semi-quantitativa em cercária, esquistossômulos de 3 horas, 18,5 horas, 24 horas, 3 dias, verme adulto e ovos.
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3.1) Obtenção das formas evolutivas do S. mansoni (vermes adultos, cercárias e ovos)
O ciclo biológico do S. mansoni, cepa LE é rotineiramente mantido no Moluscário "Lobato Paraense" do Centro de Pesquisa René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) em Belo Horizonte/MG.
Os vermes adultos foram perfundidos do sistema porta-hepático de camundongos da linhagem Swiss Webster após 50 dias de infecção com aproximadamente 100 cercárias inoculadas na via subcutânea, conforme descrito por Smithers S.R. & Terry R.J., (1965).
Os ovos do S. mansoni presentes nos fígados de 30 camundongos infectados foram obtidos após perfusão dos vermes adultos. Os fígados foram picados e colocados em um béquer contendo solução salina 1,7% e deixados a 4ºC por 24 horas. Em seguida o material foi incubado a 37ºC em banho-maria por 2 horas e homogeneizado, com o auxílio de um liquidificador na rotação máxima por 5 minutos. A velocidade do liquidificador foi reduzida para a rotação média e nova homogeneização foi realizada por mais 3 minutos. O homogenato foi lavado através da emissão de jatos de salina 1,7% sob a amostra, utilizando para isto um borrifador. Após a lavagem a mistura foi passada em duas peneiras próprias para separar os ovos do “macerado” de fígado. Depois desta etapa a amostra foi acondicionada em 3 cálices de vidro de 500 mL, e incubada novamente a 4ºC por uma hora para a sedimentação dos ovos. Passada a etapa de sedimentação, as fibras foram removidas por aspiração, os ovos ressuspendidos em salina 1,7% e distribuídos em tubos Falcon de 50 mL. Vários processos de lavagens dos ovos com salina 1,7% foram realizados, seguidos de centrifugação a 4ºC a 1200 x g por 3 minutos e posterior aspiração do sobrenadante.
Os ovos maduros foram separados dos ovos imaturos e dos hepatócitos através de um gradientes descontínuos de PercollTM (Amersham Biosciences) preparado de acordo com o seguinte procedimento: 6 mL de Percoll e 4 mL de RPMI, a amostra contendo os ovos foi cuidadosamente distribuída no gradiente de Percoll. A separação dos ovos maduros ocorreu devido à diferença de densidade entre ovos maduros (mais densos), ovos imaturos e restos celulares de fígado (menos denso). Foi realizada uma centrifugação do gradiente a 1200 x g durante 5 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi
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descartado e os ovos maduros submetidos a sucessivas lavagens com meio RPMI 1640 (INVITROGEN) seguido de centrifugações por 30 segundos a 1200 x g até completa remoção do Percoll. Os ovos purificados foram estocados a -70°C até o momento do uso.
As cercárias foram obtidas de caramujos B. glabrata infectados através de um processo de eliminação induzido artificialmente. Em um béquer com 200 mL de água declorada aquecida a 28ºC foram colocados 50 caramujos e estes expostos à luz branca fria em uma estufa a 25ºC. Depois de duas horas de exposição dos moluscos a luz, as cercárias eliminadas foram recolhidas. Após centrifugação por 10 minutos a 12.000 x g, uma alíquota das cercárias foi armazenada a -70ºC até o momento de uso.
3.2) Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos in vitro
Aproximadamente 100.000 a 150.000 cercárias foram obtidas segundo o procedimento anteriormente descrito. Processos de lavagens com água declorada foram realizados para a limpeza dos resíduos dos caramujos. As cercárias foram transferidas juntamente com a água declorada para um béquer previamente gelado e após duas horas de incubação em banho de gelo obteve-se um sedimento. O sobrenadante foi removido e descartado com o auxílio de uma pipeta e o sedimento de cercárias transferido para 4 tubos do tipo Falcon de 50 mL. Em cada tubo foi adicionado 25 mL de água declorada e o material foi novamente sedimentado por 15 minutos em banho de gelo. O sobrenadante foi retirado com o auxílio de uma pipeta e o procedimento repetido por mais duas vezes ou até o sedimento de cercárias ficar completamente sem resíduos. Na última lavagem foi adicionado meio de cultura RPMI 1640 (INVITROGEN). Os sedimentos de cercárias contidos nos tubos tipo Falcon de 50 mL foram concentrados em um único tubo e o sobrenadante retirado deixando apenas um volume final de 5 mL. O processo de transformação de cercárias em esquistossômulo foi realizado utilizando o método descrito por Ramalho-Pinto F.J. et al., (1974). As cercárias, 100.000 a 150.000, contidas em 5 mL de meio RPMI tiveram as caudas quebradas mecanicamente pela homogeneização com auxílio de um vortex em velocidade máxima por 3 minutos. A separação dos corpos cercarianos das caudas foi realizada mediante três lavagens seguidas por sedimentação. Os corpos cercarianos, agora chamados
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esquistossômulos, concentraram-se ao fundo do tubo tipo Falcon e as caudas suspensas no sobrenadante foram descartadas.
