Estudo comparativo do efeito da Echinácea purpúrea e sorafenibe em células de adenocarcinoma renal humano em cultura

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Renata Cristina Tornelli Tassetano

Renata Cristina Tornelli Tassetano

Estudo comparativo do efeito da

Echinácea purpúrea e

sorafenibe em células de adenocarcinoma renal humano em

cultura.

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências.

São Paulo

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Renata Cristina Tornelli Tassetano

Estudo comparativo do efeito da

Echinácea purpúrea e

sorafenibe em células de adenocarcinoma renal humano em

cultura.

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Nestor Schor

Coordenadora: Prof.ª Dra. Miriam Aparecida Boim

São Paulo

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TASSETANO, Renata Cristina Tornelli

Estudo comparativo do efeito da Echinácea purpúrea e sorafenibe em células de adenocarcinoma renal humano em cultura.

Renata Cristina Tornelli Tassetano. – São Paulo 2010. 76 páginas

Tese (Doutorado) – Área Nefrologia – Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós Graduação do Departamento de Medicina. Disciplina de Nefrologia

Título em inglês: Comparative study of the effect of Echinacea purpurea and

sorafenib in human renal adenocarcinoma cells in culture.

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À minha amada mãe, Zilá:

Sempre mãe, amiga, fonte de estímulo.

Minha companheira e minha força em todos os dias da minha vida!

Ao meu amado pai, Arnaldo:

Exemplo e referencial para minha vida.

Que eu lhe seja motivo de orgulho sempre, pois assim serei grata por tudo que me proporcionou!

À minha querida irmã, Ana Carolina:

Presente companheira, eterna amiga.

Com poucas palavras, sempre me fez seguir a diante!

Ao meu querido irmão, Leonardo:

Pela inestimável paciência.

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Agradeço à Deus, pela grandeza da vida.

Ao meu orientador, prof. Dr. Nestor Schor, profissional exemplar, pelo

incentivo e a quem devo grande parte dos conhecimentos científicos adquiridos ao

longo desses anos.

Ao meu cunhado, que com seu jeito extrovertido, esteve sempre presente.

Aos meus afilhados Matheus e Luis Henrique, motivos de alegria em todos os

dias da minha vida.

Ao Romero, pela grandiosa paciência, carinho e apoio.

Aos meus avós, Rosário, Maria Antonieta e Catharina, pelo incentivo.

Ao meu grande amigo Marcelo. Agradeço pela amizade e companheirismo

profissional e pessoal.

Ao grupo de atividade física e rim, Nayda, Kleiton, Rafael, Rodolfo e Jéssica,

amigos queridos e companheiros.

À Clara, pela amizade e paciência ao longo destes 7 anos.

À Andréia, pela amizade, companheirismo profissional e compreensão.

Aos amigos da secretaria, Pablo, Michael, Priscilla e Luís, pelos préstimos.

Ao laboratório da Profª. Dra. Dulce Helena Casarini, e suas alunas, em

especial Danielle Aragão e Juliana Colluci, por estarem sempre dispostas.

Ao laboratório do Prof. Dr. Álvaro Pacheco Silva e Filho, em especial Patrícia

Semedo e Matheus.

Ao laboratório da Profª. Dra. Miriam Aparecida Boim, e seus alunos.

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Ao Prof. Dr. Waldemar Almeida, pela amizade.

Ao Prof. Dr. Vicente de Castro Teixeira, pelo empréstimo dos aparelhos para

realização do Western blot, e pelo auxílio acadêmico.

À Dra. Maria Aparecida Dalboni, pela sua inestimável paciência e dom de

ensinar.

À Dra. Maria Helena Bellini, pelos conselhos acadêmicos.

Ao prof. Dr. Sérgio Paulo Bydlowski e Débora Levy.

A todos os funcionários da disciplina de nefrologia, que estão presente em

todos os dias de nossa caminhada.

Às minhas queridas e amadas amigas da escola, pela grande confiança.

Aos meus amigos Thiago, Fabiana, Daniel, Luciano, agradeço pelo

companheirismo, preocupação e presença durante todos esses anos.

E a todos amigos e familiares, que me depositaram grande confiança.

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(10)

Renata Cristina Tornelli Tassetano Resumo

Introdução: O carcinoma renal (CR) é relativamente raro comparado a outros cânceres. Um dos mais potentes mitógenos tumorais, o fator de crescimento

endotelial vascular, VEGF, é regulado por inúmeras vias, particularmente Ras e

Akt, que são alvo de inúmeros agentes terapêuticos, dentre eles o sorafenibe.

Estas vias de sinalização têm importante papel no desenvolvimento e manutenção

da resistência a múltiplas drogas (MDR). A Echinácea purpúrea é utilizada como

tratamento alternativo para alguns tipos de câncer, sendo promissora para a

terapêutica de CR.

Objetivo: Analisar o efeito da Echinácea purpúrea (Ech) na viabilidade celular,

apoptose, nas vias de sinalização Ras e Akt, bem como na angiogênese tumoral

através do VEGF e potenciais alterações na resistência a múltiplas drogas.

Métodos: O fitoterápico Ech, foi adicionado à cultura de células Caki-1 para

posterior análise da viabilidade celular (Cristal Violeta), apoptose (Citometria de

fluxo), liberação da enzima Lactato Desidrogenase – DHL (Bio 200) e expressão

protéica do VEGF, Ras e Akt (Western blot) e expressão gênica MDR, MRP, LRP

(PCR-RT). Os experimentos foram realizados após 24, 48 e 72 horas de

tratamento. Os resultados foram analisados pelo teste Anova One Way, com

p<0,001 vs CT (X ± EP vs CT).

Resultados: Os grupos tratados com Ech demonstraram diminuição significante da viabilidade celular, dose e tempo dependentes comparado aos seus controles.

Nós observamos um aumento significante na porcentagem de células apoptóticas

(11)

protéica (p<0,001) da Akt (0,301±0,02 vs. 0,193±0,009) e VEGF (0,729±0,01 vs.

0,439±0,01) em 48 horas, bem como com 24 horas na proteína Ras (0,484±0,05

vs. 0,289±0,02). Analisando a expressão gênica das proteínas de resistência a

múltiplas drogas, Ech causou diminuição substancial de 100% para as proteínas

MDR e MRP e decréscimo de 25% na proteína LRP, sugerindo importante efeito

nestas proteínas.

Conclusão: Baseado em nossos resultados, observamos que a Ech apresenta propriedades anti-oncogênica, uma vez que demonstrou atividade sobre a

viabilidade e apoptose celular. Da mesma forma, Ech apresentou importante papel

sobre as vias de sinalização Akt e Ras, sendo estas importantes mediadoras da

progressão do ciclo celular e do processo apoptótico. Essas vias inibidas

demonstraram importante papel na inibição do VEGF, assim como, na regulação

da resistência a múltiplas drogas.

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Renata Cristina Tornelli Tassetano Abstract

Introduction: The renal cell carcinoma (CR) is relatively rare compared to other cancers. One of the most potent tumor mitogen, vascular endothelial growth factor,

VEGF is regulated by numerous pathways, especially Ras and Akt, which are

targets of many therapeutic agents, among them sorafenib. These signaling

pathways play an important role in the development and maintenance of the

multidrug resistance (MDR). Echinacea purpurea is used as an alternative

treatment for some cancers, and promising for the treatment of CR.

Aim: Analyze the effect of Ech purpurea (Ech) on the cellular viability, apoptosis,

Ras and Akt signaling pathway as well as tumor angiogenesis throughout VGEF

and potential proteins alteration in the cellular resistance to drugs.

