Amostra

1.1. Critérios de Inclusão

Este trabalho consistiu num estudo retrospetivo, baseado nos registos clínicos de 14 das éguas presentes à reprodução no PR-HDLG, situado em Boulogne-sur-Gesse, Toulouse, França, de Fevereiro de 2014 a Julho de 2016, de um total de 43 éguas observadas. De entre os animais com acompanhamento prolongado, foram selecionados os 7 animais mais jovens e os 7 animais mais velhos. As fichas clínicas foram revistas para identificar os animais que se encontram dentro de intervalos de idade específicas. Os animais admitidos no PR-HDLG, seriam na sua maioria propriedade do HDLG, mas também eram admitidos animais de clientes. Os dados clínicos, gentilmente cedidos pelo HGLG, foram recolhidos e registados sob supervisão da médica veterinária responsável pelo PR-HDLG e analisados retrospetivamente.

1.2. Caracterização da Amostra

Dos 14 equinos que compunham a amostra deste estudo, 8 eram da raça PSL (57,14%), 3 eram da raça PSI (21,43%), e os restantes 3 animais eram da raça PSA (7,14%), Oldenburg (7,14%) e AA (7,14%). Estes animais foram divididos em dois grupos, sendo cada grupo constituído por 7 éguas. O Grupo 1 era constituído por éguas jovens, com idades compreendidas entre os 3 e os 9 anos, sendo que 4 éguas eram da raça PSL, 2 da raça PSI e uma da raça Oldenburg. O Grupo 2 era constituído por éguas velhas, com idades compreendidas entre os 17 e os 27 anos, sendo que 4 éguas eram da raça PSL, e as restantes 3 pertenciam às raças PSA, PSI e AA. Exceto uma égua do Grupo 2, que pertencia a um cliente, todos os animais utilizados neste estudo eram propriedade do HDLG.

Como anteriormente referido, os registos foram recolhidas ao longo de 3 anos, de 2014 a 2016 mas nem todos os animais foram acompanhados na totalidade dos 3 anos do estudo. No total foram recolhidos 923 registos; 287 em éguas do Grupo 1 e 636 em éguas do Grupo 2. A idade média dos animais no momento da recolha dos registos era de 13,2 ± 7,5 (3 – 27) anos. No grupo 1 a idade média era de 5,5 ± 1,6 (3 – 9) anos, e no grupo 2 de 19,5 ± 3,19 (16 – 27) anos. Para efeitos do presente trabalho não foram selecionados animais dentro do intervalo de idades dos 9 aos 15 anos.

2. Dados Epidemiológicos

 Condição Corporal

A condição corporal (CC) foi medida na escala de 1 a 5, sendo que 3 em 5 foi considerado o ideal para uma égua prestes a entrar na época reprodutiva. Uma CC de 2,5 era considerada aceitável. A CC estava descrita nos 14 animais e variou de 2 a 3,5.

No Grupo 1, a CC variou entre 2,5 e 3, sendo todas as éguas consideradas com uma CC saudável. No Grupo 2, a CC variou entre 2 e 3,5. A égua mais velha do grupo (27 anos), que estava diagnosticada com Obstrução Recorrente das Vias Aéreas Inferiores (RAO), apresentava dificuldades em melhorar a CC. As 3 outras PSL incluídas neste grupo apresentavam uma CC de 3,5. As restantes 3 éguas apresentavam uma CC que variava entre 2,5 a 3.

3. Maneio do Efectivo

 Água

A todos os animais da amostra era fornecida água ad libitum.  Alimentação

A informação relativa à constituição da dieta estava disponível para 13 animais. O 14º animal pertencia a um cliente e não se tinha conhecimento completo do seu regime alimentar, No entanto, durante a sua permanência nas instalações do PR-HDLG, teve acesso ao mesmo regime alimentar que as éguas do HDLG.

