VEGF Actina * # *# # *# * *# # #$ *#$ Sorafenibe Echinácea
Renata Cristina Tornelli Tassetano Para a análise de eficiência foram realizadas diluições seriadas do RNAm das células de sarcoma uterino resistentes à doxorrubicina nas concentrações de 31,2, 62,5, 125, 250 e 500ng. Essas concentrações escolhidas devem-se ao fato de que a concentração de uso nos experimentos foi 125 ng. As amostras foram amplificadas em duplicata. Os valores quantitativos foram obtidos a partir do ciclo limiar ou cycle threshold (Ct), onde o aumento do sinal associado ao crescimento exponencial dos produtos de PCR começa a ser detectado.
Foi verificada a especificidade da reação de RT-PCR realizando-se a curva de dissociação. A reação foi específica para o produto de PCR analisado, mostrando apenas um pico (figura 11).
Figura 11. Curva de dissociação do gene MDR. Na abscissa observa-se a temperatura em graus Celsius e na ordenada observa-se a intensidade de fluorescência.
A figura 12 demonstra a regressão linear semi-log do valor do CT em
Renata Cristina Tornelli Tassetano do gene MDR foi 102%.
Figura 12. Regressão linear semi-log do valor do CT em comparação ao log da quantidade
inicial de RNAm para o gene MDR.
4.5.2. LRP
Foram realizadas diluições seriadas do RNAm das células de sarcoma uterino resistentes à doxorrubicina nas concentrações de 31,2, 62,5, 125, 250 e 500 ng. As amostras foram amplificadas em duplicata. Realizou-se a curva de dissociação e reação foi específica para o produto de PCR analisado, mostrando apenas um pico (figura 13).
Renata Cristina Tornelli Tassetano
Figura 13. Curva de dissociação do gene LRP. Na abscissa observa-se a temperatura em graus Celsius e na ordenada observa-se a intensidade de fluorescência.
A figura 14 demonstra a regressão linear semi-log do valor do CT em
comparação ao log da quantidade inicial de RNAm. A eficência de amplificação do gene LRP foi 103%.
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inicial de RNAm para o gene LRP.
4.5.3. MRP
Realizou-se diluições seriadas do RNAm das células de sarcoma uterino resistentes à doxorrubicina nas concentrações de 31,2, 62,5, 125, 250 e 500 ng. As amostras foram amplificadas em duplicata.
Foi verificada a especificidade da reação de RT-PCR realizando-se a curva de dissociação. A reação foi específica para o produto de PCR analisado, mostrando apenas um pico (figura 15).
Figura 15. Curva de dissociação do gene MRP. Na abscissa observa-se a temperatura em graus Celsius e na ordenada observa-se a intensidade de fluorescência.
Renata Cristina Tornelli Tassetano A figura 16 demonstra a regressão linear semi-log do valor do CT em
comparação ao log da quantidade inicial de RNAm. A eficência de amplificação do gene MRP foi 98%.
Figura 16. Regressão linear semi-log do valor do CT em comparação ao log da quantidade
inicial de RNAm para o gene MRP.
4.5.4. β2-microglobulina
Foram realizadas diluições seriadas do RNAm das células de sarcoma uterino resistentes à doxorrubicina nas concentrações de 31,2, 62,5, 125, 250 e 500 ng. As amostras foram amplificadas em duplicata. Realizou-se a curva de dissociação e a reação foi específica para o produto de PCR analisado, mostrando apenas um pico (figura 17).
Renata Cristina Tornelli Tassetano
Figura 17. Curva de dissociação do gene β2-microglobulina. Na abscissa observa-se a temperatura em graus Celsius e na ordenada observa-se a intensidade de fluorescência.
A figura 18 demonstra a regressão linear semi-log do valor do CT em
comparação ao log da quantidade inicial de RNAm. A eficência de amplificação do gene β2MG foi de 90%.
