Transformação de células de P pastoris GS115 e KM71H com o plasmídeo recombinante

Após a confirmação da transformação das células de E. coli TOP10F’, o plasmídeo recombinante (S3,&=Į$-CV3316) oriundo de um dos clone de células de E. coli (Figura 8, coluna 3) foi linearizado e eletroporado em células de P. pastoris GS115 e KM71H. A confirmação da transformação das células de P. pastoris foi realizada por PCR, que utilizou como molde DNA genômico extraído das células da levedura (Figura 9 e 10). Nove clones e três clones de P. pastoris GS115 e KM71H, respectivamente, tiveram a transformação com o inserto de quitinase confirmados. Os clones de GS115 exibiram um fragmento de aproximadamente de 2808 pb, coerente com a extensão esperada para a amplificação da ORF cv3316 (Figura 9). Esse valor de extensão da ORF cv3316 é devido à adição de 21 pb do oligonucleotídeo senso (AOX5’) e 352 pb referente à região do vetor, promotor da álcool oxidase 1, que foi amplificada com a utilização desse oligonucleotídeo iniciador (AOX5’). Os clones transformados de KM71H exibiram um fragmento de aproximadamente de 2624 pb, coerente com a extensão esperada para a amplificação da ORF cv3316 (Figura 10). Esse valor de extensão da ORF cv3316 é devido à adição de 21 pb do oligonucleotídeo anti-senso (AOX3’) e 168 pb referente à região do vetor, sequência de término da transcrição AOX1, que foi amplificada com a utilização desse oligonucleotídeo iniciador (AOX3’).

Após a confirmação da transformação das células P. pastoris GS115 e KM71H com plasmídeo recombinante (S3,&=Į$-CV3316) por PCR, essas estirpes desse microrganismo foram induzidas, com metanol 0,5% v/v, para expressar a quitinase recombinante (rCHI3316).

FIGURA 9 - Eletroforese em gel de agarose (1%) da amplificação da ORF cv3316 de C. violaceum

por PCR a partir de DNA genômico extraído de células de P. Pastoris GS115 transformadas com S3,&=Į$-CV3316 para expressão extracelular. Coluna 1: Marcador - DNA de fago Ȝ digerido com

HindIII (300 ng), em pares de base (pb); Coluna 2: controle negativo (água); Colunas 3 - 4: Clones 1 - 2 do pPICZĮA íntegro; Coluna 5 -14: Clones 3a – 3j de pPICZĮA – CV 3316; Coluna 15: Marcador - DNA de fago Ȝ digerido com BstE I (300 ng), em pares de base (pb). Nesta reação, os oligonucleotídeos iniciadores (AOX5’ e Xba3316) foram utilizados.

FIGURA 10 - Eletroforese em gel de agarose (1%) da amplificação da ORF cv3316 de C. violaceum

por PCR a partir de DNA genômico extraído de células de P. Pastoris KM71H transformadas com S3,&=Į$-CV3316 para expressão extracelular. Coluna 1: Marcador DNA de fago Ȝ digerido com Hind III (300 ng), em pares de base (pb); Coluna 2: controle negativo (água); Colunas 3: clones 1 do pPICZĮA íntegro; Coluna 4 - 9: Clones 3a – 3f do pPICZĮA – CV 3316; Coluna 10:DNA de fago ĭX 174 digerido Hae III (300 ng), em pares de base (pb). Nesta reação, oligonucleotídeos iniciadores (Eco3316 e AOX3’) foram utilizados.

7.4. Indução da Expressão da rCHI3316 em Pichia pastoris GS115 e

KM71H

Uma das metodologias utilizadas para avaliar a expressão da quitinase recombinante foi o acompanhamento da leitura da OD600 dos dez clones (2a-2j, Figura 9) oriundos de células de P. pastoris GS115 e 6 clones (2a-2f, Figura 10) de P. pastoris KM71H , transformadas com o plasmídeo recombinante (pPICZĮ$ - CV3316). Esse experimento foi realizado com intuito de observar crescimento celular desses clones, após a adição de metanol 0,5% (v/v), duas vezes por dia, durante o período de cultivo celular (Figuras 11). Estas células também foram transformadas com plasmídeo não portando o gene de interesse, como controle. Sete clones de células de P. pastoris GS115 e todos os transformantes de células de P. pastoris KM71H apresentaram diferentes velocidades de crescimento celular, durante todo o período de cultivo (Figuras 11).

