Análise da comunidade bacteriana por meio do sequenciamento parcial do gene 16S

4.2.1.4.1 Construção da biblioteca de amplicons do gene 16S rRNA de Bacteria e sequenciamento

Foram selecionadas quarenta amostras obtidas de solo e rizosfera de Cereus jamacaru, durante o período chuvoso e de seca, para os cindo pontos de coleta, sendo utilizadas duas repetições por amostra (tabela 4.4).

Tabela 4.4 - Amostras selecionadas para análise, obtidas de solo (S) e rizosfera de Cereus jamacaru (RZ), para o período chuvoso (C) e de seca (S), para os cinco pontos de coleta, onde o primeiro número refere-se ao ponto e o segundo número à repetição. Ex.: 1.2 RZS (Ponto 1, repetição 2, rizosfera, período de seca). Para cada amostra foi atribuído um tag (identificação) composto por 5 pares de bases (pb) –

barcode

O DNA metagenômico de cada amostra foi amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores 967F (CAA CGC GAA GAA CCT TAC C) e 1046R (CGA CAG CCA TGC ANC ACC T) flanqueadores da região V6 do gene 16S rRNA (SOGIN et al., 2006), entretanto, foi sintetizado um oligonucleotídeo iniciador 967F diferente para cada amostra, adicionando um tag de identificação (tabela 4.4) (barcode) composto por cinco pares de bases, que serviu para identificar a origem de cada uma das sequências, além disso, também foi adicionado o oligonucleotídeo adaptador AF (CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG

Amostras Tag Barcode (5 pb)

1.2 SC 1 GATCT 1.3 SC 2 ATCAG 2.2 SC 3 ACACT 2.3 SC 4 AGCT 3.2 SC 5 CACAC 3.3 SC 6 ACAGA 4.2 SC 7 AGATG 4.3 SC 8 CACTG 5.2 SC 9 CAGAG 5.3 SC 10 CGCAG 1.2 SS 11 CTGTG 1.3 SS 12 GTGAG 2.2 SS 13 TCATG 2.3 SS 14 AGCAT 3.2 SS 15 CAGCT 3.3 SS 16 CATGT 4.2 SS 17 CTGAT 4.3 SS 18 CTGCA 5.2 SS 19 GATGA 5.3 SS 20 TACGC 1.2 RZC 21 ACTGC 1.3 RZC 22 GTCAC 2.2 RZC 23 CGTAC 2.3 RZC 24 TGCGT 3.2 RZC 25 CGACG 3.3 RZC 26 CTACT 4.2 RZC 27 TGACT 4.3 RZC 28 GACAG 5.2 RZC 29 ATGCT 5.3 RZC 30 TCGTC 1.2 RZS 31 TATAC 1.3 RZS 32 ACGAC 2.2 RZS 33 TGTAG 2.3 RZS 34 TCGAG 3.2 RZS 35 TAGTG 3.3 RZS 36 CGAGT 4.2 RZS 37 ATACG 4.3 RZS 38 ACTCG 5.2 RZS 39 TCTGT 5.3 RZS 40 TCGCT