Figura 18. Regressão linear semi-log do valor do CT em comparação ao log da quantidade
Renata Cristina Tornelli Tassetano 4.6. Expressão do gene MDR1, MRP e LRP em células tratadas com echinacea e sorafenibe
4.6.1. MDR
As células tratadas com echinácea e sorafenibe apresentaram diminuição significante na expressão gênica de MDR em relação aos controles em todos os períodos de tempos, sendo essa diminuição mais expressiva no grupo tratado com sorafenibe como demonstrado na tabela 8 e figura 19.
Tabela 8: Expressão relativa do gene MDR em células tratadas com Echinácea purpúrea e sorafenibe por 24, 48 e 72 horas (n=5).
Grupos Controle Echinácea Sorafenibe
24 horas 1 0,65±0,03*# 0,03±0,005*
48 horas 1 0,33±0,11*#$ 0,05±0,01*
72 horas 1 0,01±0,003*#$& 0,13±0,01*$&
Renata Cristina Tornelli Tassetano
Figura 19: Expressão relativa do gene MDR em células tratadas com Echinácea purpúrea e sorafenibe por 24, 48 e 72 horas (n=5) *P<0,001 vs CT, #P<0,001 vs sorafenibe, $P<0,001 vs 24 horas, &P<0,001 vs 48 horas.
4.6.2. MRP
Nas análises da expressão gênica de MRP, observamos diminuição da expressão em células tratadas com sorafenibe em relação ao seu controle em todos os períodos de tempos como demonstrado na tabela 9 e figura 20. As análises com echinacea não foram realizadas.
Tabela 9: Expressão relativa do gene MRP em células tratadas com Sorafenibe por 24, 48 e 72 horas (n=5).
*# * *#$ * *#$& *$&
Renata Cristina Tornelli Tassetano
Grupos Controle Sorafenibe
24 horas
48 horas 1 1 0,56±0,01
*
0,08±0,003
72 horas 1 0,01±0,003*$&
*P<0,001 vs CT, $P<0,001 vs 24 horas, &P<0,001 vs 48 horas
Figura 20: Expressão relativa do gene MRP em células tratadas com sorafenibe por 24, 48 e 72 horas (n=5) *P<0,001 vs CT, $P<0,001 vs 24 horas, &P<0,001 vs 48 horas.
4.6.3. LRP
As células tratadas com echinácea e sorafenibe apresentaram diminuição significante da expressão do gene LRP somente nos grupos 48 e 72 horas em relação ao seu controle como demonstrado na tabela 10 e figura 21. Pudemos observar também diminuição mais expressiva nas células tratadas com sorafenibe.
*
*$
Renata Cristina Tornelli Tassetano Echinácea purpúrea e sorafenibe por 24, 48 e 72 horas (n=5).
Grupos Controle Echinácea Sorafenibe
24 horas 1 1,36±0,08* 1,76±0,1*
48 horas 1 0,9±0,02*$ 0,12±0,01*
72 horas 1 0,25±0,04*#$& 0,05±0,02*$&
*P<0,001 vs CT, #P<0,001 vs sorafenibe, $P<0,001 vs 24 horas, &P<0,001 vs 48 horas
Figura 21: Expressão relativa do gene LRP em células tratadas com Echinácea purpúrea e sorafenibe por 24, 48 e 72 horas (n=5) *P<0,001 vs CT, #P<0,001 vs sorafenibe, $P<0,001 vs 24 horas, &P<0,001 vs 48 horas.
* * *$ * *#$& *$&
Renata Cristina Tornelli Tassetano
Renata Cristina Tornelli Tassetano é a sétima neoplasia mais freqüente em homens e ocupa o décimo segundo lugar entre as mulheres. O CCR constitui 85% das neoplasias malignas primárias dos rins. Apresenta uma média de incidência que varia entre 4,4 – 11,1 casos por cada 100.000 pessoas por ano nos Estados Unidos [38]. No Brasil, a incidência varia de 7 a 10 casos por 100.000 habitantes/ano [39].