Todas as éguas encontravam-se num sistema rotativo de pastagens, sendo apenas estabuladas por um curto período de tempo, a cada ciclo éstrico, de modo a facilitar o acompanhamento do seu período de estro. Quando estabuladas era fornecido feno 3x ao dia. Relativamente ao fornecimento de alimento concentrado, este era condicionado conforme a raça e estádio em que a égua se encontrava no momento:

 PSL – apenas recebiam alimento em forma de concentrado antes do início da época reprodutiva sobre a forma de flushing (incremento). Durante o resto do ano normalmente não recebiam alimento concentrado pois eram muito eficientes em manter a sua CC e eram muito propensas ao aumento de peso;

 Oldenburgs – recebiam alimento concentrado antes do início da época reprodutiva sobre a forma de flushing, que continuava durante a época reprodutiva. No final da época reprodutiva deixavam de receber alimento concentrado, mas no início do

Inverno voltavam a receber alimento concentrado, pois pertenciam a uma raça que perde CC rapidamente;

 PSI e AA – recebiam alimento concentrado durante tudo o ano, incluindo o flushing antes do início da época reprodutiva;

 Éguas recetoras de embriões – recebiam o flushing antes da época reprodutiva e normalmente continuavam a receber alimento concentrado até ao final da mesma;  Éguas afilhadas - recebiam alimento concentrado no último terço da gestação e até

que o poldro tenha 3 meses, com incidência no último mês de gestação e nos 2 primeiros meses após o parto que é quando os poldros mamam mais frequentemente. Quando a pastagem começava a perder qualidade era adicionado o feno no regime alimentar. Sempre que a CC das éguas se reduzia para um nível abaixo do recomendado, era adicionada luzerna à sua alimentação. A introdução da luzerna era feita apenas por períodos breves, pois devido ao seu alto teor de proteína e uma razão de cálcio e fósforo muito desequilibrada, poderia provocar laminites. O concentrado também era adicionado no regime alimentar sempre que se verificava perda de CC e até que os valores normais estivessem restabelecidos.

 Aptidão

As éguas admitidas no estudo tinham como finalidade serem dadoras de embriões e/ou ficarem gestantes.

4. Metodologia de Análise

 Revisão dos registos médicos

As informações obtidas dos registos clínicos dos casos incluídos neste estudo consistiram nos dados epidemiológicos, clínicos, laboratoriais, dos exames complementares de diagnóstico e tratamento dos casos observados. Os dados epidemiológicos recolhidos abrangeram, a espécie, raça, a faixa etária, género e estado sexual, condição corporal, tipo de alimentação e fornecimento de água. O tratamento incluiu o tipo e número de tratamentos, tais como: administração de hormonas, administração de AB’s intrauterinos, lavagens uterinas e colocação de implantes hormonais.

As decisões do tratamento foram a critério da médica veterinária responsável e incluíram a consideração do valor relativo do animal, utilização pretendida, compromisso financeiro do proprietário e preferência da Médica Veterinária.

5. Análise estatística

Para a organização e tratamento dos dados recorreu-se ao programa Excel do Microsoft Office 2013 para o Windows 10 (Microsoft Corporation, USA). A análise estatística dos dados foi efetuada com o programa informático IBM SPSS Statitics 20 (IBM, USA).

As associações entre todas as variáveis foram calculadas por análise univariável de variância, com teste post-hoc de Bonferroni. A associação entre os parâmetros estudados era considerada estatisticamente significativa quando p < 0,05.

6. Parâmetros registados

Recorrendo ao uso da palpação e ultrassonografia, e interpretando as ecografias transretais nas éguas, foram registados os seguintes dados:

 Desenvolvimento folicular (onde era registada a presença ou ausência de folículos em desenvolvimento, o seu tamanho e forma);

 Presença/ausência de CL

 Presença/ausência de edema uterino e grau de edema uterino (I a IV);

 Presença/ausência de liquido uterino e qual a sua quantidade (0 a 4) e ecogenicidade (anecogénico, hipoecogénico ou hiperecogénico);

 Relaxamento da cérvix (F – fechada, 1 – largura de um dedo, 2 – largura de dois dedos, 3 – largura de 3 dedos, muito relaxada);

 Diagnóstico de Gestação (positivo ou negativo) aos dias 12 ou 14, 16, 28 e 45 dias após a ovulação.

O aparelho ultrassonográfico utilizado neste estudo era um Aloka Prosound®.