Os setes clones de células de P. pastoris GS115, induzidos por metanol 0,5% (v/v), expressaram de forma satisfatória a quitinase recombinante (rCHI3316) com massa molecular estimada de 87 kDa a partir das 24 horas até 144 horas (Figuras 12 e 13). Os transformantes da estirpe KM71H também apresentaram uma banda intensa de mesma massa a partir das 48 horas até 144 horas (Figuras 14 e 15). Essa banda protéica foi mais intensa às 96 horas, quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) sob condições desnaturantes (SDS-PAGE) revelado com nitrato de prata (Figuras 12, 13, 14 e 15). Essa massa molecular é devido à sequência predita da proteína (84,5 kDa), acrescida das caudas his-tag e epítopo c- myc presentes no C-terminal da proteína. Essas duas caudas codificam produtos cujas massas moleculares representam juntas 2,5 KDa, estando presentes no plasmídeo pPICZĮ$H Vendo importantes no reconhecimento da proteína. A cauda de histidina é importante no isolamento da proteína recombinante por cromatografia de afinidade a níquel imobilizado, enquanto que o epítopo c-myc permite a detecção da proteína de fusão com anticorpo anti-myc (Invitrogen, Manual K1740-01).

O padrão de expressão de quitinases dos fungos (Chaetomiun cupreum e Beauveria bassiana), em células de P. pastoris GS115, também foi acompanhado por meio de SDS-PAGE, sob condições desnaturantes, onde as proteínas (58 kDa e 38 kDa) exibiram uma banda difusa a partir de 120 e 48 horas, respectivamente,

após indução com metanol 0,5% (v/v) e após esses tempos a intensidade de cada banda protéica diminuiu (FAN et al., 2007; WANG e YANG, 2009).

Liu et al. (2010) expressaram uma quitinase do vegetal Limonium bicolor (Lbchi31) em células de P. pastoris GS115 e KM71. Esta proteína apresentou massa molecular de 31 kDa com uma banda intensa a partir das 96 horas para estirpe GS115 e 72 horas para KM71.

Quanto à dosagem de proteínas totais, os clones da estirpe GS115 e pP,&=Į$desprovido do gene de interesse (controle) apresentaram variação durante todo o período de coleta (0 h-144 h). O clone 2c foi o que se manteve mais constante, ou seja, apresentou uma menor variação, durante a etapa de coleta. Com uma produção máxima de proteínas totais no horário de 96 horas (0,326 mg), uma queda da síntese de proteínas às 120 horas e um novo aumento da produção protéica partir das 144 horas (0,286 mg, Figura 16A). O clone 2i apresentou a maior produção de proteínas totais (0,479 mg) da estirpe GS115 registrada às 144 horas (Figura 16A). De modo semelhante, todos os clones e o controle da estirpe KM71H apresentaram uma variação da produção de proteínas totais durante todo o período de coleta (0 h-144 h). O clone 2b foi o mais promissor e constante desta cepa com uma produção máxima de proteínas totais (0,367 mg) registrada às 48 horas (Figura 16B).

A variação de proteínas totais para as duas estirpes pode ser explicada pela proteólise dessas proteínas, pois muitos peptídeos e proteínas são susceptíveis à degradação por proteases produzidas pelo organismo hospedeiro (sistema de expressão). A proteólise ocorre durante a expressão e/ou os primeiros estágios da purificação da proteína recombinante. Nesta dissertação, utilizou-se sistema de expressão, que possui a capacidade de secretar a quitinase recombinante para o meio de cultura, além de cepas não deficientes nessas proteases (GS115 e KM71H). Algumas proteínas heterólogas produzidas e secretadas por P. pastoris, no meio de cultura, são instáveis, pois são alvos de proteases vacuolares, tais como proteinases A e B, e carboxipeptidase Y, particularmente, quando cultivadas em fermentador por causa do ambiente de alta densidade celular em combinação com a lise de um pequeno percentual de células (HIGGINS e CREGG, 1998). Conseqüentemente, a produção de muitas proteínas, particularmente, proteínas expressas de forma heteróloga, depende da atividade proteolítica que elas são expostas durante a expressão e purificação, e o uso de cepas deficientes em

proteases (SMD1163, SMD1165 e SMD168) pode significantemente melhorar o rendimento total (HIGGINS e CREGG, 1998). Outra hipótese levantada para variação de proteínas seria que as mesmas foram degradadas por proteases extracelulares, que possuem atividade proteolítica ótima em pH neutro, uma vez que o meio BMMY utilizado para o cultivo das células de P. pastoris GS115 E KM71H tinha pH 6,0. Um modo de resolver esse problema seria o cultivo de células de P. pastoris em meio mínimo contendo metanol e/ou histidina (MMH) não tamponado, onde o pH diminui para 3 ou menos, inativando as proteases neutras (BRIERLEY et al., 1994).

FIGURA 11 - Crescimento celular de P. pastoris (GS115 e KM71H) após indução com metanol 0,5%

(v/v) em relação ao tempo (h). (A) Clones oriundos de células P. pastoris (GS115) transformadas com S3,&=Į$-CV3316. (B) Clones oriundos de células P. pastoris .0+WUDQVIRUPDGDVFRPS3,&=Į$- CV3316.

