SDS-PAGE de amostras de FVIII comercial

O FVIII comercial utilizado como padrão positivo (Hemofil M , 50 U/mL, Baxter Healthcare Corporation, Los Angeles, CA, EUA) foi utilizado como controle positivo em ensaios de “western blot”. Para definirmos uma quantidade ótima de massa protéica para visualização em SDS-PAGE, foram aplicadas quantidades crescentes de FVIII comercial, e realizada a coloração por Coomassie blue e por prata para a visualização das bandas mais fracas. Nota-se a banda predominante correspondente à albumina na preparação, usada como estabilizante (Figura 5.52).

A B

Figura 5.52 Perfil protéico de amostra de FVIII comercial em SDS-PAGE (7,5%). A. coloração por Coomassie blue. B. Coloração por prata. Canaletas: 1 a 4. FVIII comercial 1, 2, 5 e 10 µL, respectivamente; 5. Plasma; 6. Fração Q500; 7. Fração GF3 de gel filtração de plasma; 8 a 13. FVIII comercial 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 e 2 µL, respectivamente.

5.2.10 “Western blot” utilizando soro com anticorpos contra cadeia leve (anti- fCL) produzido no laboratório

Os soros dos animais imunizados com fragmento recombinante de cadeia leve de FVIII (fCL), contendo anticorpos policlonais anti-fCL, foram utilizados em ensaios de “western blot” para o reconhecimento da proteína FVIII.

O ensaio inicial foi realizado com o soro obtido da segunda sangria (depois de duas imunizações com a proteína fCL) na diluição 1:1000. As amostras utilizadas foram plasma e a proteína fCL recombinante usada na imunização dos animais.

116,0 66,2 45,0 35,0 MM 1 2 3 4 MM 5 6 7 8 9 10 11 12 13 200 150 120 100 85 70 60 50 40

A membrana foi corada com Memcode (Pierce) e o “western” revelado com DAB. Apesar da forte reatividade com a proteína recombinante, não se observa banda de reconhecimento da proteína FVIII no plasma, possivelmente devido à sua baixa concentração. Observa-se uma banda de reconhecimento não-específico em albumina (~66 kDa) (Figura 5.53).

Figura 5.53 Análise do reconhecimento de FVIII pelo soro de animais imunizados contra fCL por “western blot” (2ª sangria, diluição 1:1000). A. Coloração da membrana por Memcode; B. Revelação com DAB. Canaletas: 1. Plasma (1,5 µL); 2. Fragmento CL recombinante (fCL) (12 µL).

Novo “western blot” foi realizado com o soro obtido da quarta sangria, na diluição 1:1000. As amostras utilizadas foram plasma, frações cromatográficas com atividade de FVIII e a proteína fCL recombinante. Para verificar especificidade do soro, foi acrescentada amostra de extrato de bactéria expressando proteína recombinante não relacionada com fCL, com cauda de histidina (Figura 5.54).

Figura 5.54 Análise do reconhecimento de anticorpos do soro de camundongos imunizados com fCL por FVIII em diferentes amostras. “Western blot” com soro preparado após 4 imunizações (diluição 1:1000). SDS-PAGE 5 a 20%. A. Coloração da membrana por Ponceau; B. Revelação com DAB. Canaletas: 1. Plasma (1,5 µL); 2. GF2-plasma (24 µL); 3. GF3- plasma (24 µL); 4. Q250 (24 µL); 5. Q500 concentrado (10 µL); 6. GF4-Q500 (24 µL); 7. GF5-Q500 (24 µL); 8. fCL recombinante (10 µL); 9. Extrato de bactéria expressando proteína não relacionada para análise de reconhecimento inespecífico (5 µL). Obs.: a

116 66 45 35 25 MM 1 2 A B 116 66 45 35 25 MM 1 2 fCL MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 200 120 85 60 50 40 30 25 20 15 10 A MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 200 120 85 60 50 40 30 25 20 15 10 B

No “western blot” (Figura 5.54) observa-se forte reatividade do soro anti-fCL com proteínas do extrato de E. coli (canaleta 9). Nota-se a determinação de uma banda forte de reconhecimento de uma proteína do extrato bacteriano, provavelmente relacionada com o reconhecimento da cauda de histidina. Além disso, o reconhecimento de outras bandas de E. coli pode ser visto. O soro reconhece a banda de fCL purificada e ainda proteínas contaminantes da purificação (canaleta 8). Nesse ensaio, os anticorpos do soro não reconheceram a proteína FVIII nas amostras de frações de cromatografias de plasma.

Para aumentar a sensibilidade do ensaio, foi utilizado o soro da quarta sangria em menor diluição (1:500); foram testadas as amostras de plasma, frações cromatográficas com atividade de FVIII e FVIII comercial (Figura 5.55).

Figura 5.55 Análise do reconhecimento de FVIII por soro de camundongos imunizados com fCL em diferentes amostras. “Western blot” com soro preparado após 4 imunizações (diluição 1:500). SDS-PAGE 4 a 16%. A. Coloração da membrana por Ponceau; B. Revelação com DAB. Canaletas: 1. Plasma (2 µL); 2. Q500 concentrado (15 µL); 3. GF3-plasma (em Sepharose 4FF) (24 µL); 4. FVIII comercial (5 µL/0,25 U).