Methods: Herbal echinacea were added to cell culture Caki-1 for subsequent

analysis of cell viability (Crystal Violet), apoptosis (flow cytometry), release of the

enzyme lactate dehydrogenase - LDH (Bio 200), protein expression of VEGF, Ras

and Akt (Western blot ) and gene expression MDR, MRP, LRP (RT-PCR). The

experiments were performed after 24, 48 and 72 hours of treatment. The results

were analyzed by One Way ANOVA, p <0.001 vs CT (X ± SE vs CT).

Results: Group treated with Ech demonstrated decrease in cell viability dose and time dependent compared to the control (IC50, 150mg/mL) from 0 to 300ug/mL

(p<0.001). We observed a statistically significant increase of apoptotic cells for

(14)

respectively. Also, a decrease in protein expression (p<0.05) of the Akt

(0.301±0.02 vs. 0.193±0.009) and VEGF (0.729±0.01 vs. 0.439±0.01) in 48 hours,

as well as Ras in 24 hours (0.484±0.05 vs. 0.289±0.02) were obtained. By

analyzing the genic expression of the proteins resistance to multiple drugs, Ech

caused a substantial decrease of 100% for MDR and MRP with 25% decreases in

LRP, suggesting an important effect in blunt the resistance protein to drugs.

Conclusion: To our knowledge, the Ech has anti-oncogenic properties since it showed activity on the viability and apoptosis. Likewise, Ech has its role on the

signaling pathways Akt and Ras, which are important mediators of cell cycle

progression and apoptosis. These blunted pathways demonstrated an important

role on VEGF inhibition, as well as in the regulation of multidrug resistance.

(15)

Introdução geral...01

Objetivos...29

Métodos...31

Resultados...41

Discussão...63

Sumário e Conclusões...71

(16)

(17)

O carcinoma de células renais (CCR), também conhecido como

adenocarcinoma renal, é uma forma de câncer renal que surge de células do

túbulo renal. Embora CCR seja relativamente raro comparado com outros

cânceres, um significante aumento na sua incidência tem sido observado nas

cinco últimas décadas [1].

O CCR ocorre em 90-95% dos tumores renais, e representam

aproximadamente 2% de todos os tumores malignos nos adultos. Nas décadas

passadas, o número de indivíduos diagnosticados com CCR foi substancialmente

aumentado. Os homens têm maior risco de desenvolvimento de CCR, além disso,

as diferenças raciais e a idade são importantes nessa incidência, onde se observa

menor índice de CCR em Caucasianos do que em populações negras [1]. CCR é

a sexta causa principal de morte por câncer.

O CCR é uma doença heterogênea, classificada em vários subtipos,

baseado nas características morfológicas identificadas pela microscopia de luz. O

CCR de células claras é a neoplasia renal mais comum em adultos, acometendo

aproximadamente 80% dos cânceres renais. Os outros subtipos menos comuns

de CCR são o CCR papilar (10-15%), CCR cromófobo (5%), CCR de ducto coletor

(<1%), e não classificados (<2%) [1-2].

A cirurgia é a única opção de tratamento curativo para CCR quando em

estádio localizado. A nefrectomia parcial é ainda considerada padrão-ouro para

(18)

2% dos pacientes com nefrectomia radical, e em aproximadamente 3% com

nefrectomia parcial [3].

A quimioterapia e a terapia radioativa demonstram uma pequena eficácia

com sobrevida dos pacientes que varia de 5% a 10% [4]. Os regimes

imunoterapêuticos atuais utilizam interleucina-2 humana recombinante (IL-2) e

interferon α-2b humano recombinante (IFN- α), sozinho ou em combinação e tem

sido o padrão para o tratamento de CCR metastático. [4]. O uso dessas citocinas,

contudo é limitada pela sua toxicidade e com respostas geralmente insuficientes.

As novas estratégias de tratamento incluem: anti-angiogênese, por bloqueio

do VEGF (bevacizumab), inibidores de receptores tirosina quinase de VEGF

(sunitinib ou PTK787), inibidores da via mTOR (CCI-779) e os inibidores da via Raf

quinase (sorafenibe) [5].

1.2. Sorafenibe

Recentemente foi demonstrado que o CCR – células claras é um câncer

altamente vascular que leva a muitas estratégias anti-angiogênicas. O tratamento

para CCR teve grandes mudanças com o desenvolvimento de potentes inibidores

angiogênicos e moléculas alvo [6]

Os agentes terapêuticos do câncer com alvos moleculares são

desenvolvidos para inibir importantes vias de transdução de sinais na patogênese

do câncer. Mutações que codificam genes das vias de sinalização das proteínas

Ras-Raf-MEK-ERK são freqüentemente encontradas em cânceres humanos e

(19)

como proteína quinase ativada por mitógenos (MEK) e quinase regulada por sinais

extracelulares (ERK), desregulação mitogênica e sinalização de sobrevida celular

[7].

Sorafenibe (BAY43-9006, Nexavar®, Bayer Pharmaceuticals, West Haven) é um composto que se liga à Raf e inibe sua atividade quinase por manutenção da

sua configuração inativa. A diminuição da ativação ERK em células tumorais

humanas inibe a proliferação celular in vitro e controla o crescimento de tumores

enxertados em ratos [7]. Sorafenibe foi aprovado pela “Food and Drugs

Administration” para o tratamento de carcinoma de células renais e tem se

mostrado promissor no tratamento de melanoma em ensaios clínicos [7].

Sorafenibe é um inibidor tirosina quinase, administrável por via oral, que foi

originalmente desenvolvido como um inibidor Raf-1, um importante mediador da

via Ras/Raf/MEK. Subseqüentemente foi encontrada atividade contra receptor

VEGF, receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), ligantes

tirosina quinase Fms-3 (FLT3), fator de crescimento de células-tronco (KIT).

Pacientes tratados com sorafenibe tiveram aumento significante da sobrevida. As

toxicidades atribuídas ao uso da medicação incluem fadiga, diarréia,

eritemas/máculas e hipertensão [8-9].

1.3. Echinácea purpúrea

O termo medicina alternativa e complementar (CAM) é normalmente

(20)

mental e corporal objetivando melhorar a medicina tradicional oferecida para o

tratamento de doenças. O aumento do uso deste tipo de medicina em todo mundo

é devido a muitas influências que incluem o elevado custo dos cuidados com a

saúde, tecnologia de informações e a grande consciência global em direção a

medicina alternativa. Em alguns países, as terapêuticas botânicas são com

freqüência administradas na prática médica e são classificadas como uma

medicina alternativa [10].

Echinácea (Ech) é uma planta perene que pertence à família das

Asteraceae e originária da América do Norte oriental. Cinco espécies do gênero

são conhecidas e três são normalmente utilizadas como terapia por suas

propriedades medicinais: Echinácea angustifólia, Echinácea purpúrea e Echinácea pallida. Echinácea é uma das ervas medicinais mais vendidas nos Estados Unidos

e Europa, e representa 10% de todo o mercado herbal. Muitas classes de seus

constituintes ativos têm sido identificados nas espécies medicinais de Ech

incluindo derivados do ácido caféico, alquilamidas, poliacetilenos que são

responsáveis pelas atividades antiinflamatórias, imunoestimulantes, antioxidantes

e cicatrizantes desta planta. Atualmente, o uso terapêutico dos extratos de Ech é,

em sua maioria, na prevenção e tratamento de infecções de trato respiratório

superior e sintomas da influenza [11].