A

B

Crescimento Celular

0 24 48 72 96 120 144 0 5 10 15 20 25 pPICZDA Íntegro 2a 2b 2c 2f 2g 2i 2j

Tempo (h)

O

D

6

00

n

m

Crescimento Celular

0 24 48 72 96 120 144 0 5 10 15 20 25 pPICZDA Íntegro 2a 2b 2c 2d 2f

Tempo (h)

O

D

6

00

n

m

FIGURA 12 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%), revelado com nitrato de prata, em

condições desnaturantes (SDS-PAGE) das proteínas totais extraídas a partir da cultura de Pichia

pastoris GS115. (S3,&=Į$íntegro) Expressão extracelular do pPICZĮ$íntegro.Coluna M : Marcador;

Coluna 1 – 7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 KȝJ2a) Expressão extracelular do clone 2a oriundo de células de P. pastoris WUDQVIRUPDGDV FRP S3,&=Į$-CV3316. Coluna M: Marcador; Coluna 1-7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 KȝJ (2b) Expressão extracelular do clone 2b oriundo de células de P. pastoris transformadas com S3,&=Į$-CV3316. Coluna M: Marcador; Coluna 1-7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 h (3, ȝJ 2c) Expressão extracelular do clone 2c oriundo de células de P. pastoris WUDQVIRUPDGDVFRPS3,&=Į$-CV3316. Coluna M: Marcador; Coluna 1-7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 KȝJ

FIGURA 13 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%), revelado com nitrato de prata, em

condições desnaturantes (SDS-PAGE) das proteínas totais extraídas a partir da cultura de Pichia

pastoris GS115. (2f) Expressão extracelular do clone 2f oriundo de células de P. pastoris transformadas FRPS3,&=Į$-CV3316.Coluna M: Marcador; Coluna 1 – 7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 KȝJ2g) Expressão extracelular do clone 2g oriundo de células de P. pastoris WUDQVIRUPDGDV FRP S3,&=Į$-CV3316. Coluna M: Marcador; Coluna 1-7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 K  ȝJ 2i) Expressão extracelular do clone 2i oriundo de células de P. pastoris WUDQVIRUPDGDVFRPS3,&=Į$-CV3316. Coluna M: Marcador; Coluna 1-7: período de coleta 0 h, 24 h, 48h, 72h, 96h, 120h e 144 KȝJ2j) Expressão extracelular do clone 2j oriundo de células de P. pastoris WUDQVIRUPDGDVFRPS3,&=Į$-CV3316. Coluna M: Marcador; Coluna 1-7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 KȝJ

FIGURA 14 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%), revelado com nitrato de prata, em

condições desnaturantes (SDS-PAGE) das proteínas totais extraídas a partir da cultura de Pichia

pastoris KM71H. (S3,&=Į$íntegro ) Expressão extracelular do pPICZĮ$ íntegro.Coluna M: Marcador; Coluna 1 – 7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 KȝJ2a) Expressão extracelular do clone 2a oriundo de células de P. pastoris WUDQVIRUPDGDVFRPS3,&=Į$- CV3316. Coluna M: Marcador; Coluna 1-7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 h ȝJ2b) Expressão extracelular do clone 2b oriundo de células de P. pastoris transformadas com S3,&=Į$-CV3316. Coluna M: Marcador; Coluna 1-7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 K ȝJ 2c) Expressão extracelular do clone 2c oriundo de células de P. pastoris WUDQVIRUPDGDVFRPS3,&=Į$-CV3316. Coluna M: Marcador; Coluna 1-7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 KȝJ

FIGURA 15 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%), revelado com nitrato de prata, em

condições desnaturantes (SDS-PAGE) das proteínas totais extraídas a partir da cultura de Pichia

pastoris KM71H. (2d) Expressão extracelular do clone 2d oriundo de células de P. pastoris

WUDQVIRUPDGDVFRPS3,&=Į$-CV3316.Coluna M:Marcador; Coluna 1 – 7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 KȝJ2e) Expressão extracelular do clone 2e oriundo de células de

P. pastoris WUDQVIRUPDGDVFRPS3,&=Į$-CV3316. Coluna M: Marcador; Coluna 1-7: período de coleta

0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 KȝJ2f) Expressão extracelular do clone 2f oriundo de células de P. pastoris WUDQVIRUPDGDV FRP S3,&=Į$-CV3316. Coluna M: Marcador; Coluna 1-7: período de coleta 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 KȝJ

FIGURA 16 - Proteínas totais solúveis secretadas por P. pastoris no meio de cultura em relação ao

tempo (h). (A) Clones oriundos de células de P. pastoris (GS115) transformadas com S3,&=Į$- CV3316. (B) Clones oriundos de células de P. pastoris .0+ WUDQVIRUPDGDV FRP S3,&=Į$- CV3316.

A

B

No documento Expressão de uma quitinase de Violaceum em Pichia Pastoris: purificação e caracterização parcial da proteína recombinante. (páginas 63-73)