Acompanhamento do cultivo de A platensis

O volume das amostras diárias retiradas para o acompanhamento celular foram de 50 mL. Após a remoção da amostra, igual volume de meio de cultura, isento da fonte de nitrogênio, foi adicionado para manter o volume constante. Similarmente, a evaporação de água diária foi compensada pela adição do meio de cultura.

4.3.2.1 Determinação da concentração celular

4.3.2.1.1 Densidade ótica

O acompanhamento do crescimento celular foi realizado diariamente, em duplicata, por turbidimetria, a 560 nm (LEDUY; THERIEN, 1977). Os valores de transmitância obtidos no espectrofotômetro foram convertidas em concentração celular através de uma curva de calibração (Item 4.3.2.1.2)

4.3.2.1.2 Construção da curva de calibração

A curva de calibração foi obtida tomando-se um volume de 25 mL de uma suspensão concentrada, de células em fase de crescimento exponencial, que foi

filtrada e lavada, com água destilada, em uma membrana de acetato de celulose de 1,β m, previamente seca a 70 ºC por 1β horas, e previamente pesada. A amostra foi levada à estufa a 100–105 ºC por um período de 5 horas, suficiente para que mantivesse uma massa constante. A massa das células foi calculada por diferença dos valores das massas das membranas antes e depois da filtração, e dividido pelo volume filtrado para obter-se a concentração celular na suspensão. A partir desta mesma suspensão, foram preparadas diferentes diluições, e alíquotas dessas diluições foram levadas ao espectrofotômetro para leitura da transmitância a 560 nm de comprimento de onda e caminho óptico de 1 cm, com água destilada como branco. Dessa forma, foi obtida uma curva que relaciona concentração celular com o logaritmo da transmitância (Gráfico 1).

Gráfico 1. Curva de calibração para determinação da concentração celular de A.

platensis

4.3.2.2 Determinação da concentração de carbonato total

Embora a concentração de carbonato total deva se manter constante em decorrência do fornecimento de CO2 para a manutenção do pH, foi acompanhado na fase líquida do meio em cultivo.

No meio isento de células, o acompanhamento da concentração de fonte de carbono, na forma de carbonato total, foi através de titulometria. Inicialmente, adiciona-se hidróxido de sódio na amostra (Reação 7) e titula-se com HCl (Reação 8) na presença do indicador fenolftaleína para a conversão de carbonato em bicarbonato. Posteriormente foi titulada novamente com HCl (Reação 9) na

presença do indicador alaranjado de metila para que todo o bicarbonato transforme- se em ácido carbônico, por deslocamento de equilíbrio. O carbonato total foi quantificado pelos dois intervalos de viragem (PIERCE; HAENISCH, 1948).

NaOH + NaHCO3 = Na2CO3 + H2O (Reação 7) Na2CO3 + HCl = NaHCO3 + NaCl (Reação 8) NaHCO3 + 1 HCl = H2CO3 + 1 NaCl (Reação 9)

4.3.2.3 Determinação da concentração de amônia total.

A amônia total foi quantificada no meio isento de células de 2 em 2 dias em potenciômetro marca ORION, modelo 710-A, por meio de um eletrodo seletivo para amônia, modelo 95-12 ORION. Tendo em vista que o eletrodo só é sensível ao íon amônia, e que no pH de cultivo existe equilíbrio entre os íons amônia e amônio, para se fazer a leitura, foi necessário corrigir o pH da amostra para 13 pela adição de NaOH 1,5 M antes da leitura no eletrodo, de forma que todo íon amônio fosse convertido em amônia (LEDUY; SAMSON, 1982). O volume utilizado foi de 15 mL e nesse procedimento foi necessária à calibração do aparelho em todos os dias em que foram realizadas as determinações. Isso foi feito através da construção de uma curva que correlaciona a milivoltagem lida no potenciômetro com soluções de NH4Cl, em diferentes diluições, com concentrações conhecidas. A partir da equação dessa curva, com a milivoltagem lida na amostra do cultivo, foi calculada a concentração de amônia total. Esta metodologia também serviu para auxiliar na determinação da concentração de uréia, conforme se observa no item a seguir.

4.3.2.3.1 Construção da curva de calibração para determinação da amônia A metodologia empregada para a determinação de amônia requer a construção de uma curva de calibração para cada dia em que foi analisada a amônia. Desta forma, no Gráfico 2, têm-se uma das curvas de calibração utilizada.

Gráfico 2. Curva de calibração para determinação da concentração de amônia

Nesse caso, a curva de calibração corresponde à Log [NH3]: -0,0213 x mV – 1,0583. A maior diluição da concentração de amônia foi de 5x10-6 (cujo o valor de Log é -5,3) que corresponde a um valor de milivoltagem de 182 detectado no eletrodo de amônia.

4.3.2.4 Determinação da concentração de uréia

Para a determinação da concentração de uréia, inicialmente foi hidrolisada em meio ácido, como segue: 10 mL do meio de cultivo isento de células foi submetido a um tratamento com H2SO4 (1 mL de H2SO4 5 N), a 200 ºC, por 6 horas, em bloco digestor Tecnal, modelo TE-106 (CEZARE, 1998). Após esse tempo, o conteúdo presente no tubo onde ocorreu a hidrólise ácida foi quantitativamente transferido para um balão volumétrico de 50 mL, com neutralização do pH com NaOH 1,5 M, utilizando fenolftaleína como indicador, e finalmente o volume completado com água destilada. Desse balão foi retirado um volume de 15 mL para a determinação da concentração de amônia, conforme método descrito no item anterior. Considerando ainda a diluição da amostra, calcula-se a concentração de amônia global, que representa a amônia que já estava presente no meio de cultivo, mais a amônia proveniente da hidrólise da uréia. Assim, por diferença, é possível calcular a concentração de uréia no meio de cultivo.

4.3.2.5 Determinação do pH.

O pH foi acompanhado por potenciometria, com um aparelho da marca METTLER TOLEDO.

4.3.2.6 Determinação de nitrato

A análise de nitrato foi realizada através da adaptação do método descrito por Vogel (2002). Foram pipetados 10 mL do meio isento de células, 10 ml de NaOH (0,5 N) e 700 mg de liga de devarda ( 50% de cobre, 45% de alumínio, 5% zinco) em balão volumétrico onde foi aquecido em bico de busen durante 1 hora para que todo o nitrato presente na amostra seja reduzido a amônio, como descrito na reação a seguir:

NO3- + 8 Al + 5 OH- + 2 H2O → 8 Al2- + 3 NH3 (Reação 10)

Durante o aquecimento, os íons amônio são desprendidos e recolhidos em uma solução padronizada de 10 mL de ácido clorídrico (0,1 N) formando o cloreto de amônio. Essa solução foi titulada com NaOH (0,05 N) padronizada, usando vermelho de metila como indicador, e a quantificação do amônio formado foi feita por diferença entre a quantidade de HCl inicial e final, depois da destilação. A conversão de volume do ácido tilulado (mililitros) em massa de íons nitrato (gramas) foi baseada na informação de que 1 mL de ácido clorídrico 1 N corresponde a 0,06201g de íons nitrato (VOGEL, 2002).

4.3.2.7 Determinação da concentração de etanol

A determinação do etanol foi realizada através do método de oxidação por dicromato de potássio proposto por Joslyn (1907) como descrito no item 4.3.1.4

4.3.3 Avaliação da biomassa de A. platensis obtida no final do cultivo.