A maioria dos tumores compreende adenocarcinomas originados de células tubulares proximais, mas muitos tumores malignos podem originar de outras estruturas. Muitos adenocarcinomas são do tipo células claras e é considerado o subtipo mais sensível para terapia sistêmica [5]. O CCR é uma doença de difícil manejo. A quimioterapia citotóxica, o principal tratamento para estágios avançados de muitos tumores sólidos, não tem atividade no CCR. Em estudos com mais de 50 “trials” de agentes quimioterápicos para CCR, foi observado que nenhum agente simples produz resposta maior que 6% [40]. A terapia hormonal também tem sido largamente ineficiente no tratamento do CCR. Uma revisão realizada por Bono, concluiu que o tratamento hormonal leva a uma resposta parcial menor que 5% dos pacientes. A radioterapia não é um tratamento para CCR por si, mas pode ser usada como medida paliativa em pacientes que não são indicados para cirurgia seja pela extensão da doença ou por sua condição geral. Por muitos anos, houve um link reconhecido entre o sistema imune e o CCR, e a imunoterapia e as citocinas passaram a ser esteio para o tratamento de doença avançada. Essa modalidade de tratamento oferece reprodutibilidade, mas baixa resposta [1].
As novas estratégias de tratamento incluem: anti-angiogênese, por bloqueio do VEGF (bevacizumab), inibidores de receptores tirosina quinase de VEGF
Renata Cristina Tornelli Tassetano (sunitinib ou PTK787), inibidores da via mTOR (CCI-779) e os inibidores da via Raf quinase (sorafenibe) [5]. Devido a esse déficit dos tratamentos, é cada vez maior o interesse em tratamentos complementares.
O uso de medicinas complementares e alternativas (CAM) ganhou enorme entusiasmo do público ao longo das últimas duas décadas na América do Norte. O uso do CAM é comum na população em geral, e mais ainda entre pacientes com câncer. Em pacientes pré-operatório especificamente, as taxas de uso têm sido relatados na faixa de 22% para 32%. A CAM pode ser definida como um conjunto de práticas médicas que não estejam em conformidade com os padrões da comunidade médica [41].
O sorafenibe é um inibidor tirosina quinase, oral, originalmente desenvolvido como um inibidor Raf quinase. Subseqüentemente, foi encontrada atividade contra o receptor VEGF e PDGF. Inúmeros estudos demonstraram que o sorafenibe diminuiu significantemente a viabilidade celular e aumentou a apoptose em linhagens celulares de câncer renal, de osteosarcoma e meduloblastoma, assim como interferiu na regulação da sinalização do VEGF quando usado só ou em combinação com outras drogas, via inibição de inúmeras vias [6, 42-43]. Na linha com essas observações, nossos experimentos demonstraram diminuição da viabilidade celular, assim como aumento de células em apoptose tardia, o que pode acontecer então, pela ação antitumoral do Sorafenibe.
A morte celular observada no tratamento com sorafenibe se dá principalmente por necrose secundária. A necrose secundária é um processo que afeta as células após apoptose avançada, assim as características das células necróticas secundárias são influenciadas por alterações previamente ocorridas
Renata Cristina Tornelli Tassetano indução de apoptose in vitro, inevitavelmente resulta em necrose secundária, pela falta de “scavengers”. Em organismos multicelulares a célula responde a estímulos de morte por ativação de mecanismos apoptóticos endógenos, sendo um resultado bem diferente do que é encontrado e in vitro, pois a células em organismos multicelulares, é parte de um contexto social. Assim, é desencadeado um mecanismo de eliminação celular, com a cooperação de células “scavengers” para digerir e eliminar a célula apoptótica antes da transição para necrose secundária. Esse processo de eliminação celular é ativado in vitro, mas pode não operar pela falta de “scavengers”. Isto pode levar a uma interpretação errônea de indução de necrose ativa, ou da mudança de apoptose para necrose, enquanto o evento real é a transição natural de uma apoptose em curso para uma necrose secundária [33]. A permeabilidade para o PI indica um dano à membrana citoplasmática relativamente inicial, enquanto a liberação da enzima DHL indica uma ruptura terminal da membrana [33], o que poderia explicar a diminuição do DHL, encontrado em nossos ensaios, uma vez que coradas pelo PI, demonstram que ainda existe uma membrana “quase-intacta” nas células, não havendo portanto, extravasamento da enzima DHL e de outras moléculas.