O maior constituinte lipofílico são as alquilamidas e pode ser encontrado em

altas concentrações nas raízes e baixa concentração nas partes aéreas desta

planta.

Uma série de estudos farmacológicos demonstrou que o extrato de Ech

(21)

e de células imunes polimorfonucleares bem como efeitos na expressão de

citocinas/quimiocinas em células humanas mostrou-se muito convincente [12].

De acordo com estudos in vitro, a Ech parece induzir imunomodulação

através de estimulação do sistema imune não específico, aumentando a atividade

fagocitária de macrófagos, da produção de IL-1, IL-6 e TNF-α e melhora a função

das células natural “killer” do sangue periférico humano.

1.4. Proteína Akt

A Akt que também é conhecida como proteína quinase B (PKB), é uma

serina/treonina quinase de 59 kDa, pertencente à super família de proteína

quinase A dependente de cAMP/ proteína quinase G/ proteína quinase C (AGC),

que são estruturalmente homólogas em seus domínios catalíticos e apresentam

mecanismos similares de ativação. A desregulação de muitas dessas proteínas

quinase são freqüentemente associadas com doenças humanas incluindo câncer

e Diabetes mellitus. Akt/PKB foi inicialmente identificada em três grupos

independentes, baseado na homologia com a proteína quinase A (PKA) e C (PKC)

ou com a homologia celular com o oncogene viral Akt (v-akt). Em mamíferos, três

genes Akt/PKB foram identificados, chamados PKBα/Akt1, PKBβ/Akt2 e

PKBγ/Akt3, localizado no cromossomo 14q32, 19q13 e 1q44, respectivamente

[13].

Nas últimas décadas, Akt/PKB foi entendida como ponto principal de

(22)

e contribui para muitas funções celulares incluindo metabolismo de nutrientes,

crescimento celular, regulação transcricional e sobrevida celular [13].

Akt é composta por três domínios, incluindo um domínio PH (homólogo a

pleckstrina) na porção N-terminal, um domínio quinase e uma calda hidrofóbica

C-terminal. O domínio PH interage com produtos da membrana lipídica assim como

trisfosfato (3,4,5) fosfatidilinositol (PIP3) produzido pela quinase fosfatidilinositol-3

(PI3-K). O domínio catalítico quinase de Akt/PKB, localizado na região central da

molécula apresenta elevado grau de similaridade com outras quinases AGC,

assim como PKA, PKC, p70S6K e p90RSK. Outro recurso dessa região é um

conservado resíduo de treonina (T308 na PKBα/Akt1), cuja fosforilação pode ativar

parcialmente Akt/PKB. Seguido do domínio quinase, há uma extensão carboxil

terminal de aproximadamente 40 aminoácidos. Essa região possui uma cauda

hidrofóbica que é característica da família quinase AGC. Para todas as quinases

da família AGC, a fosforilação dos resíduos de serina ou treonina na cauda

(23)

O domínio PH contém 100 aminoácidos encontrados em muitas proteínas

de sinalização que podem mediar interações proteínas-lipídeos. No caso da Akt, o

domínio PH é requerido para o recrutamento na membrana plasmática através da

grande afinidade de ligação do PIP3 por ativação de PI3K. PIP3 não ativa PI3K

diretamente, mas aparece para recrutar Akt para a membrana plasmática e para

alterar a conformação para permitir subseqüente fosforilação pela

quinase-dependente-fosfo-inositol-1 (PDK-1) [15].

Evidências sugerem que uma das principais funções da Akt é promover

sobrevida celular mediada por fatores de crescimento e bloqueio da apoptose [13].

Estudos recentes demonstraram que a Akt é hábil na regulação de

sobrevida celular através de fatores transcricionais que são responsáveis por

genes pró, bem como anti-apoptóticos. A família de fatores de transcrição

(24)

Renata Cristina Tornelli Tassetano elegans. Alguns genes FoxO podem ser importantes por inibir a sobrevida celular.

Imagina-se que os genes alvo FoxO sejam ligantes extracelulares, incluindo Fas

ligante, TRAIL (apoptose induzida pelo ligante relacionado ao TNF) e TRADD

(domínio de morte associado ao receptor TNF tipo 1), e componentes

intracelulares para apoptose ligado a Bim (mediadores de morte celular de

interação com Bcl-2), um membro da família pró-apoptótica Bcl-2 e Bcl-6 [13].

A ativação da via de sinalização celular do Akt começa a partir da ativação

de um receptor do fator de crescimento que recruta a molécula quinase

fosfatidilinositol-3 (PI3K) para a membrana, por ligação direta. Ao ser ativada, o

próximo passo é a transformação de bifosfato (4-5)-fosfatidilinositol (PIP2) em

trifosfato (3,4,5)-fosfatidilinositol [Ptslns (3,4,5) P3] pelo PI3K. PIP3 por sua vez

recruta as proteínas quinases Akt e PDK1 para a membrana que

conseqüentemente fosforila o Akt transformando-o em sua forma ativa (p-Akt),

capaz de regular inúmeras moléculas-alvo, responsáveis por funções como

(25)

Renata Cristina Tornelli Tassetano 1.5. PI3K e Akt na regulação da angiogênese tumoral

Angiogênese é essencial para desenvolvimento embrionário, reprodução

feminina, reparação tecidual, doenças inflamatórias e crescimento tumoral. O

processo de angiogênese inclui dissolução da membrana basal de vasos,

migração e proliferação de células endoteliais, formação do lúmen, expansão e

maturação de novos vasos por recrutamento de pericitos com formação da

membrana basal. O crescimento tumoral e as metástases requerem angiogênese

quando o tumor atinge 1-2 mm de diâmetro. Angiogênese tumoral pode ser

desencadeada por sinalização extracelular assim como fatores de crescimento,

por alterações genéticas assim como ativação de oncogenes ou ainda, por

(26)

evidência direta do envolvimento de PI3K e Akt na regulação da angiogênese in vivo foi observada por expressão forçada de PI3K e Akt em membrana coriônica

de frangos por vetor retroviral. Adicionalmente, foi observado que a PI3K/Akt

regula a expressão do VEGF e o Fator de Indução de Hipóxia (HIF) através do

HDM2 e ativação de p70S6K1. VEGF e HIF-1 são mediadores que transmitem

sinais oncogênicos mediados por PI3K para o crescimento tumoral e angiogênese.

VEGF é um potente indutor de angiogênese e HIF-1 é o maior regulador de

ativação transcricional do VEGF através da ligação de elementos de resposta a

hipóxia (HRE) de promotores de VEGF. HIF-1 é um fator de transcrição

heterodimérico composto de duas subunidades: HIF-1α e HIF-1β. HIF-1α pode ser

induzido por hipóxia, fatores de crescimento e oncogenes, enquanto HIF-1β é

constitutivamente expresso em células humanas. Vários estudos mostraram que a

sinalização PI3K/Akt é importante para regulação de HIF-1α e expressão de

VEGF. Akt é um alvo essencial de PI3K para mediar à sinalização angiogênica.

Akt é o maior alvo de PI3K para transmitir sinais oncogênicos e angiogênicos. A

sinalização Ras/MEK é outra grande via para regulação de angiogênese e MEK

(27)

1.6. Proteína Ras

Uma das alterações genéticas mais freqüentemente detectadas em

cânceres humanos é da família de oncogenes Ras, que desempenha um papel

crucial no controle de crescimento tanto de células normais como transformadas.