Os esquistossômulos foram transferidos para um frasco de cultura de 75 cm2 e a ele acrescentado 30 mL de meio de cultura RPMI suplementado com 100 U/mL de penicilina e 100 g/mL de estreptomicina. Em seguida a cultura foi incubada em estufa de CO2 a 5% a 37°C por 3 horas, tempo necessário para completar a transformação. Após esse período, 28 mL de RPMI contendo caudas cercarianas foram retirados e descartados. Os outros 2 mL foram transferidos para dois tubos de poliestireno estéreis (tipo eppendorf). Os esquistossômulos foram submetidos a sucessivas lavagens (10 a 12) com meio RPMI, seguidas por sedimentação com intervalos de 4 minutos e remoção das caudas remanescentes suspensas no sobrenadante. Posteriormente todo o sobrenadante foi removido e o pellet contendo os corpos cercarianos (neste momento os parasitos foram considerados larvas de 3 horas), sem as caudas, foi estocado em tubo de poliestireno estéril (tipo eppendorf) e armazenado a -70°C até o momento do uso.
O cultivo dos esquistossômulos durante os tempos 18,5 horas, 24 horas e 3 dias foi realizado em placas de 6 poços contendo 8 mL do meio rico M169 (Tabela 1) e 10% de soro fetal bovino. A coleta das larvas após cada período de cultivo consistiu primeiro na avaliação da esterilidade da preparação (detecção de contaminação por fungos ou bactérias) com auxílio de microscópio, seguido de aspiração dos esquistossômulos utilizando pipeta de vidro estéril de 25 mL para tubos Falcon de 50 mL. Os parasitos foram centrifugados durante 10 minutos a 10.000 x g/4ºC. O resíduo celular contendo as larvas foi transferido para tubo de poliestireno estéril (tipo eppendorf) de 1.5 mL e armazenados a -70ºC até o momento de uso.
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Tabela 1- Composição do meio 169
Componentes Concentração
Meio líquido BME (Eagle) __
Hidrolisado de lactoalbumina 0,1% Glicose 0,1% Hipoxantina 5 X 10-7M Serotonina 1 X 10-6M Hidrocortisona 1 X 10-6M Triiodotironina (T3) 210-7M
Meio Mínimo Vitamina 0,5%
Meio Schneider 5%
3.3) Extração de DNA genômico
Para a extração do DNA genômico de S. mansoni foram utilizadas cerca de 100.000 cercárias. O protocolo adotado foi descrito por Costa P.I. (Tese de doutorado, 1997), apresentando neste trabalho algumas modificações.
As cercárias armazenadas previamente a -70ºC foram ressuspensas em 500 µL de tampão de extração (Tris 50 mM , EDTA 1 mM, pH 7,5 e 1% de N-Laurilsarcosina). A amostra foi incubada a 37ºC por 16 horas contendo 50 µL de proteinase K 20 mg/mL. Posteriormente foram adicionados 250 µL de NaCl 5M à amostra e outra incubação a 65ºC foi realizada por 10 minutos. Para a desproteinização da amostra foi adicionado 100 µL de brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB)/NaCl 10%, após 20 minutos de incubação a 65ºC as proteínas foram extraídas com igual volume de clorofórmio e separadas por centrifugação a 12.000 x g por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para outro tubo de poliestireno estéril (tipo eppendorf) e o DNA precipitado com igual volume de isopropanol, seguido de incubado por 30 minutos à temperatura ambiente. Depois de centrifugar a amostra por 15 minutos, na temperatura ambiente a 12.000 x g, o pellet foi lavado uma vez com etanol 70%, foi secado e a ele
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adicionado 60 µL de água milli-Q estéril. O DNA genômico foi incubado durante uma noite a 37° C e na manhã seguinte uma alíquota de 5 L, analisada em gel de agarose 0,5% em eletroforese a 90 volts. A Figura 6 mostra uma preparação típica de DNA genômico obtido utilizando o protocolo descrito acima.
