). Para tanto, foram utilizadas lâminas contendo cultura de células infectadas com antígeno previamente fixado em cada orifício (Bion; Illinois, USA).
4.1.3 Resultados
A maioria dos gatos incluídos no estudo foi previamente exposta a bactérias do gênero
Bartonella seja por albergar DNA bacteriano no sangue ou coágulo, ou por apresentar títulos de anticorpos contra B. henselae. DNA de bactérias do gênero Bartonella foi detectado no sangue e no coágulo de 17 gatos (42,5%) e sororreatividade para B. henselae foi encontrada em 19 (47,5%) deles. DNA e anticorpos foram detectados simultaneamente em nove gatos (22,5%). Animais sororreagentes apresentaram títulos de 1:64 (1/19 - 5,3%), 1:128 (8/19 - 42,1%), 1:256 (5/19 - 26,3%), 1:512 (3/19 - 15,8%) ou de 1:1024 (2/19 - 10,5%).
Exatamente 50% dos gatos (20) estava infestada por pulgas e em nove deles DNA de bactérias do gênero Bartonella foi detectado nas amostras sanguíneas. Destes 20 gatos, 13 estavam infestados por uma a cinco pulgas e sete gatos tinham entre 6 e 22 pulgas. O total de 119 pulgas foi coletado desses gatos e a carga parasitária variou de 1 a 22 pulgas por animal
( X =5,95; σ=6,44). DNA bacteriano foi detectado no pool de pulgas de quatro dos 20 gatos infestados por pulgas. Estes quatro gatos apresentaram menos de quatro pulgas cada, resultando em apenas um pool de pulgas para cada animal. Dos quatro gatos que apresentaram pools de pulgas com resultados positivos na PCR, apenas um apresentou DNA bacteriano em sua amostra sanguínea.
4.1.4 Discussão
A prevalência de gatos portadores de DNA bacteriano foi semelhante àquela encontrada em estudos anteriores(Dehio 2004), particularmente quando condições ambientais semelhantes (temperatura e umidade) foram consideradas (Jameson et al. 1995).
Anticorpos contra B. henselae não foram detectados em 21 gatos (52,5%); dentre eles, oito (38%) apresentaram DNA bacteriano nas amostras sanguíneas ou coágulos, sugerindo infecção recente, infecção por outras espécies de Bartonella que não apresentaram reação cruzada com B. henselae, imunossupressão ou o resultado da baixa capacidade imunogênica do lipopolissacarídeo (LPS) de Bartonella spp. (MERRELL & FALKOW 2004).
A concentração de anticorpos detectáveis não deve ser interpretada como infecção recente de B. henselae em gatos, uma vez que pode ocorrer reação cruzada com outras espécies de Bartonella(BRUNT et al.2006).
A discrepância entre a prevalência de DNA de Bartonella nas amostras sanguíneas dos gatos (42,5%) e a freqüência de DNA detectado nos pools de pulgas desses gatos sugere que a concentração de DNA bacteriano nas pulgas pode ter sido insuficiente para sua detecção pelas técnicas utilizadas neste estudo. Outra possibilidade é que pulgas tenham parasitado estes gatos durante o período de espera na clínica, vindas de gatos sem bacteremia. Portanto, o tempo transcorrido entre a infestação dos hospedeiros portadores de bacteremia e o exame físico deles pode ter sido insuficiente para que as pulgas ingerissem bactérias e para que elas se multiplicassem no tubo digestivo dos insetos, alcançando níveis acima do limite da sensibilidade do teste.
4.2 Abordagem ampliada – Avaliação clínica de gatos domésticos (Felis catus, Linnaeus