O gene Ras foi primeiramente identificado em 1960 como um homólogo do

oncogene viral de retrovírus transformados. Essa família de genes inclui o N-Ras

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“Splice” alternativo K-Ras (vírus do sarcoma murino Kirsten), que é o tipo mais

freqüentemente ativado em cânceres humanos [16]. A superexpressão do tipo

selvagem Ras e suas mutações genéticas, envolvendo substituição simples de

aminoácidos nos códons 12, 13 ou 61 leva a ativação genética constitutiva, e tem

sido observada transformação maligna em muitos cânceres [16].

Ras é sintetizado como um pró-peptídeo no citoplasma e é dependente de

muitas modificações pós-tradução assim como farnesilação da calda box CAAX

(“C” representa cisteína, “A” representa aminoácidos alifáticos com a leucina,

isoleucina ou valina e “X” representa outros aminoácidos como a metionina,

serina, leucina ou glutamina) para aumentar sua hidrofobicidade e promover

associação na membrana. Quando a farnesilação é bloqueada por drogas assim

como os inibidores farnesyltransferase, Ras é incapaz de ancorar na membrana

celular e sua função é comprometida [16].

As proteínas Ras são chaves intermediárias na sinalização celular, e são

membros da grande família das proteínas G que ciclam entre um estado ativo

(ligado a GTP) ou inativo (ligado a GDP). No mais, Ras torna-se ativo através da

ligação à receptores tirosina quinase na superfície celular assim como EGFR,

HER-2 (Receptor do fator de crescimento epidermal humano- tipo 2), VEGFR e

PDGFR.. Quando Ras é ativado, é desencadeada uma cascata de eventos de

fosforilação de pontos críticos de Raf quinase [16].

Ras é limitado à membrana, ligado à proteína G que servem como um

“conversor molecular” convertendo sinais da membrana celular para o núcleo.

Esses sinais químicos conduzem a síntese protéica e regulação de sobrevida

(29)

consiste de 190 resíduos de aminoácidos que são altamente conservados em

suas porções N e C-terminal. Muitas da diferenças entre essas proteínas ocorrem

próximo ao domínio C-terminal de aproximadamente 25 aminoácidos, que é

presumido ser responsável por suas diferentes funções [17].

Como outras proteínas G, Ras cicla entre forma inativa ligada a GDP e

forma ativa ligada a GTP. Em seu estado quiescente, Ras existe na forma ligada a

GDP. Depois de vinculada a ligantes externos assim como o fator de crescimento

epidermal (EGF) ao seu receptor, a dimerização do receptor ocorre, e o intrínseco

receptor tirosina quinase é ativado. Este é seguido por auto-fosforilação de

resíduos de tirosina específicos na porção intracelular do receptor. Estes resíduos

de tirosina fosforilados em seguida, se vinculam ao domínio SH2 de proteínas

adaptadoras como Grb2. Essas proteínas adaptadoras contem não somente um

domínio SH2, mas também um domínio SH3 que se liga a caldas ricas em prolina

de outras proteínas, assim como “son of sevenless” (SOS), um estimulador de

dissociação de guanina (GDS) de Ras. A molécula adaptadora chave de Ras é

Grb-2, que consiste apenas de um domínio SH2 e dois domínios SH3 e liga o

receptor ativado à SOS. Assim forma-se um complexo que recruta SOS, uma

proteína citosólica, em estreita proximidade com Ras na membrana plasmática. A

ligação de SOS a Ras causa mudança na conformação de Ras e leva a

dissociação de GDP, que permite Ras de se ligar a GTP e tornar-se ativo.

Moléculas assim como SOS, que permitem a dissociação de Ras do GDP e

ligação à GTP, são também conhecidos como Fatores de Troca de Nucleotídeos

(30)

Mol Cancer Ther 2005;4(4). April 2005

Ras ativado apresenta vários efetores distintos, assim como uma quinase

serina treonina raf-1, quinase 3- fosfoinositol (PI3-K) e RalGDS. Essa cascata de

efetores ativa inúmeras sinalizações distintas, levando tanto a ativação de

determinados genes, assim como a codificação de fatores de crescimento como

VEGF ou mudanças na actina do citoesqueleto por estímulo da família de

proteínas Rho. Normalmente, a cascata de sinalização Ras é somente ativada

transientemente porque cada Ras normal tem pouca atividade trisfosfato de

guanidina intrínseco (GTPase) que gradualmente inativa suas próprias funções de

(31)

rapidamente convertendo Ras da forma ativa para a forma GDP inativa. Neste

sentido, as GAPs são atenuadoras de Ras normal. Contudo, mutações

oncogênicas Ras não somente reduz a atividade intrínseca GTPase, mas também,

mais importante, abole completamente a ativação de GTPases induzida pelas

GAPs. Assim, ao contrário do Ras normal, as proteínas mutantes do Ras

oncogênico permanecem constitutivamente na sua forma ativa ligada a GTP [17].

1.7. Mutação de Ras em cânceres humanos

A função do gene Ras na indução da transformação maligna é apoiada por

várias linhas de evidência. Primeiro, o Ras oncogênico, mas não o Ras normal

transfectado em fibroblastos tornaram-se tumorigênicos. Segundo, ratos

transgênicos abrigando mutações Ras oncogênicas têm um aumento da

incidência na formação tumoral. Finalmente, a elevada freqüência de mutação Ras

tem sido encontrada em uma variedade de tipos tumorais, tanto ocorrendo

naturalmente como induzido experimentalmente. Mutações identificadas são

limitadas a um número pequeno de sítios (aminoácidos 12,13,59 e 60), todos que

abolem a hidrólise de GTP induzida por GAP das proteínas Ras [17].

1.8. Mecanismo de resistência a múltiplas drogas

A resposta de células tumorais a drogas pode ser definida por inúmeros

(32)

da substância dentro das células à morte celular ou parada em algum estágio do

ciclo celular) [18]. O fator de maior relevância envolvido no fracasso do tratamento

do câncer é, portanto, representado pelo desenvolvimento de resistência a drogas

pelas células tumorais [19]. A resistência a múltiplas drogas (MDR) em câncer é

um fenômeno que ocorre quando as células cancerosas tornam-se

simultaneamente resistentes a agentes quimioterápicos estruturalmente

independentes. Essa resistência acaba fracassando o tratamento contra a doença.

Muitos mecanismos celulares podem ser responsáveis pela MDR, assim como

redução de apoptose, mecanismos avançados de reparo de DNA ou alteração de

metabolismo de drogas. Contudo, o mecanismo mais comum de resistência é o

efluxo ativo de drogas pelos transportadores do cassete de ligação - ATP

(transportadores ABC). Esses transportadores têm um importante papel fisiológico

em células mamíferas [20].

A superfamília ABC inclui aproximadamente 300 proteínas, e entre elas

transportadores de compostos bem diferentes. As proteínas dessa família são

caracterizadas pela presença de um domínio de ligação - ATP de estrutura

específica [18].

Os transportadores ABC são proteínas transmembrana consistindo tanto de

domínios transmembranas (TMDs) e domínios de ligação de nucleotídeos distintos

(NBDs), que geram energia a partir da hidrólise de ATP para transportar

ativamente uma variedade de compostos através da membrana. Estes

transportadores são subdivididos em sete subfamílias distintas (ABCA-ABCG),

com base na homologia de seqüência e organização do domínio. Entre outros,

(33)

P-Renata Cristina Tornelli Tassetano

importante no desenvolvimento da MDR em células cancerosas.

Vários membros desta família são capazes de transportar ativamente uma

ampla gama de substratos, incluindo íons, açúcares, aminoácidos, lipídios, toxinas

e drogas anticâncer. Essencialmente, quando esses transportadores de drogas

ABC são superexpressos em células de câncer, eles podem conferir resistência

cruzada a múltiplas drogas de diferentes classes químicas por efluxo ativo de

drogas citotóxicas, assim reduzindo o nível de quimioterápico, resultado em MDR

[20].

