Alinhamento de sequências e modelagem molecular por homologia

A busca, no BLASTp, revelou algumas seqüências que apresentaram identidade com a quitinase CHI3316. No alinhamento, as sequências exibiram regiões altamente conservadas entre todas quitinases, nas quais três regiões são importantes (Figura 2). A primeira região com a sequência 253GGXXX257 está relacionada com o sítio de ligação (PERRAKIS et al., 1994); a segunda região com a sequência 310DXDXE314 funciona como centro catalítico das quitinases da família 18 (VAAJE-KOLSTAD et al., 2004) e a terceira com a sequência 395MSYD398 está envolvida na hidrólise do substrato (SYNSTAD et al., 2004).

Para resolução da estrutura da quitinase (CHI3316) por meio de modelagem molecular por homologia, a sequência que apresentou maior identidade (30%) com a seqüência da quitinase de C. violaceum (CHI3316) foi o domínio catalítico da quitinase A de B. circulans WL-12, portanto utilizado como modelo. Identidade de 30% é a condição mínima para usar uma estrutura como molde, para sua resolução por modelagem molecular por homologia.

A sobreposição de modelos, observados na figura 3, evidenciou o domínio catalítico conservado das quitinases da família 18 das glicosil hidrolases. Esse domínio catalítico é caracterizado por apresentar uma estrutura em barril TIM (Įȕ com um resíduo conservado de glutamato que atua, possivelmente, como um ácido durante a catálise (WATANABE et al., 1993; HSIEH et al., 2010). Alças presentes no modelo da quitinase CHI3316, que não se sobrepõem ao molde, são resíduos de aminoácidos que apresentam baixa identidade com o molde, nessas regiões.

O sítio ativo, localizado no domínio catalítico, das quitinases da família 18 das glicosil hidrolases é caracterizado pela presença de um motivo conservado, constituído por nove resíduos de aminoácidos, que são [LIVMFY]-[DN]-G-[LIVMF]- [DN]-[LIMVF]-[DN]-X-E (HENRISSAT e BAIROCH,1993; GAN et al., 2007; LIU et al. 2008; WANG e YANG, 2009; Figura 4). As diferenças observadas nos sítios ativos

do molde e da CHI3316 são as substituições 169leucina por 311isoleucina e 171_{triptofano por} 313_{fenilalanina, respectivamente (Figura 4).}

O melhor modelo, dentre os 100 modelos gerados pelo programa Modeller, foi escolhido com base na qualidade do gráfico de Ramachandran e função energética fornecidos pelo programa Procheck. A quitinase (CHI3316) exibiu 89,8% de seus resíduos nas regiões mais favoráveis, 9,1% nas regiões adicionalmente permitidas, 0,3% nas regiões geralmente permitidas e 0,8% nas regiões não permitidas (Figura 5 e Tabela 1). Na quitinase CHI3316, existem 50 resíduos de glicina e esses resíduos foram observados em várias regiões do gráfico de Ramachandran, isso demonstrou que esse aminoácido é bem menos impedido estericamente, portanto exibe uma faixa muito maior de conformações permitidas. Já em relação à prolina, existem 23 resíduos e esse aminoácido foi bem menos visualizado nas regiões do gráfico, isso se deve à sua cadeia lateral cíclica, que torna as conformações desse resíduo bastante restritas, a faixa -35 e -85 de graus ĭ (NELSON e COX, 2002; Figura 5 e Tabela 1). O modelo um foi o que apresentou a menor energia dentre os 100 modelos gerados pelo programa Procheck (Figura 6).

O alinhamento de sequências de aminoácidos, os modelos do domínio catalítico e sítio ativo gerados pelos programas CLC sequence Viewer e Modeller, respectivamente, fornecidos para a sequência de aminoácidos predita a partir da ORF cv3316 permitiram classificar essa proteína putativa como uma quitinase pertencente à família 18 das glicosil hidrolases, por causa do domínio catalítico em barril TIM (Į8ȕ8), presença de nove resíduos conservados no sítio ativo e regiões altamente conservadas envolvidas com o sítio de ligação ao substrato, centro catalítico e hidrólise do substrato.

FIGURA 2 – Alinhamento da seqüência de aminoácidos predita de uma quitinase (CHI3316) de C. violaceum com sequências de quitinases que possuem estruturas tridimensionais resolvidas e

depositadas no PDB. A sequências de aminoácidos de proteínas com estruturas tridimensionais conhecidas foram obtidas no PDB: Quitinase A de Serratia marcescens ATCC 990 complexada com quitotrio-tiazolina (2WLY), Quitinase A de S. marcescens ATCC 990 complexada com ditioamida quitotrio-tiazolina (2WK2), Quitinase A Serratia marcescens (1CTN), Quitinase A de Vibrio harveyi (3B8S), Quitinase A de Vibrio harveyi complexada com hexassacarídeo (3B9A) e domínio catalítico da quitinase A de Bacillus circulans WL-12 (1ITX). O alinhamento das sequências foi gerado pelo programa CLC Sequence Viewer 6.4.

Figura 3 - Sobreposição de estruturas gerada no formato cartoon e visualizada pelo programa Pymol,

evidenciando a conservação de estruturas secundária e terciária do domínio catalítico (CaD) das quitinases da família 18 das glicosil hidrolases. Domínio catalítico da quitinase A1 de Bacillus

circulansWL-12 (1ITX – azul) foi utilizado como molde e o modelo gerado com base na seqüência de aminoácidos deduzida a partir da ORF cv3316 de C. violaceum ATCC 12472 (em verde). Os modelos e a sobreposição foram realizados, utilizando o programa Modeller 9v8 (modelagem por homologia). Importante notar que apenas as regiões próximas à seqüência bem conservada, que participa do sítio ativo, e compartilhada entre ambas as proteínas foram utilizadas no processo de modelagem.