Após a ecografia e interpretação dos dados fornecidos pela mesma, sempre que fosse necessário, eram realizados os seguintes procedimentos que também fizeram parte do estudo:

 IA com sémen fresco, refrigerado ou congelado;  Monta Natural;

 Lavagem uterina com recurso a LR;

 Administração de antibióticos intrauterinos e qual o princípio ativo utilizado;  Administração de antifúngicos intrauterinos e qual o princípio ativo utilizado;

 Recolha de embrião (positiva ou negativa);  Implantação de embrião (positiva ou negativa).

7. Limitações do Estudo

Tal como qualquer estudo retrospetivo, a recolha de dados e a qualidade dos mesmos está dependente do tipo de registos médicos que estavam disponíveis, podendo haver enviesamento dos mesmos. O registo físico dos dados foi efetuado durante a observação clínica das éguas da propriedade do HDLG, assim como éguas de clientes, quando estes o permitiam. A amostra tinha um tamanho reduzido, dependente do número de éguas disponíveis.

V. RESULTADOS E DISCUSSÃO

1. Número de amostras égua/ano (exames reprodutivos)

No ano de 2014 foram revistos 63 registos de 2 éguas do Grupo 1 (novas) e 222 registos de 5 éguas do Grupo 2 (velhas). No ano de 2015 foram revistos 75 registos de 5 éguas do Grupo 1, e 217 registos de 5 éguas do Grupo 2. No ano de 2016 foram revistos 149 registos das 7 éguas do Grupo 1, e 197 registos das 7 éguas do Grupo 2. Ao longo dos 3 anos, foram revistos um total de 287 registos de éguas do Grupo 1 e 636 registos de éguas do Grupo 2, perfazendo um total de 923 registos (Tabela 1). A diferença do número de registos entre os dois grupos deve-se ao facto de as éguas mais velhas (Grupo 2) necessitaram de um maneio mais intensivo para atingirem resultados satisfatórios.

Tabela 1: Resumo da revisão de registos por égua/ano.

Égua Ano Total

2014 2015 2016 A (nova) 0 20 34 54 B (nova) 0 12 14 26 C (nova) 0 0 28 28 D (nova) 38 27 36 101 E (velha) 0 16 16 32 F (nova) 0 7 9 16 G (velha) 91 31 26 148 H (velha) 0 0 11 11 I (velha) 14 0 15 29 J (velha) 39 44 45 128 K (velha) 63 81 47 191 L (velha) 15 44 37 96 M (nova) 24 0 17 41 N (nova) 0 10 12 22 Total 284 292 347 923

2. Momento da primeira ovulação do ano

A primeira ovulação do ano ocorreu entre o início de Abril e o fim de Maio em todas as éguas presentes no estudo, e em todos os anos de observação (Tabela 2). Em média, as éguas velhas ovularam sempre mais cedo que as éguas novas, embora com uma diferença de poucos dias. No geral, tanto as éguas novas como as velhas tiveram a sua primeira ovulação aproximadamente na mesma altura do ano.

Tabela 2: Momento da primeira ovulação por grupo de éguas/ano. Data da 1º Ovulação

Grupo Ano Total

2014 2015 2016

Novas 31/05/2014 (n=2) 16/04/2015 (n=5) 10/04/2016 (n=7) 10/04 (n=14) Velhas 15/04/2014 (n=5) 11/04/2015 (n=5) 09/04/2016 (n=7) 12/04 (n=17) Total 24/04/2014 (n=7) 14/04/2015 (n=10) 09/04/2016 (n=14) 15/04 (n=31)

As éguas mais velhas tem uma tendência a entrar duas semanas mais tarde na época reprodutiva (Vanderwall e Woods, 1990; e Wesson e Ginther, 1981). Essa tendência não se verificou neste estudo, não havendo diferenças significativas. No presente estudo, ao contrário do anteriormente descrito, o grupo de éguas mais velhas teve a sua primeira ovulação antes do grupo das éguas mais jovens, nos 3 anos do estudo. É importante referir que no ano de 2015, duas éguas do grupo 2 tinham sido previamente sujeitas a um tratamento de luz para que retornassem à ciclicidade mais cedo nessa época reprodutiva. No entanto, as éguas em causa tiveram a sua 1º ovulação sensivelmente ao mesmo tempo que as restantes 5 éguas do grupo 2.