1.9. ABCB1 MDR/P-glicoproteína

ABCB1 foi o primeiro transportador de membrana descrito por sua

habilidade em conferir resistência a múltiplas drogas em células de câncer. A P-gp

funciona como uma bomba de efluxo dependente de energia, que resulta em

diminuição intracelular de agentes citotóxicos em células tumorais [21]. Pouco se

sabe sobre a modulação deste gene. Diferentes agentes, tais como hormônios,

oncogenes e fatores de transcrição podem ser relacionados à modulação da

expressão do MDR em seres humanos [22]. A P-gp em seres humanos é

expressa em tecidos normais, sendo assim os tumores que apresentam expressão

intrínseca da gp originam-se de órgãos onde existe a expressão fisiológica da

P-gp, como glândulas adrenais e os rins [23].

A maioria dos agentes quimioterápicos é dissolvida na bicamada

(34)

concentração. A P-gp atua contrariamente, expulsando esses agentes para o meio

extracelular [24]. Existem basicamente dois mecanismos de captação de drogas

pela membrana citoplasmática. No caso de drogas hidrofílicas como a cisplatina,

análogos de nucleosídeos e antifolatos, estas não conseguem cruzar a membrana

citoplasmática isoladamente. Há necessidade de transportadores ou a presença

de canais hidrofílicos na membrana, para que estes agentes alcancem o meio

intracelular. Nestes casos, o fenômeno de resistência pode ser originado a partir

de mutações geradas nestes transportadores, resultando no impedimento da

entrada destes compostos na célula [24].

Em relação aos agentes hidrofóbicos, como os alcalóides da vinca,

antraciclinas, actinomicina D, etoposídeo e paclitaxel, estes atravessam a

membrana citoplasmática por difusão, sem a necessidade de transportadores

específicos. Assim, a única forma de manter estas drogas fora da célula é pela

ativação dos sistemas de transporte dependentes de energia, como a família ABC,

levando à extrusão dessas drogas, resultando no fenótipo MDR [24].

Uma propriedade característica da resistência a múltiplas drogas mediada

pela P-gp é reverter este fenômeno através de substâncias e drogas não

citotóxicas. Assim, o verapamil e a ciclosporina A são geralmente aceitos como

inibidores padrão da P-gp. Os agentes inibidores da P-gp são um grupo diverso e

bem caracterizado de substâncias que incluem bloqueadores de canais de cálcio e

(35)

Em 1992, Cole et al. relataram a existência de um segundo tipo de proteína

que também funcionaria como uma bomba de efluxo de drogas, presente em

células cancerígenas pulmonares resistentes à doxorrubicina.

As proteínas P-gp e MRP são proteínas transportadoras ABC que

desempenham um importante papel fisiológico no transporte de diferentes

moléculas por meio das membranas biológicas, desde células bacterianas,

fúngicas, protozoárias até células neoplásicas humanas. Esta superfamília de

proteínas transportadoras é de fundamental importância para a resistência a

drogas [26].

A MRP1 é expressa em diferentes órgãos e tipos celulares, com altos níves

no pulmão, testículos, rins, placenta, músculo esquelético e cardíaco. Muitas

células tumorais co-expressam P-gp e MRP [27].

Embora o mecanismo de ação da MRP não seja completamente conhecido,

esta proteína também atua no aumento do efluxo de drogas, de forma dependente

de energia, resultando na redução do acúmulo intracelular de drogas [28].

Participa no transporte de conjugados de glutationa (GSH) e glucuronídios de

billirubina, drogas neutras conjugadas a sulfato e drogas aniônicas como a

metotrexato, no interior da célula e na secreção dos mesmos para o meio

extracelular [29]. Desta forma, a MRP tem importante papel na detoxificação, a

qual também ocorre para os agentes quimioterápicos, facilitando mecanismo de

(36)

A principal proteína homóloga à MRP é a MRP1, que está presente na

maioria dos tecidos, enquanto que a P-gp é expressa principalmente em tecidos

que funcionam como barreiras [24].

1.11. Proteína relacionada à resistência de pulmão (LRP)

Em 1986, foi identificada uma proteína denominada proteína relacionada à

resistência de pulmão (“Lung Resistence Related Protein” – LRP), detectada

primeiramente em células tumorais de câncer de pulmão resistentes a múltiplas

drogas, através de mecanismo não mediado pela P-gp [30]. Os pesquisadores

notaram que a LRP é idêntica à maior proteína do grupo “vault” a MVP (Major

Vault Protein). Vaults são organelas citoplasmáticas localizadas na membrana

nuclear e no poro nuclear [31].

A proteina LRP pode ser encontrada fisiologicamente no cólon, pulmões,

túbulos contornados proximais renais, córtex da adrenal [32].

Siva et al. (2001), relataram que as linhagens celulares resistentes a

múltiplas drogas como carcinoma de pulmão, mieloma e carcinoma de mama,

apresentam níveis elevados de MVP (LRP). No entanto, já se demonstrou

previamente que a MVP não é suficiente para levar ao fenótipo MDR

isoladamente. “Vaults” são complexos de múltiplas subunidades e precisam

interagir para ocasionar o fenótipo.

(37)

reguladas por receptor tirosina quinase e receptores-não tirosina quinase,

relacionadas ao MDR. Alguns trabalhos mostram que as vias de sinalização

mediada por Raf podem estar envolvidos na regulação da transcrição do gene

MDR1, onde a introdução do gene N-Ras em células de ratos e humanas, resultou

na expressão de P-gp ativa e surgimento de resistência aos fármacos em algumas

delas. Assim, a proteína N-Ras é hábil na regulação da atividade de P-gp.

Outra importante via de transdução de sinais na MDR, é a via de

sinalização PI3-K. Esta via tem papel fundamental na proteção das células contra

um amplo espectro de indutores de morte celular. A fosfatase PTEN é um inibidor

desta via, e o seu papel na MDR e regulação da atividade dos transportadores

ABC têm sido largamente estudado [18].

1.13.Apoptose

“A vida é incerta, a morte é certa”. Todas as células são programadas para

morrer. O processo de morte celular pode ser passivo ou ativo. A morte celular

passiva é direta, matando a célula agudamente por uma agressão exterior,

danificando-a bastante para produzir alterações irreversíveis Essa ocorre sem a

participação da célula e pode ser prevenida somente na ausência de agressão.

Deste modo, a morte celular é imediata, extensiva e o dano é irreparável para o

citoplasma e membrana.

Em contraste, a morte celular ativa é um processo de suicídio que leva a

(38)

termo “morte celular programada”, descrita por Lockshin e Williams, foi obtida para

caracterizar a morte celular ativa, contudo, o termo “programada” pode ser usado

para caracterizar dois sentidos distintos: o processo de morte celular que ocorre

em um local e tempo precisos de acordo com o programa de desenvolvimento (por

exemplo, morfogênese) ou, morte celular que, uma vez desencadeada (como

parte de um programa de desenvolvimento ou ocasionalmente como em muitas

patologias), seguido de programas bioquímicos intrínsecos à célula, controlados

pela sua programação. Por isso, o termo “ativa” é mais bem empregado do que

“programada” quando se refere ao processo de morte celular que, uma vez

desencadeado, inicia um curso de eventos bioquímicos processados e controlados

pela célula.

