Amostras de DNA incluídas na análise da perda de heterozigotia do gene TCF7L

A perda de heterozigotia (LOH) do gene TCF7L2 foi analisada em amostras de DNA proveniente de 57 tumores do cólon ou do recto e o correspondentes DNA de tecido normal. Em 50 indivíduos, foi utilizado DNA extraído de tecido tumoral e de tecido não neoplásico incluído em blocos de parafina e nos restantes 7, extraído a partir de biopsia de tecido congelado (DNA do tumor) e de sangue (DNA normal).

Dos tumores analisados, 50 eram MSS e 7 apresentavam MSI. Destes últimos, 2 correspondiam a CCR esporádico e 5 a tumores de sindroma de Lynch.

As características clínicas de cada indivíduo, as quais serão correlacionadas com a presença de LOH, encontram-se resumidas na Tabela 12 no Anexo 1.

1.2. Métodos

1.2.1. Cultura celular

A cultura celular consiste num tipo de cultura de tecidos que envolve um conjunto de técnicas que permitem cultivar e/ou manter células isoladas fora do organismo de origem.

As principais vantagens do uso de culturas celulares são: controlo das condições ambientais, análise independente de parâmetros, elevado número de testes num pequeno intervalo de tempo, redução dos ensaios com animais, para além de serem menos dispendiosas que a experimentação animal. No entanto, também apresentam algumas desvantagens: a perda de características fenotípicas, o sistema biológico está fora do ambiente natural e ausência de sinais importantes.

As células foram mantidas em cultura a 37°C e 5% de CO2 em meio de cultura constituído por Dulbecco’s modified Eagle medium 1x (DMEM) (Invitrogen™) suplementado com 10% (v/v) de Fetal Bovine Serum, Certified (FBS) (Invitrogen™), 1x de L-glutamina (2mM) (Invitrogen™) e 1x de antibiótico e antimicótico (Invitrogen™). Estas foram mantidas, normalmente, em frascos de 25cm2 (T25) em 5ml de meio de cultura e por vezes em frascos de 75cm2 (T75) em 12,5ml. As passagens para novos frascos foram feitas, em média, duas vezes por semana, na diluição de 1:10 para a linha celular HT29 e 1:5 para a linha celular SW480.

1.2.1.1. Descongelação de células

Ao contrário da criopreservação, a descongelação das linhas celulares deve ser rápida de modo a que as células não permaneçam, durante muito tempo, em meio com dimetil sulfóxido (DMSO) (Panreac) (agente crioprotector) à temperatura ambiente, uma vez que este é tóxico para as células.

Em cada descongelação as células foram retiradas do azoto líquido e rapidamente colocadas em gelo. De seguida, as células foram descongeladas rapidamente, a 37°C e lavadas várias vezes com 5ml de meio de cultura (previamente aquecido a 37°C) e centrifugadas a 800rpm durante 8min. O sobrenadante foi rejeitado e adicionados 5ml de DMEM suplementado que foram, posteriormente, transferidos para o frasco de cultura T25.

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1.2.1.2. Subcultura

Quando as células se apresentavam em confluência, foram subcultivadas. A subcultura foi iniciada pela remoção do meio de cultura e pela lavagem das células duas vezes em 4ml de

Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS)(Invitrogen™), de modo a retirar quaisquer

vestígios de FBS, uma vez que este inactiva a tripsina. As células foram destacadas por adição de 1ml de tripsina 1x (Invitrogen™). Após remoção de uma parte da tripsina (0,7ml) a acção desta foi potenciada por incubação das células a 37:C e 5% CO2, uma vez que esta é a temperatura óptima de acção deste enzima. O destacamento das células foi monitorizado através do uso do microscópio óptico de contraste invertido. De seguida, foram adicionados 5ml de DMEM suplementado (inactiva a tripsina) e as células foram ressuspendidas e transferidas para novos frascos fazendo a diluição necessária para assegurar duas subculturas por semana.