A atividade ovárica pode cessar em algumas éguas mais velhas, enquanto outras continuam a ciclar mesmo tendo mais de 20 anos de idade (Vanderwall e Woods, 1990); Wesson e Ginther,1981). Também segundo um estudo realizado por Carnevale et al. (1994), apenas 50% das éguas com mais de 20 anos apresentavam ciclos regulares durante a época reprodutiva, e 19% não ovulam. Neste estudo, todas as éguas do Grupo 2 ciclavam normalmente, incluindo as éguas com mais de 20 anos de idade, o que contraria os autores citados anteriormente.

Contudo, no que concerne os resultados do ano de 2014 do Grupo 1 estes não estavam completos, visto que as éguas já se encontravam a ciclar normalmente, mas não

eram realizados os exames reprodutivos na altura expectável do início da época reprodutiva. Tal deveu-se ao facto de o sémen do garanhão selecionado para ser cruzado com as éguas em questão não se encontrar disponível no início da época reprodutiva. No ano de 2015 uma das éguas do Grupo 1 esteve gestante e pariu em Junho, o que pode ter alterado a média da primeira ovulação do ano.

Uma das razões pelas quais as éguas mais velhas estavam a ovular mais cedo que as novas, e mostrando ciclicidade mesmo após os 20 de idade, pode ser explicado pelo grande cuidado com a manutenção da CC destas éguas. De acordo com Niekerk e Heerden (1972), e Ginther (1974), existe uma correlação positiva entre a CC, a ciclicidade e velocidade de transição do anestro de inverno para o arranque da primeira ovulação. Como as éguas mais velhas normalmente tem uma maior dificuldade em manter um peso adequado, a alimentação é adaptada às suas necessidades.

3. Ovulação

Durante o estudo foram registadas 115 ovulações no total. No Grupo 1 foram registadas 38 ovulações, sendo que duas (5,7%) foram ovulações duplas (1 lateral e 1 no mesmo ovário) e 36 (94,7%) foram ovulações simples. As ovulações duplas no Grupo 1 eram provenientes da égua M de 6 anos de idade, e ocorreram na mesma época reprodutiva. No Grupo 2 foram registadas 77 ovulações, sendo que 14 (18,2%) foram ovulações duplas e 63 (81,8%) foram simples. Das 14 ovulações duplas, 5 foram provenientes da égua G, de 27 anos de idade, e todas foram laterais; 5 pertencem à égua J, de 20 anos de idade, sendo que 3 foram laterais e 2 no mesmo ovário. As restantes 4 pertencem à égua K, de 20 anos de idade, sendo que 2 foram laterais e 2 no mesmo ovário (Figura 7). Os casos de ovulação dupla no Grupo 2 não ocorreram no mesmo ano reprodutivo. Apesar da tendência a uma maior observação de ovulações duplas em éguas velhas, esta não foi estatisticamente significativa (p=0,061), provavelmente devido ao reduzido número da amostra.

Está descrita uma associação entre a idade e o aumento da incidência de ovulações múltiplas (Sanderson e Allen, 1987; Morel e O’Sullivan, 2001). Também Morel et al. (2005), realizaram um estudo que refere que idade das éguas afeta significativamente a frequência de ovulações múltiplas, sendo que a incidência é menor quando as éguas tem uma idade entre 2 a 4 anos (20,7%) e é maior dos 17 aos 19 anos (35,6%). No presente estudo a incidência foi apenas de 5,3% nas éguas mais jovens, e 18,2% nas éguas mais velhas. Apesar de os valores serem inferiores aos descritos e de não serem estatisticamente significativos,

existe uma grande diferença na taxa de ovulações nos 2 grupos do estudo, com mais do triplo de taxa de ovulações duplas nas éguas velhas.

No entanto, sabe-se que a manipulação farmacológica do ciclo éstrico, recorrendo à utilização de Pgf2α e hCG, também aumenta a incidência de ovulações duplas (Veronesi et al.

2003). A administração de Pgf2α durante a fase lútea pode interferir com o mecanismo de

seleção de folículos e dominância folicular, levando à presença de dois folículos sensíveis à ação do hCG na altura da indução da ovulação (Jochle et al. 1987; Veronesi et al. 2003).