A morte celular é seguida por sua eliminação. Em animais multicelulares, a

eliminação celular é essencial para o desenvolvimento e homeostase, e é

realizada principalmente por apoptose. Kerr, Wyllie e Currie, introduziram o

conceito de apoptose baseado em observações in vivo em tecidos mamíferos e

descreveram esse processo como comprometedor ao estágio de eliminação

celular terminal através da remoção da célula apoptótica por fagocitose e

degradação por uma célula “scavenger”. No entanto, logo foi reconhecido por Kerr

e colaboradores que in vivo e in vitro, quando a remoção por “scavengers” não

ocorre, o processo apoptótico continua até a transição para necrose, levando a

eliminação celular por rompimento da célula. Esse rompimento terminal da célula

apoptótica foi inicialmente chamado de “degeneração secundária”, uma

(39)

separado que ocorre após completa apoptose, e assim, foi conhecida também

como necrose pós – apoptose. Uma visão alternativa é considerar que o resultado

necrótico é parte do programa apoptótico de eliminação celular, e nesse caso é

chamado de apoptose tardia.

Após o conceito inicial que a apoptose foi o mecanismo depois da morte

celular ativa, avanços no conhecimento dessa área revelaram que a morte celular

ativa pode assumir programas definidos geneticamente.

Quando a célula in vitro responde ao estímulo de morte apoptótica ele ativa

uma seqüência de eventos moleculares que procede por meio de duas fases que

normalmente culminam em rompimento celular. Na primeira fase, as alterações

celulares produzem um morfotipo apoptótico clássico que é usado para identificar

esse modo de morte celular. Durante essa fase as células apoptóticas podem ou

não se fragmentar em corpos apoptóticos, e em contraste com a necrose, a

membrana que envolve as células apoptóticas ou os corpos apoptóticos

permanece quase intacta, isto é, exceto para muitas alterações estruturais como a

externalização da fosfatidilserina e exposição do sinal “eat-me” para fagocitose por

“scavengers”. A fase terminal é a necrose secundária durante a qual as alterações

moleculares necróticas produzem um novo morfotipo, que é mais típico quando

não há fragmentação em corpos apoptóticos. Assim, o morfotipo da necrose

secundária é uma mistura de alterações produzidas na fase apoptótica

(fragmentação nuclear e intensa condensação da cromatina) e alterações

(40)

membrana citoplasmática e da célula (ou dos corpos apoptóticos) é desmantelado

em restos celulares.

Quando incorporado a organismos multicelulares, que muitas células

podem responder a estímulos de morte apoptóticos novamente por ativação de

mecanismo de apoptose endógena, o resultado pode ser bem diferente do que

ocorre in vitro porque agora a célula é parte de um contexto social de organismos

multicelulares. De fato, o programa apoptótico desencadeia um mecanismo de

eliminação celular que solicita a cooperação de células “scavengers” para

endocitar e digerir por heterólise a célula apoptótica antes da transição para

necrose secundária, isto é, enquanto a célula em apoptose ainda é envolta por

uma membrana quase-intacta. Este processo de eliminação celular descrito

inicialmente por Kerr, Wyllie and Currie como um mecanismo fisiológico para

eliminação de células apoptóticas ou corpos apoptóticos é ativado in vitro, mas

pode não operar pela falta de “scavenger”.

Eventos bioquímicos que estão sustentando o morfotipo apoptótico podem

incluir ativação de caspases, inativação de PARP-1, transição de permeabilidade

mitocondrial com perda de potencial de membrana, liberação de AIF,

Endonuclease G ou citocromo c do espaço intermembrana mitocondrial, moderado

aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, sobrecarga moderada de

Ca2+_{citosólico e degradação de DNA internucleossomal [33].}

(41)

vertebrados e envolve dois processos fundamentais: vasculogênese, definido

como uma diferenciação de células progenitoras endoteliais dentro do plexo

capilar primário, e angiogênese, o crescimento de novos capilares de vasos

pré-existentes. No adulto, a angiogênese é também essencial durante a gravidez,

crescimento tecidual e reparo e é um processo fundamental em muitas doenças

humanas, incluindo câncer. Desde a descoberta em 1983, e subseqüente clone do

gene em 1989, o VEGF-A, também conhecido como VEGF, foi considerado o mais

importante regulador da formação de vasos sanguíneos na saúde e na doença; é

essencial na vasculogênese e angiogênese embriogênica e é um mediador da

neovascularização no câncer e outras doenças.

Sob condições patológicas, a angiogênese estimula tumores, formando

vasos sanguíneos, levando oxigênio e nutrição para um rápido crescimento.

Posteriormente os tumores utilizam vasos sanguíneos e linfáticos para metástase

para outros tecidos e linfonodos. Muitas doenças inflamatórias também induzem

angiogênese patológica como nas doenças malignas.

O VEGF é uma glicoproteína dimérica e membro de uma família de fatores

de crescimentos que incluem o fator de crescimento placentário (PLGF), VEGF-B,

VEGF-C, VEGF-D (também conhecido como fator de crescimento induzido por

c-fos), VEGF-E e o fator de crescimento placentário (PlGF). Todos os membros

exceto o VEGF-E svVEGF (Trimeresurus flavoviridis) são codificados pelo genoma

humano [34].

O VEGF é crucial na angiogênese tanto normal como tumoral. Os efeitos

(42)

endoteliais e migração, promoção da sobrevida de células endoteliais com

proteção à apoptose e reversão da senescência das células endoteliais. O VEGF

exerce seu efeito biológico interagindo com os receptores existentes na superfície

celular. Esses receptores tirosina quinase transmembrana incluem VEGFR-1

(Flt-1) e VEGFR-2 (KDR/Flk-(Flt-1), seletivamente expressos nas células endoteliais

vasculares, VEGFR-3 (Flt-4), expressos em endotélio vascular e linfático, e o

receptor de neuropilina (NRP-1), expressos em endotélio vascular e neurônios. A

grande maioria dos pacientes com CCR apresenta VEGF superexpressos nos

tecidos tumorais [4, 35].

A tensão de oxigênio é importante regulador da expressão gênica de VEGF.

A regulação transcricional do gene VEGF por hipóxia é mediada pela ligação do

fator de transcrição HIF-1 (fator transcricional de indução de hipóxia 1) ao HRE

(elementos que realçam a resposta a hipóxia). HIF-1 é um heterodímero que

contém subunidades HIF-1α e HIF-1β [35].

(43)

Desta maneira, este trabalho pretendeu estudar o efeito de um produto

natural sobre o carcinoma renal através de várias estratégias, a saber: efeito

sobre a viabilidade celular, a apoptose, a toxicidade (pelo DHL), a expressão

protéica do VEGF, Ras e Akt bem como genes (MDR,MRP e LRP) que expressam

proteínas responsáveis pela resistência a múltiplas drogas. Pretendemos com

estes estudos, caracterizar de uma maneira sistemática e científica, o potencial

efeito da Echinácea purpúrea. Estes resultados podem permitir que seu uso seja

racional e seguro e mais ainda, abre perspectivas para novos estudos com outros

produtos naturais já que o nosso País pela sua enorme biodiversidade, apresenta

(44)

(45)

Renata Cristina Tornelli Tassetano 2.1. Analisar o efeito da Echinácea purpúrea e sorafenibe sobre a viabilidade das

células de adencarcinoma renal;

2.2. Analisar o efeito da Echinácea purpúrea e sorafenibe sobre as vias de

sinalização celular Akt e Ras e suas influências na viabilidade, apoptose celular e

angiogênese tumoral, através do VEGF;

2.3. Analisar o efeito da Echinácea purpúrea e sorafenibe sobre os mecanismos

de resistências às múltiplas drogas.

