achados enfatizam que veterinários devem evitar mordidas e arranhões de gatos e evitar contato com fezes de pulgas além de lavar feridas imediatamente após sua ocorrência e as mãos após qualquer exame físico realizado (BRUNT et al. 2006).
3.9 Diagnóstico laboratorial de Bartonella spp.
Isolamentos de Bartonella em amostras biológicas de pessoas imunocompetentes com evidências sorológicas, patológicas ou moleculares de infecção frequentemente falham. Muitos pesquisadores já indicaram que os métodos de isolamento de Bartonella precisam ser melhorados (BREITSCHWERDT et al. 2007). Adicionalmente, é preciso considerar que muitas vezes, a apresentação clínica das doenças nos mamíferos é extremamente complexa, e a busca pelo agente etiológico de uma enfermidade relaciona-se ao espectro de conhecimento teórico e prático dos médicos responsáveis por sua pesquisa. No contexto das doenças infecciosas transmitidas por vetores, das zoonoses, da medicina que envolve o ambiente e da saúde do ecossistema, os veterinários continuam como os principais contribuintes do enriquecimento da saúde, uma vez que pesquisam as doenças infecciosas de forma comparativa e não isolada a uma única espécie (BREITSCHWERDT et al. 2009).
Para o diagnóstico de bactérias do gênero Bartonella uma combinação de achados clínicos e laboratoriais devem ser considerada. Assim, a presença de síndrome clínica associada à exclusão de outras causas de doença, testes positivos para Bartonella spp. em cultura, reação em cadeia de polimerase (PCR) e/ou sorologia, e resposta à administração de fármacos com presumível atividade contra Bartonella devem ser considerados. É importante ressaltar que os antibióticos utilizados para o tratamento da bartonelose são de amplo espectro, sendo eficazes contra outros organismos capazes de causar síndromes semelhantes. Dessa forma, mesmo quando há resposta clínica ao tratamento antibiótico, o diagnóstico clínico da bartonelose não é definitivo (BRUNT et al. 2006).
Cultura de sangue ou tecidos, amplificação do DNA de Bartonella por PCR de tecidos ou fluidos corporais (BRUNT et al. 2006, BREITSCHWERDT 2008), achados de sequências parciais de genes específicos, como 16S rRNA, citrato sintase e groEL (CHOMEL, BOULOUIS & BREITSCHWERDT 2004), e detecção de anticorpos no soro, humor aquoso, ou fluido cérebro-espinhal podem ser usados para colaborar no diagnóstico de infecção por
B. quintana e B. bacilliformis podem ser visualizadas dentro de eritrócitos por microscopia eletrônica (BREITSCHWERDT 2008).
3.9.1 Testes sorológicos para Bartonella spp.
Anticorpos contra Bartonella spp. podem ser detectados no soro de hospedeiros mamíferos por Immunofluorescent Antibody Assay (IFA), Enzime Linked Immunosorbent
Assay (ELISA) (BRUNT et al. 2006, VERMEULEN et al. 2007) e Western Blot immunoassay (BRUNT et al. 2006).
Lâminas de IFA ou placas de ELISA, contendo diferentes espécies de Bartonella, podem ser usadas na tentativa de determinar a prevalência de exposição a diferentes espécies infectantes da bactéria. Muitos ensaios usados em gatos utilizam todo o organismo de B.
henselae (IFA) ou antígenos específicos (ELISA e Western blot immunoassay) para detecção de anticorpos (BRUNT et al. 2006).
Western blot immunoassay tem a vantagem de determinar os antígenos imunodominantes reconhecidos pela resposta imunológica. Entretanto, os resultados obtidos pela técnica, seja na detecção de classes diferentes de anticorpos (IgM ou IgG), magnitude de concentração de anticorpos ou reconhecimento de padrões de antígenos não são consistentes com a presença ou ausência da infecção (BRUNT et al. 2006).
A interpretação de resultados sorológicos para estimar a prevalência de uma determinada espécie de Bartonella em uma população deve ser cuidadosa, uma vez que pode ocorrer reação cruzada entre as espécies do gênero. Por exemplo, anticorpos contra B.
henselae geralmente apresentam reação cruzada com B. clarridgeiae (BRUNT et al. 2006) e
B. quintana (JACKSON et al. 1996), assim como com outras espécies de bactérias, tais como
Chlamydia e Coxiella. Entretanto, estudo realizado em gatos domésticos na Jordânia, indicou que mais de 90% dos gatos com títulos de IgG específicos para B. quintana não apresentaram IgG detectável contra B. henselae (AL-MAJALI 2004). De qualquer forma, é mais prudente considerar que testes sorológicos com resultados positivos sugerem exposição à Bartonella spp., apesar de não comprovarem infecção corrente e não discriminarem a espécie infectante. Resultados de testes negativos, por sua vez, não excluem infecção recente (BRUNT et al. 2006).