Neste estudo, todas as éguas eram manipuladas farmacologicamente e existiu um aumento da incidência das ovulações duplas. Embora não sendo estatisticamente significativo, concluiu-se que há uma tendência de aumento das ovulações duplas, principalmente em éguas mais velhas, quando estas são manipuladas farmacologicamente.

4. Duração do ciclo éstrico

No presente trabalho não faria sentido realizar o cálculo da média da duração fisiológica do ciclo éstrico, pois todas as éguas incluídas eram manipuladas farmacologicamente, recorrendo ao uso de Pgf2α de forma a sincronizar os cios e ovulações.

No entanto, podemos comparar a resposta à Pgf2α nos dois grupos de éguas. Em média, o

intervalo interovulatório nas éguas do Grupo 1 (jovens), foi de 16,8 dias (n = 24), e nas éguas

81,80% (n = 63) 18,20% (n = 14) Tipo de Ovulação Grupo 2 Simples Dupla 94,70% (n = 36) 5,30% (n = 2) Tipo de Ovulação Grupo 1 Simples Dupla

de 20,1 ± 15,1 (13 – 135 dias) com n = 84 intervalos testados. A diferença do intervalo interovulatório entre as éguas jovens e velhas não foi significativa (p = 0,206) (Tabela 3). Tabela 3: Comparação do intervalo interovulatório entre éguas novas e velhas.

GRUPO Média Desvio Padrão N

Novas 16,8 3,06 24

Velhas 21,4 17,6 60

Total 20,1 15,1 84

O ciclo éstrico é geralmente mais prolongado nas éguas mais velhas, podendo existir um aumento de 4,3 dias em relação às éguas mais novas, devido à maior duração da fase folicular que se verifica nas éguas mais velhas (Vanderwall et al. 1989; Carnevale et al. 1993). Neste estudo, a diferença do intervalo interovulatório entre as éguas jovens e velhas foi de 4,6 dias, o que vai de acordo ao descrito pelos autores citados anteriormente. No entanto, o desvio padrão era muito grande, tornando esta diferença não significativa.

Uma justificação para o acentuado desvio padrão observado em ambos os grupos poderá ser o facto de se ter agrupado éguas destinadas a TE ou a gestação a termo. O encurtamento do ciclo éstrico verifica-se principalmente em éguas que se encontram num regime de TE, devido ao uso de fármacos para sincronização de cios e indução da ovulação. Éguas que se destinavam a ficarem gestantes, fizeram ciclos normais. Existe também a questão do uso do hCG para indução da ovulação, e consequentemente, manipulação do ciclo éstrico. Apesar de o hCG apenas ter um impacto mínimo de 1 a 2 dias na redução da duração do ciclo éstrico, o mesmo não ocorre quando é administrada Pgf2α, pois esta pode

reduzir até 5 dias a duração do ciclo éstrico normal. Ou seja, quando estes dois fármacos são utilizados em conjunto, a duração do ciclo éstrico pode ser encurtado entre 5 a 7 dias.

5. Incidência de falha na ovulação (novas vs. velhas) durante a época reprodutiva

Como já foi referido anteriormente, durante o estudo foram registadas um total de 115 ovulações. No grupo 1 foram registadas 38 ovulações, e no grupo 2 foram registadas 77 ovulações. Em toda a duração do estudo, nenhuma das éguas do grupo 1 apresentou folículos anovulatórios e apenas 2 éguas do grupo 2 apresentaram episódios de folículos anovulatórios. A égua G, de 27 anos de idade, apresentou 2 episódios de folículos anovulatórios, que se mantiveram 76 e 135 dias, nos anos de 2015 e 2016, respetivamente. A égua K, de 20 anos

de idade, apresentou um episódio no ano de 2015, que teve a duração de 34 dias. A incidência foi de 0% no grupo 1, e 3,9% no grupo 2.

