Cultivo de A platensis

4.2.1 Micro-organismo e manutenção

Spirulina (Arthrospira) platensis UTEX (1926) foi mantida em meio líquido de

cultivo padrão para Arthrospira (item 4.2.2.1) em tubos hermeticamente fechados. 4.2.2 Meio de cultivo

Foram utilizados dois tipos de meio. Um meio padrão para o cultivo de

Arthrospira (SCHLÖSSER, 1982) – item 4.2.2.1, com NaNO3 como fonte de nitrogênio, que foi utilizado para duas finalidades: manutenção do micro-organismo e preparo do inóculo; um meio modificado (item 4.1.2.2), onde se utilizou uréia como fonte de nitrogênio.

4.2.2.1 Meio padrão para cultivo de A. platensis

O meio mineral padrão foi o de Schlösser (1982), cuja composição, por litro de água destilada, é a seguinte:

NaHCO3 13,61g Na2CO3 4,03g K2HPO4 0,50g NaNO3 2,50g K2SO4 1,00g NaCl 1,00g MgSO4.7H2O 0,20g CaCl2.2H2O 0,04g

*Solução de metal PIV 6mL

**Solução de micronutrientes Chu 1mL Vitamina B12 (15g/100mL H2O) 1mL *Solução de metal PIV (em 1 litro de água destilada):

Na2EDTA 750 mg FeCl3.6H2O 97 mg MnCl2.4H2O 41 mg ZnCl2 5 mg CoCl2.6H2O 2 mg Na2MoO4.2H2O 4 mg

**Solução de micronutrientes Chu (em 1 litro de água destilada): Na2EDTA 50 mg H3BO3 618 mg CuSO4.5H2O 19,6 mg ZnSO4.7H2O 44 mg CoCl2.6H2O 20 mg MnCl2·4H2O 12 mg Na2MoO4·2H2O 12 mg 4.2.2.2 Meio modificado

O meio de Schlösser (1982) foi utilizado com substituição do nitrato de sódio por uréia.

A massa diária de uréia adicionada por unidade de volume foi determinada de acordo com o experimento padrão utilizando nitrato de sódio como fonte de nitrogênio (descrito no item 5).

4.2.3 Preparo do inóculo

A A. platensis foi inoculada em 10 mL de meio líquido (em tubo de ensaio), em condições assépticas. Depois de 7 dias, esse material foi utilizado para inocular frascos de Erlenmeyer de 500 mL, com 200mL de meio de cultivo padrão (item 4.1.2.1), previamente esterilizado por autoclavação.

Os erlenmeyers após o repique foram imediatamente levados a agitador rotativo, a 100 min-1 _{(FERRAZ, 1986), temperatura de 30} O_{C e iluminância de 72} mol de fótons m-2 _s-1 _{(CARVALHO et al., 2004).}

O crescimento celular foi acompanhado, sendo utilizada para inóculo uma suspensão de A. platensis após de 6 a 8 dias de cultivo (PELIZER et al., 2003), em crescimento exponencial, isenta de contaminação. Nos cultivos utilizando meio mineral padrão, a suspensão foi filtrada, lavada e ressuspensa em meio de cultivo padrão. Nos cultivos utilizando uréia como fonte alternativa de nitrogênio, a suspensão foi filtrada, lavada com solução fisiológica para retirada do NaNO3 e ressuspensa em meio de cultivo padrão isento de NaNO3. Estas suspensões foram o inóculo para o cultivo no reator tubular, onde foram realizados os estudos empregando NaNO3 como fonte de nitrogênio padrão e a uréia como fonte

alternativa de nitrogênio, com o pH do cultivo controlado pela adição de CO2 proveniente de cilindro ou da fermentação alcoólica.

4.2.4 Dispositivo para cultura

4.2.4.1 Fotobiorreator tubular horizontal

O fotobiorreator tubular utilizado é apresentado na Figura 7. Este é constituído por 20 tubos de vidro transparentes (diâmetro interno de 1,0 cm) (CARLOZZI; PINZANI, 2005), com inclinação de 2% (1,15º) (TREDICI; ZITTELLI, 1998) para facilitar o escoamento do líquido, interligados com mangueiras de PVC de mesmo diâmetro interno, de forma que o volume iluminado corresponde a 2,12 litros (60,6%). O volume total do sistema foi de 3,5 litros. A recirculação de líquido foi de 26 L h-1 _{para evitar a sedimentação da biomassa e melhorar a transferência de} massa.

Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular há um tubo na forma de Y que recebe ar proveniente de uma bomba, deslocando a suspensão celular para um frasco na parte superior, provido de agitação com um agitador magnético. Também na parte inferior do reator há uma conexão, no qual ocorre entrada de CO2 para manutenção de pH quando da abertura da válvula solenóide, controlada por um controlador de pH.

4.2.4.2. Fotobiorreator tubular espiralado

O fotobiorreator tubular espiralado utilizado é apresentado na Figura 8. Este é constituído por 5 conjuntos de tubos espiralados de vidro transparentes (diâmetro interno de 1,0 cm) (CARLOZZI; PINZANI, 2005) interligados com mangueiras de PVC de mesmo diâmetro interno. Cada conjunto é constituído por 3 tubos espiralados, logo o reator contém no total 15 tubos de vidros espiralados, de forma que o volume iluminado corresponde a 665 ml (60,6 %). O volume total do sistema foi de 1,1 litros. A recirculação de líquido foi de 26 L h-1 _{para evitar a sedimentação} da biomassa e melhorar a transferência de massa.

Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular há um tubo na forma de Y que recebe ar proveniente de uma bomba, deslocando a suspensão celular para um frasco na parte superior. Também na parte inferior do reator há uma conexão, no qual ocorre entrada de CO2 para manutenção de pH.

Figura 8. Fotobiorreator tubular espiralado utilizado no cultivo de A. platensis

4.2.5 Descrição de um experimento típico de cultivo da A. platensis

A suspensão de Arthrospira (item 4.3) foi adicionada ao biorreator tubular, na concentração inicial de 400 mg L-1 (SOLETTO et al., 2008) e o volume de trabalho foi de 3,5 L no fotobiorreator tubular horizontal e de 1,1 L no fotobiorreator tubular espiralado. Devido a evaporação e a retirada de amostras, o meio de cultura isento da fonte de nitrogênio foi adicionado para manter o volume constante.

Nos experimetos, utilizando NaNO3 como fonte de nitrogênio, a concentração inicial deste foi de 2,5 g L-1 _{e ocorreram adições do nitrato de sódio de modo que sua} concentração não fosse inferior a 1 g L-1 (FAINTUCH, 1989), desta forma evitaria a limitação do crescimento celular pela fonte de nitrogênio. No cultivo utilizando a fonte de nitrogênio alternativa (uréia), a adição diária foi efetuada por pulsos (adição intermitente) (SÁNCHEZ-LUNA et al., 2004). As intensidades luminosas foram medidas com um sensor quantum (model LI-190 SB, Li-Cor, Lincoln, Neb., USA). As diferentes fontes de nitrogênio e intensidades luminosas foram pré-estabelecida de acordo com o plano de trabalho (Item 5).

O valor de pH nos cultivos foi mantido em 9,5 ± 0,2 (SANCHEZ-LUNA et al., 2007; TREDICI; ZITTELLI, 1998), com auxílio de um aparelho controlador de pH METTLER TOLEDO acoplado a uma válvula solenóide. Nos ensaios com CO2 puro (99,9%), a valvula solenoíde estava ligada a um cilindro de CO2 e nos ensaios com CO2 proveniente de fermentação alcoólica, a válvula solenóide foi ligada à tubulação proveniente de um reator operando com processo contínuo de fermentação alcoólica em regime permanente.

A temperatura de 29 ± 1ºC (SÁNCHEZ-LUNA et al., 2007) foi mantida por ar condicionado que climatizou a temperatura da sala onde está localizada o reator.

No final do experimento, o reator foi lavado com solução de hipoclorito de sódio 5% por 16 h, e com uma solução de tiosulfato de sódio (Na2S2O3) 50 mM para neutralizar o clorito residual de acordo com De Beer et al. (1994).