4.11.1 Matriz extracelular
A adesão de patógenos aos tecidos do hospedeiro é o evento inicial crítico na patogênese da maioria das infecções. Componentes específicos dos micro-organismos, chamados de adesinas, medeiam a adesão aos tecidos por meio de interações com moléculas do hospedeiro (LJUNGH; MORAN; WADSTROM, 1996).
A matriz extracelular (ECM) é um tecido biologicamente ativo composto por uma mistura complexa de macromoléculas, podendo servir não apenas como substrato para a adesão das células do hospedeiro, mais também para interação com micro-organismos patogênicos (PATTI et al., 1994). Muitos micro-organismos expressam adesinas em suas superfícies celulares que participam da ligação à matriz extracelular dos tecidos do hospedeiro.
A ligação das leptospiras às células do hospedeiro e a componentes da matriz extracelular é necessária para que a bactéria consiga penetrar, disseminar-se e persistir nos tecidos.
Nosso grupo descreveu a primeira proteína de leptospira que se liga à laminina, chamada de Lsa24 (BARBOSA et al., 2006), e então muitas outras adesinas de leptospira também foram descritas e caracterizadas, como as proteínas LigA e LigB (CHOY et al., 2007), proteínas da família Len (STEVENSON et al., 2007), Lsa21 (ATZINGEN et al., 2008), LipL32 (HOKE et al., 2008) Lp95 (ATZINGEN et al., 2009), TlyC (CARVALHO et al., 2009), LipL53 (OLIVEIRA et al., 2010), OmpL37 (PINNE; CHOY; HAAKE, 2010), Lsa63 (VIEIRA et al., 2010b), Lsa66 (OLIVEIRA et al, 2011), Lsa20 (MENDES et al, 2011), Lsa33 (DOMINGOS et al., 2012) e Lsa30 (SOUZA et al., 2012).
Portanto, as proteínas recombinantes foram avaliadas quanto à sua capacidade de interação com componentes da matriz extracelular. Como controle de ausência de interação, foram empregados gelatina, BSA e fetuína (componente altamente glicosilado). Pode-se observar na Figura 28 que todos os controles apresentaram baixos valores de absorbância.
A proteína OmpL1 mostrou interação significativa com laminina, fibronectina plasmática e ECM (mistura comercial de componentes da matriz extracelular). Já as proteínas rLIC10731 e rLIC10645 mostraram interação significativa com laminina e ECM.
Figura 28 - Estudo de adesão das proteínas recombinantes a componentes da matriz extracelular.
Laminina, colágeno tipo I e IV, fibronectina celular e plasmática, ECM gel, elastina e com os controles negativos gelatina, BSA e fetuína (1 µg) foram imobilizados em placas de ELISA. Então, 1 µg da proteína recombinante foi adicionado por poço e as placas foram incubadas por 2 h a 37 oC. A detecção da ligação foi feita através da incubação com antissoro anti- proteína recombinante (1:1600 para anti-OmpL1 e 1:800 para anti-rLIC10731 e rLIC10645), seguida de incubação com anti-IgG de camundongo (1:5.000). Os dados representam o valor da média ± desvio padrão de uma triplicata, e são representativos de três experimentos independentes. Para análise estatística, a ligação das proteína a cada componente foi comparada aos controles negativos, embora o p-valor apresentado neste gráfico se refira à comparação com a gelatina, pelo teste t-Student (*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001).
A adesão das proteínas recombinantes aos componentes da matriz extracelular foi confirmada por meio da utilização de anticorpo monoclonal anti-His, que reconhece especificamente as proteínas recombinantes (Figura 29).
Figura 29 - Confirmação da adesão das proteínas recombinantes a componentes da matriz extracelular pela utilização de anticorpo anti-his.
Os componentes de matriz extracelular (1 µg) com os quais se desejava corroborar a adesão às proteínas recombinantes foram imobilizados em placas de ELISA. Então, 1 µg da proteína recombinante foi adicionado por poço e as placas foram incubadas por 2 h a 37 oC. A detecção da ligação foi feita através da incubação com anticorpo monoclonal anti-his conjugado com peroxidase (1:400 para OmpL1 e 1:20.000 para anti-rLIC10731 e 1:8.000 para LIC10645). Os dados representam o valor da média ± desvio padrão de uma triplicata, e são representativos de dois experimentos independentes. Para análise estatística, a ligação das proteína a cada componente foi comparada com a gelatina, pelo teste t-Student (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 e ****p<0,0001).
