ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE CLIC

Tanto nos CCEO quanto nos CVO a proteína CLIC4 foi imunoexpressa de forma variada nas células epiteliais tumorais, algumas apresentando apenas marcação citoplasmática e outras marcação no núcleo e no citoplasma, não sendo observado células tumorais apresentando apenas marcação nuclear da proteína (Figuras: 2A-C; 3A-C). A expressão de CLIC4 no parênquima do CCEO foi observada em toda a extensão tumoral, exceto nas áreas onde havia a formação de pérolas de ceratina (Figura. 2A). A expressão de CLIC4 no parênquima tumoral dos CVO foi evidenciada em toda a extensão do epitélio neoplásico, exceto nas células da camada superficial ceratinizada (Figura. 3A).

Comparando as lesões para a marcação de CLIC4 no núcleo, citoplasma e núcleo/citoplasma das células epiteliais tumorais não foi observada diferença significativa (Tabela 2). Na análise descritiva dos casos de mucosa oral normal, observou-se em todos os casos intensa marcação nuclear, predominantemente nas camadas basal e parabasal (Figura 4B).

No estroma tumoral a análise da expressão de CLIC4 revelou um aumento da expressão desta proteína tanto nos CCEO quanto nos CVO (Figuras 2D; 3D). Quando comparada a expressão de CLIC4 no estroma dos CCEO e CVO foi observada diferença significativa (p<0,0001), sendo CEO mais associado ao escore 2 (Figura 2E) em 6,76 vezes (Intervalo de confiança de 95%: 2,33-19,60) quando comparado ao CVO que foi mais associado ao escore 1 (Figura 3E).

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Tabela 2. Distribuição dos casos de carcinoma de células escamosas oral e carcinoma verrucoso

oral de acordo com a imunoexpressão de CLIC4 em núcleo, em citoplasma e em núcleo e citoplasma nas células neoplásicas e imunoexpressão de CLIC4 células mesenquimais

de morfologia fusiforme do estroma tumoral.

Lesão

CCEO CVO Total p

CLIC4 - células epiteliais N Expressão Baixa n 20 15 35 * % 57,1 42,9 100 Expressão Moderada n 12 5 17 CLIC4 - células epiteliais C % linha 70,6 29,4 100,0 0,177 % total 34,3 14,3 48,6 Expressão Alta n 8 10 18 % linha 44,4 55,6 100,0 % Total 22,9 28,6 51,4 Expressão Moderada N 8 10 18 CLIC4 - células epiteliais NC % linha 44,4 55,6 100,0 0,176 % total 22,9 28,6 51,4 Expressão Alta N 12 5 17 % linha 70,6 29,4 100,0 % Total 34,3 14,3 48,6 n 1 12 13 Escore1 % linha 7,7 92,3 100,0 CLIC4 - células Mesenquimais % total 2,9 34,3 37,1 <0,0001 Escore 2 N 19 3 22 % linha 86,4 13,6 100,0 % Total 54,3 8,6 62,9

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN

Legenda: CCEO – carcinoma de células escamosas oral; CVO – carcinoma verrucoso oral; N – núcleo; C – citoplasma; NC – núcleo e citoplasmaa; *: Não foi possível realizar o teste.

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5.3 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE α-SMA NO ESTROMA TUMORAL

Em nossa análise, a imunomarcação de α-SMA nas células mesenquimais revelou que maioria dos casos diagnosticados como CCEO apresentaram escore 2 (n = 14/70%) (Figura 2F), enquanto a maioria dos casos de CVO apresentaram escore 1 (n= 9/60%) (Figura 3F). Entretanto não foi observada diferença estatisticamente significativa entre as lesões. Nos casos de mucosa oral normal evidenciou-se ausência de expressão da proteína α-SMA nas células do tecido conjuntivo, observando-se apenas a marcação do controle positivo dos vasos sanguíneos (Escore 0) (Figura 4C).