1.2.1.3. Criopreservação

O congelamento das linhas celulares foi efectuado na fase exponencial de crescimento e acompanhado de elevada viabilidade celular. Brevemente, as células foram mantidas em cultura, até atingirem cerca de 75% de confluência. Em seguida, a monocamada de células foi lavada com DPBS, tripsinizada (como referido em 1.2.1.2.) e ressuspendida em meio de cultura. Esta suspensão foi centrifugada a 800rpm durante 8min, de modo a obter-se um pellet de células viáveis. Este foi ressuspendido em 1ml de meio de cultura DMEM suplementado com L-glutamina 1x, antimicótico e antimicótico 1x, com 20% (v/v) de FBS e 10% (v/v) de dimetil sulfóxido (DMSO) (Panreac). O DMSO funciona como crioprotector, impedindo que as células rebentem ao serem congeladas, no entanto, à temperatura ambiente este é tóxico para as células e por isso o meio foi arrefecido em gelo, antes de ser adicionado. De modo a assegurar uma congelação lenta e eficaz a suspensão celular foi congelada primeiramente a - 80°C, numa caixa de esferovite e após 24h armazenada em azoto líquido.

1.2.1.4. Contagem de células

Para alguns ensaios foi necessário conhecer o número de células que estavam presentes em solução. Para a sua contagem, utilizou-se uma câmara de Neubauer modificada (hemacitómetro Neubauer improved). As células foram contadas após tripsinização, centrifugação a 800rpm durante 8min, e ressuspensão. O processo de ressuspensão celular foi realizado com cuidado, de modo a evitar a formação de aglomerados celulares, que dificultavam a contagem das células e a lise celular. A contagem foi efectuada em 10µl da suspensão celular e foram contadas as células que se encontravam nas zonas A da Figura 13 do hemacitómetro. De modo a evitar repetições na contagem, foram contabilizadas apenas as dos linhas de baixo e do lado esquerdo, quando existia a sobreposição das células com a grelha. A concentração de células (células/ml) foi calculada pela média das células contadas em cada zona A a multiplicar por 104.

Terapêutica no Cancro do Cólon e Recto 22 Figura 13 Ilustração da grelha de contagem do hemacitómetro Neubauer improved.

1.2.2. Amplificação de plasmídeos

De modo a se poder transfectar as linhas celulares, foi necessário aumentar a quantidade de DNA plasmídeo a utilizar, e para isso foi necessário amplificar os plasmídeos utilizando as células bacterianas competentes One Shot® TOP10 Chemically Competent E.coli (Invitrogen™) e seguindo o protocolo recomentado pelo fabricante. Assim, a 50µl de células

One Shot® foram adicionados 100ng de cada plasmídeo (em volumes compreendidos entre 1 e

5µl) e para o controlo da transformação usou-se 1µl (10pg) do vector controlo pUC19 para 25µl de células. Durante o processo de transformação das bactérias (introdução do DNA recombinado em células bacterianas), as células foram tornadas premiáveis (ou seja, com a capacidade para receber DNA do meio circundante) através da sua incubação em gelo durante 30min seguido de choque térmico durante 2min. De seguida, e de forma asséptica, foram adicionados 250µl de meio S.O.C (incluído no kit) a 37°C às células bacterianas (à transformação controlo com pUC19 foram adicionados 125µl de meio S.O.C) e, posteriormente, colocadas em crescimento a 37°C durante 1h num agitador orbital.

De seguida, as bactérias foram colocadas a 37°C durante a noite (≈16h) em placas de 10cm2 (Nunclon™) LB/agar (15g/l) (Oxoid) e ampicilina (100µg/ml). A ampicilina foi o antibiótico que seleccionou as células transformadas, uma vez que, os plasmídeos utilizados continham um gene que confere resistência a este antibiótico.

Após o crescimento das colónias de bactérias resistentes à ampicilina foram retiradas algumas colónias isoladas de cada placa e colocadas em 3ml de meio LB com 100µl/ml de ampicilina (LBAmp). Estas foram incubadas durante aproximadamente 8h, num agitador orbital a 37°C, para crescimento, e posteriormente retirados 300µl que foram diluídos em 100ml de meio LBAmp , seguindo-se nova incubação durante 16h a 37°C com agitação. No caso dos plasmídeos WRE e MRE, a incubação foi efectuada a uma temperatura inferior (30°C) e consequentemente, durante mais tempo, de forma a diminuir a probabilidade de aparecimento de erros durante a replicação do plasmídeo, uma vez que este contém um elevado número de repetições de adeninas. Assim, em vez das incubações de 2, 8 e 16h, para crescimento bacteriano, foram realizadas incubações durante 2, 16 e 24h, respectivamente.

Após o crescimento celular das bactérias transformadas, foram armazenadas a -80°C algumas aliquotas de bactérias (solução stock) numa solução contendo 15% de glicerol (Sigma®). A partir destas, foi possível amplificar os plasmídeos sem ser necessário realizar novamente a transformação das bactérias.

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