Fato parecido foi observado no tratamento das células com echinácea. Os nossos resultados demonstraram que o extrato de echinacea exerce atividade sobre a viabilidade das células Caki-1. Este fato pode se ocorrer devido a seus compostos químicos, principalmente aos poliacetilenos, onde foi provado apresentar atividade citotóxica contra diferentes tipos de câncer, como descrito por Young e cols e Matsunaga e cols [44-45]. Além disso, muitas evidências sugerem
Renata Cristina Tornelli Tassetano que os poliacetilenos promovem apoptose [46-47] e potencializa a citotoxicidade de outras drogas anti-câncer como a mitomicina C [44].
Encontramos nas células tratadas com echinácea, o mesmo perfil das células tratadas com sorafenibe, ou seja, aumento de células em necrose secundária, não seguida por aumento de DHL, indicando assim o mesmo mecanismo de ação em ambos os tratamentos.
Estudos demonstraram que os extratos lipofílicos da raiz das 3 espécies mais utilizadas exercem atividade anti-proliferativa em linhagens de células de câncer humano. A espécie Echinácea pallida apresentou atividade anticâncer mais pronunciada, comparado com as outras duas espécies devido ao seu perfil fitoquímico, De fato, a principal classe de compostos encontrados nesta espécie é o poliacetileno, poucos traços de alquilamidas que representam os principais componentes da Echinácea purpúrea e Echinácea angustifólia [11].
Como de é conhecimento, inúmeras vias de sinalização estão implicadas no desenvolvimento, sobrevida e angiogênese tumoral. Em muitos tumores humanos, ativação da via PI3K/Akt tem sido relatada. A freqüência com que a via PI3K/Akt é alterada em cânceres humanos direta ou indiretamente (por exemplo, por ativação de Ras) sugere fortemente que a ativação desta via é tão comum como a inativação de p53 e p16 [48]. Da mesma forma, uma das mais freqüentes alterações genéticas detectadas em cânceres é na família de oncogenes Ras, que tem um papel crucial no controle tanto de células normais como no crescimento de células transformadas.
Nossos resultados demonstraram redução da expressão da proteína Akt tanto nas células tratadas com sorafenibe como nas tratadas com echinácea, onde
Renata Cristina Tornelli Tassetano tratamentos, uma vez que a inibição desta via de sinalização fornece células sem sinal de sobrevida, não lhes permitindo resistir a estímulos apoptóticos [15] assim como pela ação anti-angiogênica de ambos tratamentos [15, 48-49].
Akt é considerada como uma das principais vias de transdução de sinais em resposta a fatores de crescimento e contribui para muitas funções celulares incluindo metabolismo de nutrientes, crescimento celular, regulação transcricional e sobrevida celular [15, 50].
Da mesma forma, demonstramos em nossos ensaios, que o nível de proteínas Ras mostrou-se diminuído nas células tratadas com sorafenibe e com echinácea. De fato, o sorafenibe é um inibidor da via Ras, assim seria esperado que esta proteína estivesse diminuída, diferentemente da echinacea, onde esta via era somente especulativa. O sorafenibe tem como importante alvo molecular a via Ras [51], que pode ser responsável pela ação anti-proliferativa encontrada em nossos experimentos.