5.4 CORRELAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS CLIC4 E α-SMA NO ESTROMA TUMORAL

Quando comparada a imuno-expressão de αSMA e CLIC4 no estroma dos CCEO e CVO foi observada correlação positiva, mas não significativa no CCEO (r:0,350 e p:0,130). Já no CVO foi observada uma correlação positiva e significativa entre as proteínas CLIC4 e SMA (r:0,612 e p:0,015).

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Figura 2. Imunoexpressão de CLIC4 e α-SMA em carcinomas de células escamosas orais. Legenda:

A – Imunoexpressão de CLIC4 em CCEO (IHQ, 1000µm); B – Imunoexpressão de CLIC4 exclusivamente em citoplasma e em núcleo e citoplasma nas células tumorais de CCEO (IHQ, 50µm); C- Perda de expressão nuclear de CLIC4 em células tumorais de CCEO (IHQ, 50µm); D- Imunoexpressão de CLIC4 no estroma tumoral de CCEO (IHQ, 500µm); E- Em detalhe, imunoexpressão de CLIC4 em células fusiformes no estroma de CCEO (IHQ, 50 µm); Imunoexpressão de α-SMA em CCEO (IHQ, 500 µm).

C

D

A

B

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Figura 3. Imunoexpressão de CLIC4 e α-SMA em carcinomas verrucosos orais. Legenda: A-

imunoexpressão de CLIC4 em CVO (IHQ, 500µm); B- Imunoexpressão de CLIC4 exclusivamente em citoplasma e em núcleo e citoplasma nas células tumorais de CVO (IHQ, 50µm); C- Áreas de perda de expressão nuclear de CLIC4 em células de CVO (IHQ, 50 µm); D- Imunoexpressão de CLIC4 no estroma tumoral de CVO (IHQ, 1000µm); E- Em detalhe, imunoexpressão de CLIC4 em células fusiformes no estroma de CVO (IHQ, 50µm); F - Imunoexpressão de α-SMA em CVO (IHQ, 2000µm).

C

D

A

B

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Figura 4. Imunoexpressão de CLIC4 e α-SMA em mucosa oral normal. Legenda; A – Imunoexpressão

de CLIC4 em mucosa oral normal evidenciando marcação nas células do epitélio e ausência de marcação nas células fusiformes do tecido conjuntivo (IHQ, 500 µm); B – Imunoexpressão de CLIC4 no núcleo das células das camadas basal e parabasal do epitélio da mucosa oral (IHQ, 50 µm); C – ausência de imunomarcação de α-SMA em mucosa oral normal, evidenciando-se apenas marcação da proteína nos vasos (IHQ,500 µm).

A

B

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6. DISCUSSÃO

CCEO representa cerca de 90% a 95% das neoplasias malignas que acometem a cavidade oral, apresentando altas taxas de mortalidade (MARSH et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2015). Comumente, os CCEO são diagnosticados em pacientes idosos, do sexo masculino, sendo os dois terços anteriores da língua a região anatômica mais acometida por esta neoplasia (FERNANDEZ et al., 2015; WEATHERSPOON et al., 2015). Evidenciou-se neste estudo achados semelhantes aos encontrados na maior parte da literatura, visto que a média de idade dos pacientes foi de 66,95 anos e que 55,0% (n=11) dos casos acometeram indivíduos do sexo masculino, sendo a língua o sítio anatômico mais frequentemente atigindo 45,0% (N=9).