A quantificação da amostra foi obtida por espectrofotometria com leitura em densidade ótica de 260 e 280 nm. A pureza da preparação de DNA genômico foi estimada utilizando a relação A260 /A280 nm.
3.4) Extração de RNA total
Após a obtenção do material biológico (vermes adultos, cercárias, ovos e esquistossômulos de 3 horas, 18,5 horas, 24 horas e 3 dias) o RNA total foi extraído, utilizando Trizol (Invitrogen), como descrito abaixo.
Aproximadamente 100 mg de vermes adultos foram homogeneizados em vortex, na rotação máxima, contendo 1,0 mL de Trizol LS (Invitrogen) e incubados a temperatura ambiente por 60 minutos. A cada 15 minutos novas homogeneizações em vortex foram realizadas até a completa solubilização dos vermes. Para que a amostra não apresentasse contaminação com DNA genômico, a mistura foi passada 10 vezes em uma seringa descartável (10 mL/25 x 8) com agulha, para fragmentar o DNA, facilitando assim sua separação do RNA durante os procedimentos de extração. Em seguida, foram adicionados 200 µL de clorofórmio à amostra e realizada uma agitação moderada com o auxílio de vortex durante 1 minuto. Posteriormente, uma incubação
Figura 6 - DNA genômico de cercária de S. mansoni analisado em gel de agarose 0,5% corado com brometo de etídio. Foram aplicados no gel 5 l da amostra de DNA contendo aproximadamente 1,7 g.
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por 20 minutos a temperatura ambiente foi realizada e a amostra foi centrifugada a 12.000 x g durante 10 minutos.
Após centrifugação três fases foram observadas, a fase aquosa foi transferida para um tubo de poliestireno estéril (tipo eppendorf) e a ela adicionados 500 µL de isopropanol para a precipitação do RNA total. O tubo foi invertido por três vezes cuidadosamente, incubado a temperatura ambiente por 30 minutos e centrifugado a 12.000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com etanol 70% gelado seguido de nova centrifugação por 10 minutos a 12.000 x g. Novamente o sobrenadante foi descartado e o RNA foi seco a temperatura ambiente em fluxo laminarpor 15 minutos. O RNA total foi ressuspenso em 30 µL de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) e incubado por 10 minutos a 56° C.
Para a extração de RNA total das fases larvais do ciclo do S. mansoni, foram utilizadas cerca de 150.000 cercárias, 100.000 esquistossômulos e 5.000 ovos. Na extração de RNA total de esquistossômulos utilizamos glicogênio a 40 g/mL para co- precipitar o RNA das amostras juntamente com o isopropanol. E na extração de RNA total de ovos após a adição do Trizol a mistura foi congelada em nitrogênio líquido e levada ao vortex por três vezes para romper as cascas dos ovos e garantir uma boa extração do RNA.
A qualidade do RNA total foi avaliada em gel de agarose-formaldeído 1%. Para a preparação do gel, inicialmente 600 mg de agarose foram dissolvidos em 40,0 mL de água DEPC autoclavada. Em outro recipiente, foram adicionados: 12,8 mL de água DEPC, 6,0 mL de MOPS 10X concentrado (MOPS, acetato de sódio diidratado, EDTA tetrassódico, água DEPC completando para um volume final de 500 mL), 1,2 mL de formaldeído e 0,5 L de brometo de etídio. A solução foi misturada à agarose e deixada em repouso até completa solidificação. As amostras foram previamente desnaturadas em tampão (formamida, formaldeído, MOPS 1X, azul de bromofenol, água DEPC e brometo de etídio), incubadas por 15 minutos a 65°C, deixadas em banho de gelo durante 3 minutos e aplicadas no gel. As condições de realização da eletroforese foram: 80 volts em tampão de corrida (MOPS 1X) por aproximadamente 75 minutos. A Figura 7 mostra uma preparação típica de RNA total, obtido como descrito acima.
A quantificação das amostras também foi realizada por espectrofotometria, com leitura em densidade ótica de 260 e 280 nm e a pureza dos RNAs totais foi estimada utilizando a relação A260 /A280 nm.
