Detecção de multímeros de fator de von Willebrand nas frações de gel filtração de plasma e de

em gel de agarose e “western blot”

Como mencionado, o fator de von Willebrand é uma glicoproteína de cerca de 220 kDa, que se associa formando multímeros que atingem até 20 MDa. O fator de von Willebrand é a proteína carregadora do FVIII no plasma, protegendo-o da ativação fora do sítio de coagulação.

Uma possibilidade considerada para a diferença entre o volume de eluição do FVIII em nossos processos de gel filtração de plasma ou de Q500 é o tamanho do complexo FVIII/fator von Willebrand, especialmente relacionado com o número de moléculas de von Willebrand associadas.

A associação de moléculas de FVIII e FvW na proporção 1:1, formaria um complexo de massa molecular de aproximadamente 450 kDa. A adição de cada molécula de von Willebrand ao complexo adicionaria 220 kDa, obtendo-se complexos de tamanho 670, 890, 110 kDa, etc (com proporções FVIII/FvW 1:2, 1:3, 1:4, etc).

A literatura descreve o fator de von Willebrand circulante no plasma com um mínimo de duas moléculas, formando um dímero. É possível que a associação com FVIII também seja por adição de dímeros de von Willebrand, formando complexos nas proporções FVIII/FvW 1:2, 1:4, 1:6, etc..., com adição de cerca de 440 kDa para cada dímero associado.

Para se avaliar o tamanho dos complexos FVIII/FvW nas frações das cromatografias por gel filtração de plasma e de Q500, realizamos ensaios de “western blot”, utilizando como matriz de separação de proteínas um gel de agarose 0,8% em condições não redutoras. As proteínas separadas por eletroforese eram transferidas para membranas de PVDF, procedendo-se com o “western blot” com anticorpos monoclonais anti-FvW.

A Figura 5.43 apresenta o resultado do “western blot” de frações de gel filtração de plasma.

Figura 5.43 Análise da presença e da massa molecular de multímeros de von Willebrand nas frações de gel filtração de plasma em resina Sepharose 6FF (380 mL), por “western blot” usando anticorpo monoclonal anti-FvW (diluição 1:1000). Eletroforese em gel de agarose 0,8% (condição não redutora). A. Membrana corada por Ponceau; B. Revelação com substrato quimioluminescente. Volume de amostra aplicada: 5 L/poço. Canaletas: 1. Plasma; 2. GF5; 3. GF6; 4. GF7; 5. GF8; 6. GF9; 7. GF10; 8. GF11; 9. GF12; 10. GF13; 11. GF14; 12. GF15; 13. GF16; 14. GF17.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

O ensaio de “western blot” revelou os multímeros de von Willebrand. Como esperado, frações coletadas em menor volume de eluição apresentam complexos de maior massa, e, à medida que se aumenta o volume de eluição, o tamanho dos multímeros vai diminuindo. É possível detectar complexos de alta massa molecular sendo eluídos a partir da fração GF6 (volume de eluição da coluna 165 mL) (canaleta 3)com a diminuição gradativa do tamanho desses complexos.

A definição do gel e os marcadores de massa molecular não permitiram avaliar a massa molecular dos complexos pela distância das bandas detectadas. Não se pode assegurar se moléculas de FVIII nestas frações estariam ligados a monômeros, dímeros ou outros múltiplos de von Willebrand.

As amostras de frações de gel filtração de Q500 também foram analisadas, para avaliar distribuição dos complexos FVIII/FvW na cromatografia e comparar os tamanhos dos complexos com amostras da gel filtração do plasma. As Figuras 5.44 e 5.45 mostram “western blots” de fração de gel filtração de Q500 em resinas Sepharose 6FF e Sepharose 4FF, respectivamente.

Figura 5.44 Análise da presença e da massa molecular de multímeros de von Willebrand nas frações de gel filtração de Q500 em resina Sepharose 6FF (380 mL), por “western blot” usando anticorpo monoclonal anti-FvW (diluição 1:1000). Eletroforese em gel de agarose 0,8% (condição não redutora). A. Membrana corada por Ponceau; B. Revelação com substrato quimioluminescente. Volume de amostra aplicada: 5 L/poço. Canaletas: 1. Q500; 2. GF5; 3. GF6; 4. GF7; 5. GF8; 6. GF9; 7. GF10; 8. GF11; 9. GF12; 10. GF13; 11. GF14; 12. GF15.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figura 5.45 Análise da presença e da massa molecular de multímeros de von Willebrand nas frações de gel filtração de Q500 em resina Sepharose 6FF (380 mL), por “western blot” usando anticorpo monoclonal anti-FvW (diluição 1:1000). Eletroforese em gel de agarose 0,8% (condição não redutora). A. Membrana corada por Ponceau; B. Revelação com substrato quimioluminescente. Volume de amostra aplicada: 5 L/poço. Canaletas: 1. Q500; 2. GF2; 3. GF3; 4. GF4; 5. GF5; 6. GF6; 7. GF7; 8. GF8.

Observa-se que nas frações de gel filtração de Q500, tanto em Sepharose 4FF quanto em Sepharose 6FF, que as bandas de alta massa molecular estão em alturas próximas às banda da gel filtração de plasma, indicando Q500 contém ainda FvW formando complexos de tamanho semelhante ao encontrado no plasma. Mas este dado requer mais experimentos para ser confirmado.

A diferença observada entre as quantidade de amostras das gel filtrações de Q500 se deve a diferença de coleta das frações de eluição Sepharose 4FF e 6FF; entretanto, o padrão observado é muito parecido.

Essas observações confirmam a diferença na distribuição de FvW de tamanhos variados nas frações de eluição da gel filtração. Considerando que o FVIII está protegido por molécula(s) de FvW, sugere-se que o FVIII eluído nas frações iniciais de gel filtração está complexado com FvW de alta massa molecular, enquanto que o FVIII eluído nas frações seguintes está complexado com moléculas de baixa massa molecular de FvW; provavelmente por causa da concentração de NaCl no tampão de eluição da cromatografia de troca iônica.

Comparando as resinas Sepharose 4FF e Sepharose 6FF, os resultados indicam que a fração Q500 contém complexos FVIII / FvW de diferentes tamanhos e que na resina Sepharose 6FF, por ser indicada para separação de proteínas menores, parte dos complexos que estavam no segundo pico da Sepharose 4FF eluíram na frente, separando o complexo FVIII / FvW mais eficientemente.

5.2 Clonagem de fragmentos gênicos de FVIII para expressão de proteína recombinante, obtenção de anticorpos contra fragmentos de FVIII e análise das frações cromatográficas por "western blot"