Em contrapartida, o CVO é uma variante incomum e de baixo grau do CCEO, que possui crescimento lento e sem tendência a metastatizar, sendo uma neoplasia maligna que cursa com características de um tumor benígno (EL-NAGGAR et al., 2017). O CVO acomete predominantemente pacientes do sexo masculino acima da sexta década de vida (EL- NAGGAR et al., 2017; ALONSO et al., 2017). Nesta análise foi observado que a média de idade foi de 61,71 anos, corroborando com os achados descritos na literatura. Em contrapartida, foi observado que 60% (n=9) dos casos de CVO analisados neste estudo ocorreram pacientes do sexo feminino. Achados semelhantes foram encontrados em alguns estudos, onde o sexo feminino também foi o mais acometido pelo CVO (McCOY; WALDRON, 1981; TORNES et al., 1885). A maioria das pesquisas apontam que a mucosa jugal, seguida por rebordo alveolar e gengiva são as regiões anatômicas mais afetadas pelo CVO. Neste estudo o rebordo alveolar 26,7% (n=4) e a mucosa labial 26,7% (n=4) foram os sítios mais acometidos, seguido pela mucosa jugal 20,0% (n=30).

A carcinogênese oral é um processo multifatorial complexo que envolve a inter- relação de fatores capazes de promover danos irreparáveis ao DNA dos ceratinócitos (WARNAKULASURIYA, 2009; VIJAYAVEL e ASWAT, 2013). O desenvolvimento e a progressão dos carcinomas está relacionado ao desequilíbrio na regulação da divisão e morte celular, associado ao microambiente tumoral que exerce papel fundamental na criação de um meio permissivo para o processo de invasão e metástase das células neoplásicas. A compreensão das modificações moleculares que ocorrem nas células tumorais pode fornecer informações importantes para previsão do comportamento biológico das neoplasias malignas. Dentre as alterações estudadas, destaca-se a análise da expressão de CLIC4. A proteína

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CLIC4 está relacionada à regulação do ciclo celular, sendo amplamente estudada na carcinogênese em pele e outros órgãos (SUH et., al., 2007a; SUH et. al., 2012). Além disso, o aumento da expressão de CLIC4 no estroma tumoral sugere uma função importante desta proteína no microambiente tumoral (SUH et al., 2007c).

As proteínas dos canais de transporte cloro desempenham importantes funções contribuindo para a homeostase celular (SHUKLA: YUSPA, 2010: PERETTI et al., 2015). A proteína CLIC4 está relacionada à regulação do ciclo celular, sendo supraregulada em resposta a apoptose mediada pelas proteínas p53 e EMyc (SUH et. al., 2005; SUH et. al.,2007). Nas células epiteliais normais a presença de CLIC4 no núcleo pode indicar parada do crescimento ou apoptose, dependendo do seu nível de expressão (SUH et. al., 2012). Neste estudo, foi realizada uma análise descritiva da imunoexpressão de CLIC4 em 5 casos de mucosa oral, onde foi possível observar uma intensa imunomarcação nuclear principalmente nas células das camadas basal e parabasal, corroborando com o estudo de Suh et. al., 2012.

Em células neoplásicas a CLIC4 está presente no citoplasma e subregulada ou ausente no núcleo (SUH et. al., 2012). No presente estudo, foi avaliada a imunomarcação da proteína CLIC4 em 15 casos de CVO e 20 casos de CCEO. Tanto nos CCEO quanto nos CVO a proteína CLIC4 foi imunoexpressa de forma variada nas células epiteliais tumorais, algumas apresentando apenas marcação citoplasmática e outras marcação no núcleo e no citoplasma, não sendo observado células tumorais apresentando apenas marcação nuclear da proteína. Comparando as lesões para a marcação de CLIC4 no núcleo, citoplasma e núcleo/citoplasma das células epiteliais tumorais não foi observada diferença significativa. Achados semelhantes foram encontrados na análise de Lima et. al., (2016) onde os autores verificaram que em queilites actínicas de baixo grau de malignidade a marcação de CLIC4 era predominantemente nuclear e restrita as camadas basal e parabasal, enquanto que nas queilítes actínicas de alto grau de malignidade ocorreu uma redução na marcação nuclear e aumento da marcação citoplasmática desta proteína até as camadas mais superficiais do epitélio. Além disso, os autores verificaram também que em carcinomas de células escamosas de lábio houve a diminuição da expressão de CLIC 4 no núcleo e aumento no citoplasma, sugerindo que as alterações na expressão de CLIC4 de nuclear para citoplasmática pode constituir um evento importante no controle do ciclo celular estando associada ao processo de carcinogênese labial.