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3.5) Oligonucleotídeos iniciadores específicos para os genes DUB5, DUB14 e DUB16 (deubiquitinating enzyme)
Os oligonucleotídeos iniciadores específicos para os genes DUB5, DUB14 e DUB16 (deubiquitinating enzyme), foram idealizados no programa GenneRunning. As seqüências utilizadas são originadas do banco de dados da FAPESP (Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo), que foi criado através do consórcio de sequenciamento do transcriptoma de S. mansoni.
Durante a análise das seqüências optamos por desenhar iniciadores, cujos produtos, cobrissem a maior parte das seqüências das enzimas desubiquitinadoras em estudo. Na Tabela 2 estão listados os iniciadores gerados pelo programa Genne Running e seus respectivos número de acesso (Contig).
Tabela 2 - Oligonucleotídeos iniciadores gerados de DUB5, DUB14 e DUB16
Enzima Contig F (direto)
R (Reverso) Produto Esperado (nt) DUB 5 607508.1 (F) 5'ACAAGCACACAAGAGCAG3' (R) 5'ATCTTCCACTGATGCTGG3' 550 DUB 14 609068.1 (F) 5'GCTTATTCCACGGAAGAC3’ (R) 5'GTTGCAATTCAGGCGTAC3' 844 DUB 16 608180.1 (F) 5'GGCTGTTTAGATCAGTGC3' (R) 5'GGGAACAGAACAGAAAGG3' 882 Figura 7 – Extração de RNA total das fases evolutivas de S.
mansoni. Gel de agarose/formaldeído 1% contendo em cada canaleta aproximadamente 5 g de RNA total. (E) abreviatura de esquistossômulos e (h) horas.
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Para validar os iniciadores gerados, PCR’s (Polimerase Chain Reaction) foram realizadas para amplificar os possíveis genes das enzimas desubiquitinadoras 5, 14 e 16. O DNA genômico de cercária foi utilizado como DNA molde para a reação.
Cada reação de amplificação foi realizada em tubo ependorff de 200µl, contendo aproximadamente 350 ng de DNA genômico, 10 mM de cada dNTP’s (dATP, dCTP, dTTP, e dGTP - Promega), 50 mM de MgCl2, 5 picomoles de cada oligonucleotídeo (direto e reverso), 2,5 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 1X do tampão PCR 10X concentrado sem Mg+2; completando o volume da reação com água milli-Q para 50 µl.
Depois de vários testes as temperaturas de anelamento das DUB’s foram padronizadas em 49ºC para DUB 5 e DUB 16, e 47ºC para DUB 14. A seguinte ciclagem foi utilizada nas reações de amplificação: após uma desnaturação inicial de 2 minutos a 95ºC um programa de 35 ciclos foi estabelecido, com desnaturação a 95ºC por 1 minuto, anelamento a 49ºC (DUB 5 e 16) ou 47ºC (DUB 14) por 1 minuto, extensão por 90 segundos a 72ºC e uma elongação final de 6 minutos a 72ºC.
Os produtos das PCR’s foram aplicados em gel de agarose 1,2% (90 volts – 75 minutos), a temperatura ambiente, juntamente com o padrão de peso molecular 100pb DNA Ladder (Invitrogen). O gel foi corado com brometo de etídio, observado ao transiluminador (Vilber Lourmat) e fotografado.
3.6) RT-PCR (Reverse- Transcription Polimerase Chain Reaction)
Para a confirmação dos genes preditos DUB 5, DUB 14 e DUB 16, através do sequenciamento, foi obtido o cDNA a partir de mRNA do verme adulto de S. mansoni. As técnicas utilizadas para a obtenção deste cDNA estão detalhadas a seguir.
A partir do RNA total obtido de verme adulto foi sintetizada uma fita simples de cDNA pela atividade da enzima transcriptase reversa (Thermoscript RT- PCR System - Invitrogen), seguindo as recomendações dadas pelo fabricante. Inicialmente foram utilizados aproximadamente 5 µg de RNA total, 50 pmol de oligodT, 10 mM de dNTPs e água livre de RNAse para um volume final de 10 µL. A desnaturação do RNA foi realizada através da incubação da mistura a 65°C em termociclador (ThermoHybaid)
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durante 5 minutos, seguida de banho de gelo por 1 minuto. Em seguida, foi adicionado o tampão da enzima, 0,1 M de DTT (ditiltreitol) e 15 unidades da enzima transcriptase reversa. Posteriormente, essa mistura foi incubada em termociclador a 37°C durante 60 minutos, seguida de outra incubação a 85°C por 5 minutos. Finalizando a reação foi acrescentado 1,0 µL de RNAse H e a amostra incubada por 20 minutos a 37ºC para a digestão do RNA utilizado como molde. A amostra foi estocada a -20°C até o momento do uso.