(46)

(47)

As células de adenocarcinoma renal humano imortalizada CAKI-1, obtidas

na “American Type of Culture collection” (ATCC – HTB46), foram cultivadas em

garrafas apropriadas, com “Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium” (DMEM - Sigma

Chemical Company, USA) suplementado com soro fetal bovino (10% v/v -

Sigma-Aldrich, Italy), bicarbonato de sódio (NaHCO3)2,0 g/L, HEPES 2,6 g/L, penicilina

10000U/L, estreptomicina 50mg/L e mantidas na incubadora a 37ºC com 5% CO2.

As células foram cultivadas sobre superfície plástica e após atingirem

confluência adequada, o meio a 10% foi substituído por meio puro durante 24

horas antes do experimento, no sentido de sincronizar as células na fase G0 do

ciclo celular. A seguir, as células foram submetidas ao tratamento com Echinacea

(Fundação Herbarium de Pesquisa e Saúde, Brasil) e sorafenibe (BAY43-9006,

Nexavar®, Bayer Pharmaceuticals - Departamento de Quimioterapia, Hospital São Paulo, Brasil).

(48)

3.3. Diluição dos fármacos

A Ech foi extraída da cápsula e diluída em meio de cultura (DMEM 10%)

para uma concentração final de 150 mg/ml. Cada cápsula de Ech contém 200 mg

de extrato seco. Esta solução estoque foi então diluída em variadas doses (0 –

300 ug/ml) para uso na cultura celular.

O Sor foi triturado e diluído em DMSO puro para uma solução estoque de

100 mM. Este então foi diluído a 100 uM em meio DMEM 10% para seriar as

diluições para uso na cultura celular (0 – 10 uM).

CAKI-1

70%

24 horas meio puro

Análise Experimental n=7

Echinacea purpúrea (E.p.) 24, 48 e 72 horas

(49)

soluções de uso foram preparadas somente no momento do tratamento.

3.4. Citotoxicidade por cristal violeta

O cristal violeta cora DNA das células. Supondo-se que as células viáveis

permaneçam aderidas a placa quando lavamos, retiramos o excesso de corante e

as células não aderidas. Assim, obtemos uma leitura proporcional ao número de

células que permaneceram aderidas à placa.

As células foram tratadas com ech (0 – 300 ug/ml) e sor (0 – 10 uM) e após

o tempo de incubação, o corante foi colocado (20 L por poço) sobre os 100 L de

meio e incubou-se por 15 minutos; as placas foram lavadas gentilmente com fio de

água por 3 vezes e completamente secas. Para leitura, foi colocado 100 L de

metanol 100% por poço e submetido a leitor de ELISA (Multiskan Ex Primary EIA

V.2.1-0) no comprimento de onda, 570nm. Deixar sempre como controle um poço

sem célula (branco da leitura no ELISA) e poços sem tratamento (controles do

experimento).

3.5. Dosagem de DHL

A desidrogenase lática (DHL) é uma enzima citosólica estável que é

liberada após dano à membrana em células necróticas. Esta enzima é liberada

para o meio extracelular quando a célula é lesada. Determinamos a quantidade

(50)

forma, a relação extracelular (meio de cultura) e LDH total (célula mais meio de

cultura) guardam, teoricamente, um paralelismo com o grau de sofrimento celular.

A enzima LDH catalisa a redução do piruvato a lactato. Para a determinação do

LDH liberado, o meio de cultura é aspirado e transferido para um tubo cônico,

centrifugado a 2000 rpm por 4 minutos e o sobrenadante é retirado para leitura.

Após a aspiração do meio de cultura, as células são lavadas com tampão PBS por

duas vezes. As células Caki-1 são lisadas com 500uL triton X-1. Estas são então

raspadas e o conteúdo final é levado para leitura no analisador bioquímico

(Bio-Plus 200F).

3.6. Citometria de fluxo

A análise quantitativa de corpos apoptóticos foi avaliada pela medida da

exposição da fosfatidilserina na membrana celular usando a coloração por

Anexina V- isotiocianato de fluoresceína (Anexina V-FITC) e iodeto de propídeo

(PI) (BD Pharmingen, Frankrin Lakes, NJ, USA). Após tratamento com ech e sor,

as células foram coletadas. Após centrifugação, o pellet foi lavado duas vezes com

PBS gelado e suspenso em 200 µL de tampão de uso 1x. As células foram

incubadas com 5 µL de anexina V-FITC e 5 µL de PI por 20 minutos à temperatura

ambiente no escuro. Após incubação, foram adicionados mais 200 µL de tampão

de uso 1x a cada tubo. As células foram analisadas imediatamente por

BDFACSCanto (Becton & Dickinson, San Diego, USA) e as análises foram feitas

(51)

O lisado da cultura celular foi extraído com tampão RIPA (150mM NaCl,

50mM Tris, 1% Polydet, 0,15 SDS, 5mg/mL Deoxicolato de Sódio) acrescido de

inibidores de protease (leupeptina 1mg/mL, pepstatina 1mg/mL, PMSF

(phenylmethylsulfonylfluoride)) 10mg/mL e a concentração protéica foi

determinada pelo método colorimétrico de Lowry e cols [36].

Quantidades iguais de proteínas, previamente reduzidas com β

-mercaptoetanol e fervidas a 90°C por 5 min foram separadas por eletroforese em

gel de poliacrilamida a 10% (SDS-PAGE). As proteínas foram transferidas para

membrana de PVDF por transferência úmida, sendo a membrana bloqueada com

solução composta de albumina bovina 5% em TBS-T (Tris HCl 0,05M, NaCl

0,15M, Tween 0,05%) durante toda noite. Posteriormente, foi incubada com

anticorpo primário diluído em albumina 1% por 1 h em temperatura ambiente. Foi

feita a lavagem com TBS-T (3X 15 min) e, a seguir, incubação com anticorpo

secundário conjugado com fosfatase alcalina por 1 hora. As membranas foram

novamente lavadas com TBS-T (1x 15 min e 2x 5 min) e incubadas com solução

revelação (Tris HCl 0,1M, NaCl 0,1M, MgCl 0,005M) por 10 minutos.

A revelação foi realizada com substrato NBT (nitro blue tetrazolium) e BCIP

(5-bromo-4-cloro-3-indolyl-fosfato), que detectam o complexo antígeno-anticorpo

ligados à membrana e desenvolvem um produto de cor púrpura insolúvel sobre a

superfície da membrana.

(52)

As membranas foram submetidas à densitometria para a mensuração das

bandas obtidas utilizado-se o programa de computador Quantity One GS-710 –

acoplado ao densitômetro modelo Calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad).

Os anticorpos utilizados foram:

• VEGF: Anticorpo primário monoclonal de coelho anti-VEGF humano

(Santa Cruz), diluição 1:200

• Akt: Anticorpo primário monoclonal de coelho anti-Akthumana (Cell

Signaling), diluição 1:800

• Ras: Anticorpo primário monoclonal de rato anti-Ras humano (Santa

Cruz Biotechnology), diluição 1:500

• α-Actina: Anticorpo primário monoclonal de cabra anti-α-actina

humana (Santa Cruz Biotechnology), diluição 1:500

• Anticorpo secundário cabra anti-coelho conjugado com fosfatase

alcalina (Bethyl), diluição 1:1000

• Anticorpo secundário cabra anti-rato conjugado com fosfatase

alcalina (Santa Cruz Biotechnology), diluição 1:1000

• Anticorpo secundário asno anti-cabra conjugado com fosfatase

alcalina (Santa Cruz Biotechnology), diluição 1:1000

3.8. Extração de RNA total

As células Caki-1 foram contadas e coletadas por centrifugação a 1850

rpm por 10 minutos à temperatura ambiente. Foi adicionado 1 mL de TRIzol para

(53)

agitou-se vigorosamente por 15 segundos, seguido de repouso de 3 minutos à

temperatura ambiente. Centrifugou-se a 12.000 x g por 15 minutos a 4ºC. A fase

aquosa foi transferida para um novo tubo previamente esterilizado. Adicionou-se

500µL de isopropanol e incubou-se por 10 minutos à temperatura ambiente.