A incidência da falha da ovulação em éguas com idades entre os 6 e os 10 anos é de 4,4%, e em éguas com mais de 16 anos é de 13,1%, ou seja, a incidência dos folículos anovulatórios aumenta com a idade (Carnevale & Griffin 1993, McCue & Squires 2002). O intervalo interovulatório das éguas afetadas é de 38,5 dias, e 43,5% das éguas que apresentam um folículo anovulatório voltam a incidir na mesma época reprodutiva. Neste estudo, a incidência foi de 3,9%, uma percentagem abaixo dos 13,1% indicados por McCue e Squires (2002). Depois de resolvido o problema, as éguas não voltaram a reincidir no mesmo ano. As percentagens abaixo das indicadas por McCue e Squires (2002) podem ser explicadas por baixo número de éguas que foram utilizadas no estudo. Como apenas foram registados folículos anovulatórios no grupo 2 (éguas mais velhas), os resultados deste estudo vão de encontro ao constatado por Carnevale e Griffin (1993), que referem que a incidência de folículos anovulatórios aumenta com a idade.

De referir que a égua G, de 27 anos, por ter uma idade bastante considerável, pode ter deixado de ciclar normalmente, fazendo intervalos interovulatórios muito longos sem qualquer relação à presença de um folículo anovulatório.

6. Incidência da Morte Embrionária Precoce

No Grupo 1 foram registadas 7 gestações que ultrapassaram os 40 dias e 7 embriões recolhidos, que foram implantados nas recetoras e que também ultrapassaram os 40 dias de vida. A incidência da MEP no grupo 1 foi de 0%. No Grupo 2 foram registadas 5 gestações, mas uma das éguas apresentou um quadro de MEP aos 20 dias de gestação. Neste grupo também foram recolhidos 18 embriões que foram implantados nas recetoras, mas 3 desses embriões foram reabsorvidos. A incidência da MEP no grupo 2 foi assim de 20% para éguas gestantes que perderam a gestação, e 16,6% em embriões implantados nas recetoras (Tabela 4). A incidência da MEP do Grupo 2 foi de 17,4% no total.

Tabela 4: Incidência da Morte Embrionária Precoce nos dois grupos de éguas.

MEP Dadoras Novas Dadoras Velhas

Dadoras 0% (n=7) 20% (n=5)

Recetoras 0% (n=7) 16,7% (n=18)

A incidência geral descrita da MEP é de 5-15%, no entanto, em éguas com mais de 18 anos de idade, esta incidência aumenta para 20-30% ou mais (McDowell et al. 1992), o que vai de acordo com os resultados obtidos. Neste estudo, o Grupo 2 (velhas) teve 17,4% (4/23) de MEP enquanto o Grupo 1 (novas) não teve qualquer MEP (n=7). No entanto, esta diferença não é significativa (p = 0,251), provavelmente devido ao tamanho reduzido da amostra.

Nas éguas gestantes há o fator da qualidade do embrião e do útero da mãe. Quando a isto se adicionam as variáveis decorrentes da TE, por um lado existe o risco da manipulação do embrião (que provavelmente leva a que morra antes de sequer ser visto na ecografia) e por outro a intenção é coloca-lo num útero que, no caso das éguas velhas, seja mais propício ao bom desenvolvimento do embrião – ausência de endometrite e quistos.

7. Incidência de edema e de acumulação anormal de líquido uterino (novas e velhas)

Grupo 1 Grupo 2

Com líquido IU 25,8% (n = 74) 46,1% (n = 293)

Sem líquido IU 74,2% (n = 213) 53,9% (n = 343)

Total Registos 287 636

Num total de 923 registos, foi detetado líquido IU em 367 (39,8%). No Grupo 1 (jovens) foi detetado líquido IU em 25,8% dos registos (74/287), e no Grupo 2 (velhas) foi detetado líquido IU em 46,1% dos registos (293/636). A incidência da presença de liquido IU foi significativamente maior nas éguas velhas, 46,1% (293/636), do que nas éguas jovens, 25,8% (74/287) (p < 0,001). O grau médio de edema uterino no Grupo 1 era 1,35 ± 1,6 (n=287), e no Grupo 2 era de 1,18 ± 1,5 (n=636). O edema uterino era em média, maior nas éguas jovens do que nas éguas velhas (p = 0,032).

Existe geralmente um aumento significativo da incidência e gravidade de acumulação de fluído no lúmen uterino em éguas mais velhas, devido a vários fatores predisponentes tais como: útero largo e descaído, incompetência cervical, drenagem linfática deficiente e