No intuito de obter o cDNA fita dupla, amplificações foram realizadas utilizando 2µL do cDNA de verme adulto de S. mansoni, combinados com os oligonucleotídeos específicos para a amplificação dos genes DUB 5, DUB14 e DUB 16. Nestas reações de amplificações foram utilizados os parâmetros previamente estabelecidos para os genes de DUB, como descrito no item 3.5.
3.7) Purificação e clonagem dos produtos das PCR’s
Os produtos das PCR’s gene específicas foram purificados através da adição de 1/10 de acetato de sódio 3M pH 7.0 por tubo e dois volumes de etanol absoluto, sendo em seguida incubados a -20ºC por 30 minutos. Após centrifugação a temperatura ambiente por 10 minutos a 12.000 g, o sobrenadante foi descartado e o pellet lavado com 500µl de etanol 70%. Depois de centrifugado nas mesmas condições que a etapa anterior, o etanol 70% foi descartado e o pellet ressuspendido em 50 µl de água milli-Q estéril.
As reações de ligação dos produtos de PCR purificados DUB5, DUB14 e DUB16 ao vetor pGEMT Easy (Promega) foram realizadas conforme orientações do fabricante. Foram utilizados 3 µL do produto de PCR (150 ng/µL) por reação de ligação que foi incubada por 16 horas a 4°C.
3.8) Obtenção de células competentes para transformação
As bactérias E.coli – DH5 α utilizadas em experimentos de transformação foram tornadas competentes de acordo com o método Pipes (Hanahan, D., 1985).
Bactérias E.coli – DH5 α não competentes, armazenadas a -70°C foram descongeladas em banho de gelo e 50 µl foram expandidos em 5 mL de meio não
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seletivo (sem antibióticos) Luria-Bertani caldo (10 g de NaCl; 5 g de extrato de levedura; 10 g de tryptona). Este meio foi suplementado com 50 µL de MgSO4 1 M, 50 µL de MgCl2 1 M e incubado a 37°C por 16 horas sobre agitação orbital de 200 x g (agitador - B. Braum Biotech International). Uma alíquota de 250 µL desta cultura foi expandida em um tubo tipo Falcon contendo 50 mL de meio SOB (20 g triptona, 5 g extrato de levedura, 0,58 g NaCl, 0,2 g KCl pH 7,5, com KOH para 1 litro), onde foi adicionado 250 µL de MgSO4 1 M e 250 µL de MgCl2 1 M. A cultura de bactérias foi incubada a 37°C sob agitação orbital de 270 x g, por 2 horas, ou até atingir uma leitura em densidade ótica de 600 nanômetros (espectrofotômetro Metrolab 1700 U.V. visível). Ao atingir DO 600 entre 0,4 e 0,6 nm a cultura foi incubada em banho de gelo por 30 minutos e centrifugada a 4°C 3.000 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado celular ressuspendido em 10 mL de tampão Pipes (CaCl2 60 mM, 100 mL de água destilada, 10 mM Pipes, 15% de Glicerol pH 7.0) gelado. A suspensão de células foi novamente centrifugada a 4°C 2.000 x g por 10 minutos e o sobrenadante descartado, esta etapa foi repetida por mais duas vezes. As células foram ressuspendidas em mais uma vez em tampão Pipes e incubadas em banho de gelo por 30 minutos, após este intervalo outra centrifugação a 4°C 2.000 x g por 10 minutos foi realizada. O precipitado bacteriano foi resuspendido com 1,2 mL de tampão Pipes, alíquotas de 200µl foram colocadas em tubo de poliestireno estéril (tipo eppendorf) e mantidas no gelo para proceder à transformação.
3.9) Transformação de bactérias E. coli DH5 αααα
Os plasmídios recombinantes foram introduzidos em bactérias competentes da linhagem DH5α como descrito a seguir.