Sabe-se que o status redox têm um papel crítico na regulação da conformação CLIC4 e translocação nuclear. Em geral, as células tumorais malígnas produzem altos níveis de

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espécies reativas de oxigênio e estão em potencial estado de estresse oxidativo. Para compensar, moléculas antioxidantes chave são geralmente superelevadas em células cancerosas, com destaque para a elevação dos níveis de glutationa que facilitam a evasão da senescência induzida por espécies reativas de oxigênio (TRACHOOTHAM et al., 2008;). O estado excessivamente antioxidante das células cancerosas pode inibir as modificações CLIC4 necessárias para a translocação nuclear (SUH et al., 2012). Em nosso estudo observamos que algumas células tumorais mantinham uma marcação nuclear e citoplasmática. Esta marcação nuclear era fraca em boa parte das células. Entretanto, algumas células tumorais mantinham uma marcação nuclear mais intensa associada à marcação citoplasmática, sugerindo que provavelmente estas células estão em um estado de senescência ou parada de crescimento.

Uma forte regulação do CLIC4 no estroma tumoral é um achado consistente em muitos tipos de câncer humano e sugere uma função importante para a proteína CLIC4 no microambiente tumoral (SUH et al., 2007a). Ao analizarmos a expressão de CLIC4 no estroma tumoral de ambas as lesões obtivemos achados semelhantes, observando-se um aumento da expressão desta proteína tanto nos CCEO como no CVO. Quando comparada a expressão de CLIC4 entre as lesões foi evidenciado uma diferença significativa (p<0,0001), sendo CCEO associado a uma maior expressão da proteína no estroma. Tal achado pode está relacionado a uma maior inter-relação das células tumorais com as células do estroma após o processo de invasão. Sugere-se que as células do CCEO provavelmente produzem mais fatores relacionados ao processo de diferenciação das células estromais que compõem o microambiente tumoral.

A principal célula estromal que compõe o microambiente tumoral são os fibroblastos associados ao câncer (FAC), também denominados de miofibroblastos (OTRANTO et al., 2012; CURRY, 2014). Os FAC são células altamente especializadas que diferem dos fibroblastos normais pela supeerxpressão α-SMA e pela capacidade de sintetizar altos níveis de proteínas da matriz extracelular, proteinases e fatores de crescimento (EGEBLAD et al., 2005; KELLERMANN et. al., 2008) Os miofibroblastos foram identificados no estroma de diversos tumores sólidos malígnos. Algumas pesquisas apontam que a presença destas células no estroma cria um ambiente permissivo para o processso de invasão tumoral e metástase (DE ASSIS et al., 2012; WHEELER et al., 2014).

O estudo de Kellermann et. al., 2007 avaliou a presença de miofibroblastos em carcinomas de células escamosas de língua, displasias epiteliais e mucosa oral normal, e

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constatou que os miofibroblastos estão presentes apenas no estroma dos carcinomas. Em nossa análise, avaliamos a imunoexpressão de α-SMA no estroma dos CCEO e CVO. Foi possível constatar que os CCEO foram mais associados ao escore 2, enquanto os CVO estiveram mais associados ao escore 1 entretanto, não foi observada diferença estatisticamente significativa entre as lesões. Nos casos de mucosa oral normal não foi observada imunomarcação de α-SMA nas células do tecido conjuntivo, sendo visualizada apenas a marcação do controle positivo dos vasos sanguíneos. Achados semelhantes foram observados no estudo de Kristen et al., 2014, onde os autores avaliaram a imunoexpressão de α-SMA em hiperplasias verrucosas orais, CVO e CCEO, e não observaram diferença significativa na marcação de SMA entre os CVO e CCEO. Já nos casos de hiperplasias verrucosas orais os autores não observaram a presença de miofibroblastos no tecido conjuntivo.