Durante infecção aguda em humanos é possível se detectar soroconversão por IFA ou ELISA. A cinética da resposta sorológica a antígenos de B. henselae em gatos cronicamente
infectados é muito variável em grau e duração (BREITSCHWERDT 2008). Durante o período de bacteremia, gatos infectados natural ou experimentalmente por B. henselae mantêm titulações entre 1:256 e 1:512 (ABBOTT et al. 1997). Altas concentrações de anticorpos geralmente se correlacionam a culturas positivas ou detecção de DNA de Bartonella no sangue (BREITSCHWERDT 2008).
3.9.2. Amplificação do DNA de Bartonella spp.
A detecção da presença de bactérias pela amplificação do DNA é confirmatória da infecção. Adicionalmente, o sequenciamento gênico de 16S rRNA é fundamental para a classificação das espécies de Bartonella envolvidas (CLARRIDGE et al. 1995).
Vários genes podem ser alvos da amplificação do DNA de Bartonella spp. em amostras sanguíneas, outros fluidos ou tecidos de felinos. Ensaios de PCR que têm como alvo a região intergênica 16S-23S podem ser desenhados para amplificar diferentes espécies, resultando em produtos de diferentes tamanhos, de forma que um simples ensaio pode também ser usado para determinar as espécies de organismos infectantes (BRUNT et al.
2006). Por exemplo, um par de primers, CAT1
5'-GATTCAATTGGTTTGAA(G\A)GAGGCT-3' e CAT2
5'-TCACATCACCAGG(A\G)CGTATTC-3', que define um fragmento de 414 pb tanto de B.
henselae quanto de B. quintana pode ser utilizado para amplificação por PCR. Para confirmar a identificação dos produtos da PCR e diferenciar entre B. hensalae e B. quintana, um ensaio de hibridização dot blot pode ser realizado em seguida, utilizando-se sondas de oligonucleotídeos com vinte pares de bases, RH1 e RQ1, respectivamente (ANDERSON et al. 1994).
Ensaios de PCR podem ser dispendiosos para serem realizados; além disso, requerem laboratórios especializados e rigoroso controle de qualidade no intuito de evitar resultados falsos. Entretanto, os resultados podem ser alcançados mais rapidamente que aqueles oriundos da cultura. Resultados de PCR verdadeiramente positivos documentam a presença de DNA microbiano, mas não provam que o organismo estava vivo, ou que o gato estava clinicamente doente pela infecção. Resultados de PCR falso-negativos podem ocorrer como conseqüência de bacteremia intermitente, prévio uso de antibióticos, falta de DNA microbiano na amostra testada, ou pela presença de substâncias inibitórias ou interferentes nos espécimes biológicos (BRUNT et al. 2006).
3.9.3. Isolamento de Bartonella spp. por cultura
Em geral, as espécies de Bartonella crescem na maioria dos meios enriquecidos por sangue (CLARRIDGE et al. 1995). Apesar de suas características de crescimento lento e por se tratar de organismo intracelular facultativo, os organismos do gênero Bartonella podem ser cultivados com sucesso em placas de agar contendo 5% de sangue desfibrinado, mantidas a 35°C, em câmaras com alta umidade e 5% de concentração de CO2 e incubadas por no mínimo quatro semanas (CHOMEL, BOULOOUIS & BREITSCHWERDT 2004, BREITSCHWERDT 2008).
Entretanto o isolamento primário pode ser difícil (ROLAIN et al. 2004), e as colônias bacterianas podem demorar até 56 dias para serem visíveis (BREITSCHWERDT 2008). Como gatos mantêm níveis de bacteremia altos, cultura de B. henselae ou B. clarridgeiae de amostras sanguíneas felinas são passíveis de sucesso ao contrário de tentativas de isolamento de B. henselae de amostras sanguíneas de cães ou de humanos (BREITSCHWERDT 2008).
A presença de Bartonella spp. no sangue ou tecidos indica infecção corrente, sendo consenso geral que a cultura é o melhor método para comprovação da infecção (CHOMEL et al. 1995, BRUNT et al. 2006). Entretanto, a técnica apresenta limitações que incluem as dificuldades na sua realização, a ocorrência de bacteremia felina intermitente (CHOMEL et al. 1995), a necessidade de laboratórios especializados e o tempo necessário para o retorno dos resultados em função do crescimento lento dos organismos (BRUNT et al. 2006).