Figura 4 – Sobreposição de estruturas gerada no formato ribbon e visualizada pelo programa Pymol,

evidenciando a seqüência de aminoácidos, ([LIVMFY]-[DN]-G-[LIVMF]-[DN]-[LIMVF]-[DN]-X-E) que é compartilhada entre os sítios ativos das quitinases pertencentes à família 18 das glicosil hidrolases. Os aminoácidos estão destacados nas cores: 1 – azul escuro, 2 – azul, 3 - ciano, 4 - verde, 5 – verde escuro, 6 – verde claro, 7 - amarelo, 8 - laranja e 9 - vermelho. No caso de 1ITX, esses aminoácidos são: FDGVDLDWE. Em azul está destacado o detalhe da estrutura do molde (1ITX). Em verde, está representado o modelo gerado com base na seqüência de aminoácidos deduzida a partir da ORF cv3316 de C. violaceum. O sítio de CHI3316 é constituído pelos aminoácidos: FDGVDIDFE. Os modelos e a sobreposição foram realizados, utilizando o programa Modeller 9v8 (modelagem por homologia).

FIGURA 5 – Gráfico de Ramachandran para quitinase (CHI3316) gerado pelo programa Procheck.

Regiões mais favoráveis [A, B, L], em vermelho. Regiões adicionalmente permitidas [a, b, l, p], em amarelo. Regiões geralmente permitidas [~a, ~b, ~l, ~p], em amarelo claro.

TABELA 1 - Dados do gráfico de Ramachandran para o melhor modelo da quitinase CHI3316 gerado

pelo programa Procheck.

FIGURA 6 – Gráfico da validação do modelo de menor energia da quitinase C. violaceum, CHI3316,

gerado pelo programa Procheck. A seta, em amarelo, indica o modelo de menor energia, ou seja, o melhor modelo é o número um.

7.2. Transformação de células de E.coli TOP10F’ com o plasmídeo

recombinante

A ORF cv3316 foi amplificada por PCR, a partir de DNA genômico extraído de células de C. violaceum ATCC12472. A confirmação da amplificação da ORF cv3316 foi visualizada em gel de agarose (1,0%), onde se observou um fragmento com aproximadamente 2435 pb, coerente com a extensão esperada para a amplificação da referida ORF (Figura 7). A sequência depositada no GeneBank referente à ORF cv3316 tem 2376 pb. No desenho dos iniciadores utilizados para a amplificação, sítios de restrição para as enzimas utilizadas na clonagem foram adicionados, além de nucleotídeos adjacentes, somando 59 pb à sequência original.

O DNA amplificado foi purificado da reação anterior e submetido à digestão com as enzimas de restrição EcoRI e XbaI, bem como o plasmídeo pPICZĮ$ 2V produtos da digestão foram purificados e, então, ligados por meio da enzima DNA T4 Ligase. O produto da ligação foi eletroporado em células eletrocompetentes de E. coli TOP10F’. Das colônias selecionadas, seis clones foram expandidos para extração de DNA plasmidial, visando a confirmação da transformação das células de E. coli. Após a extração de DNA plasmidial, os clones foram submetidos à análise de restrição (digestão) com as enzimas EcoRI e XbaI (Figura 8). A confirmação da transformação das células de E.coli com o plasmídeo recombinante (pPICZĮ$- CV3316) foi observada em três clones. Dois desses clones exibiram três bandas distintas: uma referente ao plasmídeo recombinante não digerido (6035 pb), uma segunda referente ao plasmídeo digerido (3600 pb) e a terceira correspondente à ORF cv3316, 2435 pb, (Figura 8, colunas 3 e 5). Enquanto, o terceiro clone transformado mostrou duas bandas, a primeira referente ao plasmídeo digerido (3600 pb) e a segunda correspondente à ORF cv3316, 2435 pb, (Figura 8, coluna 4). Outros dois clones dos seis, que foram digeridos, exibiram, somente, uma banda correspondente ao plasmídeo desprovido da ORF cv3316 (3600 pb), isso demonstrou que esses plasmídeos não foram transformados (Figura 8, colunas 2 e 6). Um clone não exibiu nenhuma banda, isso se deve baixa quantidade de plasmídeo utilizado na reação de digestão (Figura 8, coluna 7).

O resultado da digestão dos plasmídeos revelou que as células de E.coli TOP10F’ foram transformadas com o plasmídeo recombinante (pPICZĮD -CV3316) e esse vetor foi utilizado para transformar células de P. pastoris GS115 e KM71H.

FIGURA 7 - Eletroforese em gel de agarose (1,0%) da amplificação da ORF cv3316 de C. violaceum

por PCR a partir de DNA genômico extraído de células de C. violaceum. Coluna 1 - ORF 3316 de C.

violaceum(2435 pb); Coluna 2 - Marcador DNA de fago Ȝ digerido com Hind III (300 ng), em pares de

base (pb);

FIGURA 8 - Eletroforese em gel de agarose (0,8%) de produtos da digestão com as enzimas de

restrição EcoRI e XbaI do plasmídeo recombinante (S3,&=Į$-CV3316) purificado de células de E.

coliTOP10F’. Coluna 1: Marcador DNA de fago Ȝ digerido com Hind III (300 ng), em pares de base (pb); Colunas 2 - 7: Diferentes clones oriundos de células de E.coli transformadas com pPICZĮA- CV3316.

7.3. Transformação de células de P. pastoris GS115 e KM71H com o