Tanto α-SMA como CLIC4 são marcadamente supra-regulados e colocalizados no estroma tumoral, sugerindo que CLIC4 é um marcador comum para a diferenciação de miofibroblastos e provavelmente participa no processo de formação destas células (SUH et. Al., 2007a). Neste estudo, a análise da correlação entre as CLIC4 e α-SMA no estroma tumoral revelou correlação positiva, mas não significativa entre as proteínas CLIC4 e α-SMA nos casos de CCEO (r:0,350 e p:0,130). Já nos casos de CVO foi observada uma correlação positiva e significativa entre estes marcadores (r:0,612 e p:0,015). Neste contexto, a pesquisa de SUH et. al., (2007a) buscou determinar se a indução de CLIC4 e α-SMA no estroma envolve uma interação com células tumorais. Fibroblastos de ratos normais foram cultivados com células de tumor de mama humana MCF10CA1a ou células epiteliais de mama normais e monitorados para expressão de CLIC4 e α-SMA. Os autores puderam observar que fibroblastos adjacentes às ilhas tumorais, coexpressam α-SMA e CLIC4. Esta resposta não foi induzida na co-cultura com células epiteliais normais da mama. Com o aumento da distância das ilhas tumorais, apenas o CLIC4 citoplasmático é detectado em fibroblastos, e com uma distância ainda maior, nenhum dos dois é detectado.

Em nossa pesquisa, a análise tanto da CLIC4 quanto do α-SMA nos CVO foi realizada na região subepitelial, logo as células avaliadas estavam em proximidade direta com as células tumorais observando-se que quando havia aumento da expressão de CLIC4 a de α-SMA aumentava proporcionalmente. Já nos casos de CCEO, devido à difilculdade de obtenção de peças cirúrgicas para a avaliação da região de front tumoral, foram utilizadas biópsias incisionais, sendo observado que na grande maioria dos casos a marcação de CLIC 4 tinha escore 2, mas que a marcação de α-SMA em

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alguns tumores apresentou escore 1, fato este que poderia explicar a correlação positiva porém não significativa nos casos de CCEO. Nos casos de mucosa oral normal avaliados não foi observada marcação de CLIC4 e α-SMA no tecido conjuntivo.

Em resumo, a ausência ou redução da marcação nuclear de CLIC4 nas células epiteliais tumorais provavelmente constitui um evento importante no controle celular e pode está relacionado à carcinogênese oral, ressaltando-se que, o aumento da expressão de CLIC4 nas células do estroma pode exercer influência sobre a expressão da proteína α-SMA. A realização da presente pesquisa nos permite sugerir que a presença de miofibroblastos no estroma está relacionado à um fenótipo de malignidade nas lesões.

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7. CONCLUSÕES

▪ A expressão de CLIC4 nas células tumorais apresentou-se predominantemente citoplasmática ou núcleo/citoplasmática tanto nos casos de CCEO quanto nos de CVO, não sendo observada diferença as lesões.

▪ No estroma tumoral ocorreu um aumento da expressão de CLIC4 em ambas as lesões, apresentando os casos de CCEO uma expressão de CLIC4 significativamente maior que na amostra analisada de CVO.

▪ A presença de miofibroblastos no estroma tumoral tanto dos CCEO quanto nos de CVO, sugere que a presença destas células no mesênquima está associado a um fenótipo de malignidade das lesões.

▪ O aumento da expressão de CLIC4 no estroma tumoral está correlacionado ao aumento da expressão de α-SMA, sugerindo que a expressão de CLIC4 regula positivamente a expressão de α-SMA nos processos neoplásicos analisados.

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