No ensaio de “western blot” com soro na diluição 1:500 (Figura 5.55), observamos reconhecimento de bandas específicas, ou seja, em posições com muito pouca massa de proteína (vide membrana corada com Ponceau), nas posições aproximadas ~150 kDa (na amostra de plasma - 1), em ~80 kDa (amostras Q500 e FVIII comercial - 2 e 4) e ainda em 72 kDa (amostra GF3 de plasma - 3). Também se observa bandas de reconhecimento não-específico (principalmente de albumina). A cadeia leve de FVIII apresenta massa molecular de 80 kDa no heterodímero circulante no plasma, e 73 kDa no heterotrímero ativado, sugerindo a presença destas formas de cadeia leve nas amostras analisadas de Q500, FVIII comercial e amostra de gel filtração (GF3) de plasma. O reconhecimento da banda

MM 1 2 3 4 170 130 95 72 55 43 34 26 17 11 A MM 1 2 3 4 170 130 95 72 55 43 34 26 17 11 B

de 150 kDa em plasma sugere que este não seja um reconhecimento de FVIII, mas causado pelo reconhecimento de outras proteínas por anticorpos não específicos dos camundongos.

Para análise da especificidade dos anticorpos preparados no laboratório, foi utilizado anticorpo monoclonal comercial anti cadeia leve de FVIII (MAb-38, Chemicon), para comparação do reconhecimento de FVIII em plasma e nas amostras de purificação (Figura 5.56).

Figura 5.56 Comparação do reconhecimento de FVIII por soro anti-fCL e anticorpo monoclonal anti- CL. “Western blot” com dois diferentes anticorpos anti FVIII-CL. SDS-PAGE 4 a 16%. A. Coloração da membrana por Ponceau. B. Revelação com DAB. Canaletas 1 a 4. Anticorpo monoclonal anti cadeia leve (MAb-38) (diluição 1:1000). 5 a 8. Soro com anticorpos policlonais anti-fCL (4ª sangria, diluição 1:500). Canaletas: 1. e 5. Plasma (2 µL); 2. e 6. Q500 concentrado (15 µL); 3. e 7. GF3-plasma (em Sepharose 4FF) (24 µL); 4. e 8. FVIII comercial (5 µL/0,25 U).

Observa-se na posição 80 kDa uma banda contra FVIII comercial semelhante, usando o anticorpo monoclonal ou usando o soro, indicando que o reconhecimento é, realmente, da proteína FVIII. Esta é a única banda reconhecida pelo anticorpo monoclonal, diferentemente do reconhecimento do soro policlonal, que reconhece bandas também nas amostras de purificação.

É preciso considerar que o FVIII é encontrado em concentrações muito baixas no plasma e nas frações cromatográficas. Possivelmente, a diluição utilizada no anticorpo monoclonal foi muito alta para a sensibilidade desta detecção. A detecção de banda na mesma posição pelo soro policlonal, também nas frações de purificação, sugere que a diluição utilizada para este soro seja suficiente para a detecção de FVIII (apesar do reconhecimento também de bandas inespecíficas). Observa-se que a quantidade de proteína aplicada no gel, a diluição e tempo de incubação dos soros e antisoros e o sistema de revelação são variáveis importantes a serem consideradas na avaliação dos resultados de detecção.

170 130 95 72 55 43 34 26 17 11 MM 1 2 3 4 MM 5 6 7 8 A 170 130 95 72 55 43 34 26 17 11 MM 1 2 3 4 MM 5 6 7 8 B

5.2.11 “Western blot” utilizando soro com anticorpos contra cadeia pesada (anti-fCP) produzido no laboratório

O soro produzido por imunização de animais com fragmento recombinante de cadeia pesada de FVIII, fCP, foram utilizados em ensaios de “western blot” para o reconhecimento da proteína FVIII. Utilizou-se o soro da sangria final (após três imunizações com a proteína fCP) na diluição 1:500. As amostras utilizadas para o ensaio foram proteína recombinante fCP (usada na imunização dos animais), plasma, frações cromatográficas com atividade de FVIII e FVIII comercial (Figura 5.57).

Figura 5.57 Análise do reconhecimento de FVIII por soro de camundongos imunizados com fCL em diferentes amostras. “Western blot” com soro preparado após 3 imunizações (diluição 1:500). SDS-PAGE 4 a 20%. A. Coloração da membrana por Ponceau; B. Revelação com DAB. Canaletas: 1. fCP recombinante (~16 kDa) (15 µL); 2. Plasma (2 µL); 3. Q500 concentrado (15 µL); 4. GF3-plasma (20 µL); 5. FVIII comercial (10 µL/0,5 U).

Apesar da forte reatividade com a própria proteína recombinante usada nas imunizações dos animais, o soro não determinou banda de reconhecimento de FVIII em nenhuma outra amostra. Com esse estudo, não é possível confirmar que tenhamos obtido o fragmento fCP desejado, e portanto, não tenha se gerado anticorpos contra a cadeia pesada de FVIII. Também seria possível que o pequeno fragmento determine anticorpos contra epitopos que não são apresentados nas amostras em teste. 170 130 95 72 55 43 34 26 17 11 1 MM 2 3 4 5 A B 170 130 95 72 55 43 34 26 17 11 1 MM 2 3 4 5

5.2.12 Comparação de “western blot” utilizando diversos anticorpos contra