4.11.2 Componentes do soro
Embora a resistência ao soro apresentada por cepas patogênicas de Leptospira spp. tenha sido descrita há muitas décadas, os mecanismos subjacentes a esta resistência começaram a ser elucidados recentemente. Alguns patógenos desenvolveram estratégias sofisticadas para superar o sistema de defesa imune de vários hospedeiros, sobretudo mecanismos para escapar da ativação e/ou ataque lítico do complemento (BARBOSA et al., 2010; MERI et al., 2005; VERMA et al., 2006). Entre estes mecanismos, pode ser citada a aquisição de reguladores solúveis do complemento, como Fator H e C4bp (C4 binding protein).
Verma et al. (2006) demonstraram que as leptospiras patogênicas se ligam ao regulador de complemento fator H, e identificaram a proteína LfhA, também chamada de LenA, como um dos receptores. A proteína LenB também foi demonstrada como sendo um receptor de fator H (STEVENSON et al., 2007).
Barbosa et al. (2009) demonstraram a interação das leptospiras ao regulador da via clássica do complemento, o C4bp. Desde então, foram identificados alguns ligantes deste componente na superfície das bactérias, como a LcpA (BARBOSA et al., 2010) e as proteínas Lig (CASTIBLANCO-VALENCIA et al., 2012). Nosso grupo também identificou as proteínas Lsa33 (DOMINGOS et al., 2012) e Lsa30 (SOUZA et al., 2012) como receptores para C4bp.
A atividade proteolítica adquirida pela subversão de proteases por patógenos, como a plasmina, demonstrou ser um importante mecanismo de patogênese em várias infecções. A plasmina é uma serino-protease do sistema fibrinolítico que tem o zimógeno (proenzima) plasminogênio como seu principal componente (COLEMAN; BENACH, 1999).
Nosso grupo demonstrou a capacidade de L. interrogans em se ligar ao plasminogênio (VIEIRA et al., 2009), e que esta interação se dá por meio de múltiplos ligantes (VIEIRA et al., 2010a).
O fibrinogênio é uma glicoproteína plasmática de 340 kDa composta por cadeias α, e ligadas por β9 pontes dissulfeto (DOOLITTLE, 1984; RIVERA et al., 2007; WEISEL, 2005). As leptospiras se ligam ao fibrinogênio (CHOY et al., 2007; PINNE; CHOY; HAAKE, 2010) e alguns receptores já foram identificados (CHOY et al., 2007; PINNE; CHOY; HAAKE, 2010).
Assim sendo, a ligação das proteínas recombinantes a componentes do soro também foi avaliada. Todas elas mostraram ligação significativa ao plasminogênio e adicionalmente, a proteína OmpL1 também se ligou ao fibrinogênio (Figura 30). Todos os controles negativos apresentaram baixos valores de absorbância.
Assim como para os componentes da matriz extracelular, a adesão das proteínas recombinantes aos componentes do soro foi corroborada por meio da utilização do anticorpo monoclonal anti-His (Figura 31).
Figura 30 - Estudo de adesão das proteínas recombinantes a componentes do soro.
Plasminogênio, fibrinogênio, fator H, complemento, C4bp e os controles negativos gelatina, BSA e fetuína (1 µg) foram imobilizados em placas de ELISA. Então, 1 µg da proteína recombinante foi adicionado por poço e as placas foram incubadas por 2 h a 37 oC. A detecção da ligação foi feita através da incubação com antissoro anti-proteína recombinante (1:1600 para anti-OmpL1 e 1:800 para anti-rLIC10731 e LIC10645), seguida de incubação com anti-IgG de camundongo (1:5.000). Os dados representam o valor da média ± desvio padrão de uma triplicata, e são representativos de três experimentos independentes. Para análise estatística, a ligação das proteína a cada componente foi comparada aos controles negativos, embora o p-valor apresentado neste gráfico se refira à comparação com a gelatina, pelo teste t-Student (**p<0,01, ***p<0,001 e ****p<0,0001).
Figura 31 - Confirmação da adesão das proteínas recombinantes a componentes do soro pela utilização de anticorpo anti-his.
Os componentes de soro (1 µg) com os quais se desejava corroborar a adesão às proteínas recombinantes foram imobilizados em placas de ELISA. Então, 1 µg da proteína recombinante foi adicionado por poço e as placas foram incubadas por 2 h a 37 oC. A detecção da ligação foi feita através da incubação com anticorpo monoclonal anti-his conjugado com peroxidase (1:400 para OmpL1 e 1:20.000 para anti-rLIC10731 e 1:8.000 para LIC10645). Os dados representam o valor da média ± desvio padrão de uma triplicata, e são representativos de dois experimentos independentes. Para análise estatística, a ligação das proteína a cada componente foi comparada com a gelatina, pelo teste t-Student (**p<0,01 e ***p<0,001).
4.12 Efeito dos anticorpos e desnaturação térmica na ligação das proteínas