Centrifugou-se por 12.000 x g por 10 minutos a 4ºC e o sobrenadante foi

descartado. O precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 75% em água tratada

com dietilpirocarbonato (DEPC) e homogeneizou-se em vórtex, suavemente, por

15 segundos. Centrifugou-se a 7.500 x g por 5 minutos a 4ºC, descartando-se o

sobrenadante. O precipitado foi colocado para secar por 15 minutos à temperatura

ambiente e dissolvido em 50µL de água tratada com DEPC.

3.9.PCR em tempo real

O PCR em tempo real foi utilizado para a análise da expressão gênica dos

genes MDR, MRP e LRP, utilizando a metodologia de transcrição reversa seguida

de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real. A expressão de

cada RNAm foi normalizada em relação a expressão do gene da β2

-microglobulina. De acordo com instruções do fabricante do aparelho “Rotor-Gene

RG 3000” (Cobertt Research), os ensaios foram realizados em duplicata e a

variação no valor de CT (Cyclo de Threshold) entre as duplicatas não

ultrapassaram 0,5. Todos os ensaios utilizaram amostra referência e um controle

(54)

Os experimentos PCR em tempo real foram realizados utilizando-se

250ng/µl de RNA e o SuperScript III Platinum SYBER Green One-Step qRT-PCR

Kit (Invitrogen), em volume final de 12,5µL. A condição usual de programação dos

ciclos foi 50o_{C por cinco minutos para síntese de cDNA, 95}o_{C por 5 minutos,}

seguidos de 40 ciclos de 95oC por 15 segundos e 60oC por 30 segundos. Foi realizada curva de dissociação no intervalo de variação de temperatura 50 a 99oC, sendo 1oC por etapa de 30 segundos.

Os primers utilizados foram:

Β2MG-S: 5’- ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA – 3’

Β2MG-AS: 5’- ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG – 3’

MDR1-S: 5’- CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG – 3’

MDR1-AS: 5’- GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA – 3’

MRP-S: 5’- CTG AAA CCA TCC ATG ACC TCA ATC C -3’

MRP-AS: 5’- GCC TCC TCG TTC ACG TCC ACC TGG G -3’

LRP-S: 5’- GGG TTG TGC CCA TCA CCA CC- 3’

LRP-AS: 5’- GGT CCG CGG ATG AGC CAG TGG -3’

Para calcular a quantificação relativa foi utilizado o método ∆∆CT, que utiliza

a seguinte fórmula: ∆CT = CT gene alvo – CT gene endógeno, ∆∆CT = ∆CT do gene

alvo - ∆CT do gene endógeno. O número de vezes que ocorre a mudança da

expressão gênica é calculado como 2-∆∆CT_[37].

(55)

utilizando-se estatística descritiva para obtenção de média, desvio e erro padrão,

bem como o teste One Way ANOVA (Student-Newman-Keuls Method) para a

comparação entre grupos. Foi adotado como valor significante àqueles que

(56)

(57)

Renata Cristina Tornelli Tassetano 4.1.1. Echinácea purpúrea

Em todos os períodos de tempo, foi observada diminuição significante da

viabilidade celular das células tratadas com diferentes concentrações de

echinácea comparado com seus respectivos controles, como mostrado na figura 1.

Observamos que a concentração tóxica de morte foi 150ug/mL.

Tabela 1: Porcentagem de células viáveis tratadas com Echinácea purpúrea

por 24, 48 e 72 horas (n = 7).

Grupos (ug/ml) 24 hrs (%) 48 hrs (%) 72 hrs (%)

CT 100±0,2 100±0,1# _100±0,3#$

50 89±0,3* 43±0,3*# 43±0,3*#

75 68±0,2* 50±0,09*# 40±0,2*#$

100 71±0,3* 44±0,3*# 37±0,09*#$

125 71±0,2* _49±0,2*# _34±0,2*#$

150 64±0,3* 49±0,3*# 39±0,4*#$

250 48±0,1* 42±0,2*# 37±0,2*#$

300 50±0,3* _37±0,2*# _36±0,4*#

(58)

Figura 1: Porcentagem de células viáveis tratadas com Echinácea purpúrea por 24, 48 e 72

horas (n=7) *P<0,001 vs CT, #P<0,001 vs 24 horas, $P<0,001 vs 48 horas.

4.1.2. Sorafenibe

Quando tratamos as células com sorafenibe, observamos diminuição

significante da viabilidade celular, tempo e concentração dependente. Quando

tratamos as células com o veículo, DMSO também observamos diminuição na

viabilidade das células, porém menos significante do que as tratadas com o

fármaco, como demonstrado na tabela e figura 2. A IC50 para o grupo sorafenibe

foi 3uM, assim como mostra a tabela e figura 3.

* * * _* * * * *# *# *# *# *# *# *# *#S *#S

*#S _*#S

*#S

*#S _*#S #S

(59)

72 horas (n = 7).

Grupo (ml) Controle 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0

24 hrs 100±0,1 154±0,2* _85±0,1* _71±0,2* _71±0,1* _61±0,1*

48 hrs 100±0,2# _119±0,3*# _88±0,1* _78±0,2*# _79±0,1*# _80±0,2*#

72 hrs 100±0,1#$ _106±0,1*#$ _70±0,2*#$ _65±0,2*#$ _54±0,1*# _54±0,1*#$

*_{P<0,001 vs CT,}#_{P<0,001 vs 24 horas,}$_{P<0,001 vs 48 horas}

Figure 2: Porcentagem de células viáveis tratadas com DMSO por 24, 48 e 72 horas (n=7)

*_{P<0,001 vs CT,}#_{P<0,001 vs 24 horas,}$_{P<0,001 vs 48 horas.}

Tabela 3: Porcentagem de células viáveis tratadas com sorafenibe por 24,

48 e 72 horas (n = 7).

*#S *#S

*# *#S

*#S #S

#

*#

*

*# *# *# *

*

* _*

(60)

Grupos Controle 1 uM 3 uM 5 uM 7 uM 10 uM

24 horas 100±1,1 39±2,5* 47±4,8* 54±2,1* 38±3,4* 30±4,3*

48 horas 100±1,3# _12±1,4*# _43±1,1* _32±2,7*# _18±1,3*# _17±0,8*#

72 horas 100±2,1#$ _6±0,7*#$ _32±1,9*#$ _20±1,7*#$ _18±0,9*# _9±0,9*#$

*_{P<0,001 vs CT,}#_{P<0,001 vs 24 horas,}$_{P<0,001 vs 48 horas}

Figure 2: Porcentagem de células viáveis tratadas com sorafenibe por 24, 48 e 72 horas

(n=7) *P<0,001 vs CT, #P<0,001 vs 24 horas, $P<0,001 vs 48 horas.

4.2. Apoptose 4.2.1. Apoptose

*

*#

*# _*# *

#

*#$ #$

*#$

*#