Aos tubos de poliestireno estéril (tipo eppendorf) contendo as células E.coli DH5 α competentes foram colocados, em cada tubo, aproximado de 5 µL daconstrução plasmidial pGEMT-Easy/DUB5, pGEMT-Easy/DUB14 e pGEMT-Easy/DUB16 e levados a banho de gelo por 30 minutos seguido por um choque térmico de 42°C por exatamente 90 segundos e novamente incubados no gelo por 2 minutos. Foi adicionado 1 mL de Luria-Bertani caldo (LB caldo) por tubo e as amostras incubadas por 90 minutos a 37°C sob agitação orbital de 270 x g. Após a incubação 100µl da cultura foi plaqueado em Agar Luria – Bertani (LB) contendo 100 µg/mL de ampicilina, IPTG 200
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mg/mL e 40 mg/mL de Xgal (LB-XIA), de acordo com Maniatis. As placas foram incubadas a 37°C durante a noite e os clones recombinantes foram identificados pela seleção azul/branca.
Controles negativos com o plasmídio sem o inserto foram preparados em paralelo para descartar a possibilidade de contaminação e um controle positivo que atesta a eficiência das células competentes foi realizado utilizando o plasmídio PUC 18. As colônias brancas que cresceram foram coletadas isoladamente e inoculadas em 1 mL de LB caldo contendo 100 µg/mL de ampicilina em tubos de poliestireno estéreis (tipo eppendorf) e incubados a 37°C sob agitação orbital de 220 x g durante a noite. Em seguida, após adição de 30% do volume de glicerol, foram armazenadas a - 70°C.
Para verificar a presença dos insertos nos transformantes, PCR das colônias foram realizadas utilizando como DNA molde cerca de 2 µl da cultura de cada clone obtido. Os produtos das PCR’s foram aplicados em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etídio que está representado na Figura 8.
3.10) Mini-preparação dos plasmídios recombinantes
Cerca de 50 L de cultura de cada clone recombinante obtidos como descrito anteriormente foram crescidos em 5 mL de LB/ampicilina, durante a noite sob agitação orbital a 37°C. Aproximadamente 3 mL foram retirados da cultura bacteriana de cada clone, transferidos para tubos de poliestireno e centrifugados a 14000 x g a temperatura ambiente por 3 minutos. Os precipitados foram homogeneizados em 300 µL de GTE/RNAse (500 mM TRIS-HCl; 10 mM EDTA; 100 µg de RNAse A; pH 8,0) e
DUB 5 DUB 14 DUB 16
Figura 8 – PCR das colônias. Nas canaletas de 1 a 5 foram aplicadas alíquotas dos produtos de PCR de 5 transformantes contendo o gene DUB 5. Nas canaletas 6 a 10 pode ser verificada a presença do gene DUB 14 nos transformantes e de 11 a 15 também há amplificações para o gene DUB 16. PM – 100pb (Invitrogen)
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incubados durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente foram adicionados em cada tubo 300 µL de NaOH/SDS (200 mM NaOH e SDS 1%) e nova incubação, agora em banho de gelo, foi realizada durante 5 minutos. Em seguida, foram adicionados 300 µL KOAc (acetato de potássio 3 M em pH 5,5) à mistura que foi incubada novamente em banho de gelo por 5 minutos e centrifugada a 4°C durante 10 minutos a 14000 x g. Os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos onde foram adicionados 500 µL de isopropanol para a precipitação dos DNAs plasmidiais. As amostras foram incubadas a temperatura ambiente por 20 minutos e centrifugadas novamente a 14000 x g por 15 minutos. Após o descarte dos sobrenadantes os pellets foram lavados com etanol 70% e centrifugados durante 5 minutos a 14000 x g. Os sobrenadantes foram descartados, os precipitados secos a temperatura ambiente e ressuspensos em 50 µL de água milli-Q. Uma alíquota de 5 µL de DNA plasmidial obtido para cada clone foi aplicada em gel de agarose 0,8%. A Figura 9 mostra uma preparação típica, utilizando o protocolo descrito acima.
3.11) Sequenciamento
Para determinar a seqüência de nucleotídeos de DUB5, DUB 14 e DUB 16 inseridas nos plasmídios recombinantes pGEMT Easy, foram realizadas reações de sequenciamento segundo os procedimentos descritos no manual de instrução do fabricante do Kit BIG-DYE Terminator 3.0 (Applied Biosystems), que segue o método de Sanger (1977).
Os oligonucleotídeos iniciadores M13, direto (GTAAAACGACGGCCAGT) e reverso (CAGGAAACAGCTATGAC) foram utilizados para a amplificação em termociclador por 40 ciclos, nas seguintes condições: 95ºC por 5 segundos, anelamento