Evidências suportam a noção que Akt, também está fortemente envolvida na transformação maligna das células, bem como na indução de resistência hormonal e a múltiplas drogas [52]. Nossos resultados demonstraram diminuição da expressão relativa das proteínas extrusoras, MDR, MRP e LRP. Os resultados encontrados em ambos os tratamentos foram similares, demonstrando o papel das proteínas Akt e Ras na regulação da resistência a múltiplas drogas.
Akt ativada pode afetar a expressão e regulação das respostas dos receptores hormonais e, portanto, levar à ineficácia das terapias hormonais [52], uma vez que é a mais importante mediadora de transdução de sinais para
Renata Cristina Tornelli Tassetano sobrevida de células, protegendo as células contra um grande espectro de indutores de morte celular. A fosfatase PTEN é o maior inibidor da via Akt, e dados mostraram que o status funcional do PTEN determina a resistência de células a um número de preparações quimioterapêuticas, ou seja, isso determina MDR. O papel do PTEN na MDR foi demonstrado em linhagens de células de câncer de próstata DU-145 e PC-3, onde as células PC-3 não expressam a proteína PTEN e a célula DU-145 apresenta a mesma. Nas células DU-145 a fosforilação da Akt foi inibida pelo PTEN e essa inibição foi acompanhada por aumento da sensibilidade das células (comparada às células PC-3) a diferentes drogas [18]. A ativação da via PI3K/Akt em células malignas após a exposição à radiação ou outro estresse e também como já mencionado seu efeito anti-apoptótico, indicam o importante papel desta via tanto na resistência de células malignas a agentes danificadores como na sensibilidade de tumores malignos a quimio e radioresistência [53].
Em certos tipos de câncer, a expressão da via Ras pode modular a expressão de bombas de drogas e moléculas anti-apoptóticas. Foi observado que a expressão ectópica de Raf pode aumentar os níveis tanto das bombas de drogas MDR quanto das proteínas anti-apoptótica Bcl-2 em câncer de mama. Esse aumento de expressão ocorre provavelmente por mecanismos de transcrição de quinases alvo da casacata Ras/Raf/MEK/ERK induzido por fosforilação de fatores de transcrição que se ligam em regiões promotoras de MDR e Bcl-2 e estimulam transcrição [52].
As proteínas Ras e Akt estão intimamente relacionadas com o processo angiogênico. O VEGF foi o primeiro a ser descrito como fator de permeabilidade
Renata Cristina Tornelli Tassetano [49].
Nossos resultados demonstram diminuição na expressão de VEGF em ambos os tratamentos. Estudos pré-clínicos sugerem que o sorafenibe age por inibição do crescimento tumoral e perturbação da microvasculatura tumoral através de seus efeitos antiproliferativos, antiangiogênicos e pró-apoptóticos [51]. Sendo assim, a diminuição do VEGF pode se dar pela ação anti-angiogênica direta do sorafenibe e provavelmente da echinácea.
A diminuição do VEGF pode ocorrer também via inibição das vias Akt e Ras.
Estudos demonstraram que o sorafenibe pode suprimir a atividade da Akt e do Ras e inibir a angiogênese tumoral, uma vez que este inibe os receptores do VEGF. O sorafenibe age no carcinoma renal através da inibição do receptor de VEGF. Dado que VEGFR desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da RCC, este mecanismo pode explicar os benefícios do sorafenibe observados em estudos clínicos [17, 43, 51]. Com base nesses resultados, podemos supor que a echinácea desenvolva o mesmo mecanismo.
A redução da vascularização do tumor e aumento da hipóxia tumoral está correlacionada com a indução de apoptose e necrose [51].
Renata Cristina Tornelli Tassetano
Renata Cristina Tornelli Tassetano 6.1. Observamos que o sorafenibe é um anti-oncogênico, uma vez que demonstrou redução da viabilidade e aumento da apoptose celular.
6.2. Observamos o papel do sorafenibe sobre as vias de sinalização Akt e