ACT CAG) em cada um, conforme manual do fabricante do sequenciador Ion Personal Genome Machine™ (PGM™) (Ion Torrent, Life Technologies). Já o oligonucelotídeo 1046R recebeu o adaptador 1R (CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT). Cada biblioteca de amplicon foi gerada por meio da reação de amplificação em solução contendo 5,0 μL de tampão da enzima Dream Taq; 1,0 μL de dNTP (2,5 mM); 0,5 μL de cada oligonucleotídeo iniciador; 1,0 μL de Dream Taq (Fermentas); 1 μL de DNA metagenômico de cada amostra; água ultrapura (Milli-Q) autoclavada para um volume final de 49 μL. Para cada amostra foram feitas duas reações. As reações de amplificação foram realizadas em termociclador (Applied Biosystems) segundo as condições: desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos; 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 57°C por 45 segundos e 72°C por 1 minuto; extensão final de 10 minutos a 72°C (SOGIN et al., 2006). Após verificação da qualidade das amostras em gel de agarose 1,5% (p/v). Após a eletroforese, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (1,0 mg.mL-1) e fotografado. As duas reações de cada amostra foram unidas e utilizadas para purificação de 50 µL de cada biblioteca utilizando 90 µL de Agencourt® AMPure® XP Reagent e estante magnética, de acordo com protocolo fornecido por Life Technologies - Ion Amplicon Library Preparation (Purify the amplicon libraries) (www.iontorrent.com). Após purificação das bibliotecas, foi realizada a quantificação por meio do NanoDrop (Thermo Scientific) e a concentração de todas elas foi ajustada e foi preparado um pool equimolar (26 ρM) de todas as bibliotecas, de onde 18 µL deste pool foram utilizados para a reação de amplificação de emulsão (PCR de emulsão), onde os fragmentos nas bibliotecas de amplicons foram ligados a esferas, de acordo com protocolo fornecido por Life Technologies - Ion PGM™ 200 Xpress™ Template Kit (www.iontorrent.com). Após recuperação das esferas, foi feito enriquecimento e logo em seguida foi feito o preparo e carregamento das esferas no chip 314 e posterior sequenciamento (Ion Sequencing Kit User Guide v2.0) no sequenciador Ion Personal Genome Machine™ (PGM™) (Ion Torrent, Life Technologies).

4.2.1.4.2 Análise das sequências

A manipulação inicial das sequências foi realizada por meio da plataforma Galaxy online (https://main.g2.bx.psu.edu/root), onde os dados brutos obtidos no sequenciador Ion Personal Genome Machine™ (PGM™) (Ion Torrent, Life Technologies) foram convertidos em sequência no formato fasta para que pudessem ser manipuladas.

Para classificação das sequências obtidas utilizou-se o algoritmo Classifier do Ribosomal Database Project (RDP), com "cutoff" de 50% por tratar de sequências menores

que 250 pb. Este algoritomo compara cada sequência do gene 16S rRNA com sequências depositadas em um banco de dados. Segundo Shokralla et al. (2012) ao comparar as sequências obtidas com uma biblioteca de referência de organismos conhecidos, táxons presentes em amostras ambientais podem ser identificados com grande convicção. Foram realizadas análises de correlação entre algumas variáveis com alguns grupos bacterianos obtidos, por meio do programa Assistat 7.6 beta (SILVA; AZEVEDO, 2002). Além disso, as sequências também foram trabalhadas no servidor online Metagenomics Analysis Server (MG-RAST) (MEYER et al., 2008) (http://metagenomics.anl.gov/) que fornece os dados tabulados, possibilitando a comparação por meio do programa STAMP (Statistical Analysis of Metagenomic Profiles) (PARKS; BEIKO, 2010), que realiza uma análise estatística das sequências obtidas nas amostras, servindo para indicar grupos mais abundantes de modo estatístico, mostrando diferenças relevantes nas comunidades.

Para as análises multivariadas, foram elaboradas matrizes com os dados de frequência relativa dos grupos obtidos para as amostras com os dados de análise de solo e dados sobre precipitação (mm), temperatura máxima (°C) e umidade relativa do ar (%) (variáveis ambientais). Com esse conjunto de dados, foi primeiramente realizada uma análise de correspondência (Detrended Correspondence Analysis – DCA) para verificar o comprimento do gradiente e decidir qual análise usar: Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis – PCA) ou Análise Canônica (Canonical Analysis – CA) (sem as variáveis ambientais) e Análise de Redundância (Redundancy Analysis – RDA) ou Análise de Correspondência Canônica (Canonical Correspondence Analysis – CCA) (com as variáveis ambientais) utilizando o programa Canoco 4.5 (TER BRAAK; SMILAUER, 2002). Foi aplicada análise de RDA, com teste de significância realizado pelo teste de permutação não- paramétrico de Monte Carlo com 499 permutações, oferecendo informações suplementares sobre os efeitos das variáveis ambientais, quantificando a variância explicada por cada fator independentemente (lambda) (DIAS et al., 2011). Foi feito o teste de SIMPER (Similarity Percentage) para pesar a contribuição de cada filo na similaridade/dissimilaridade entre as amostras (MESEL et al., 2004).