Imunoexpressão de CLIC4 e α-SMA em carcinoma de células escamosas oral e carcinoma verrucoso oral

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

MARIANA CARVALHO XEREZ

IMUNOEXPRESSÃO DE CLIC4 E α-SMA EM CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL E CARCINOMA VERRUCOSO ORAL

Natal - RN 2018

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MARIANA CARVALHO XEREZ

IMUNOEXPRESSÃO DE CLIC4 E α-SMA EM CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL E CARCINOMA VERRUCOSO ORAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Patologia Oral. ORIENTADOR: Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa

Natal – RN 2018

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Dedico este trabalho a minha amada

avó Carmélia Ximenes do Prado de

Carvalho (in memoriam). Não existem

palavras que possam definir a imensa

falta que tua presença faz. Para sempre

em minha memória a lembrança do teu

rosto, das tuas histórias e dos teus

passos.

A Deus, a Nossa Senhora das Graças e aos Guias Espirituais por todas as conquistas

de

A Deus, a Nossa Senhora e aos Guias Espitituais por todas as conquistas adquiridas. A minha amada mãe Antônia Evânia Ximenes de Carvalho pelo seu amor

incondicional.

Ao meu pai José Hibernon Dias Xerez, ao meu irmão Edilberto Carvalho Xerez e a minha tia Raimunda Ximenes de Carvalho (tia Rá).

Ao meu orientador Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa pela confiança na realização deste trabalho e ensinamentos transmitidos.

A professora Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira por toda a disponibilidade e contribuição na construção deste trabalho.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral: Dra. Márcia

Cristina da Costa Miguel, Dra. Ana Miryam Costa de Medeiros, Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Dra. Roseana de Almeida Freitas, Dra. Lélia Batista de Souza, Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, Dr. Leão Pereira Pinto, Dr. Pedro Paulo de Andrade Santos, Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel e Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza, pela contribuição na minha formação acadêmica.

Aos funcionários Hévio, Gracinha, Sandrinha, Betty, Ricardo, Lourdinha pelo carinho, atenção e dedicação ao trabalho.

A todos os colegas do mestrado e doutorado pelo companheirismo nesta jornada, especialmente a Éverton Freitas, Cristianne Medeiros, Débora Gondim, Dáurea Cobe,

Rômulo Augusto, Ondina Karla, Israel leal, Larissa Amaral, Patrícia Peixe, Rodrigo Mafra, Luciana Castro, Hianne Morais e Neumara

A Juliana Campos Pinheiro e Rafaella Bastos Leite pelos bons momentos que compartilhamos;

A Caio César pelas inúmeras vezes que me ajudou.

A Yailit Del Carmen Martinez pelo companheirismo principalmente no final desta jornada.

A Glória Maria De França por nos divertir com seu jeito único

A Hellen Bandeira por toda a disponibilidade em ajudar a todos que lhe pedem auxílio.

A todos os meus amigos por fazerem a minha vida mais feliz: Em especial a Luan

Éverton Galdino Barnabé pelo apoio, carinho e torcida.

A Francisco Ferreira de Bessa Neto por ter tornado os meus dias em Natal mais divertidos.

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e a Coordenação

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RESUMO

Dentre as neoplasias malignas que acometem a cavidade oral destacam-se o carcinoma de células escamosas oral (CCEO), por ser o mais frequente e apresentar altas taxas de morbidade e mortalidade, e o carcinoma verrucoso oral (CVO) que exibe um comportamento distinto, tratando-se de uma variante de baixo grau do carcinoma de células escamosas oral. O desenvolvimento e a progressão destas neoplasias malignas estão relacionados ao desequilíbrio na regulação da divisão e morte celular, associado ao microambiente tumoral. A proteína CLIC4 está relacionada à regulação do ciclo celular, sendo supraregulada em resposta a apoptose e também participando do processo de transdiferenciação dos fibroblastos em fibroblastos associados ao câncer (FAC), que passam a expressar α-SMA. Os FACs são os principais componentes celulares do microambiente tumoral, tendo sido relacionados com a agressividade e o prognóstico de diversos tumores. O objetivo deste estudo foi avaliar comparativamente a imunoexpressão das proteínas CLIC4 e α-SMA em carcinomas orais. A amostra consistiu em 20 casos de CCEO, 15 casos de CVO e 5 casos de MO. A partir dos prontuários, foram coletados dados clínicos referentes à idade, gênero e localização da lesão. Foi realizada uma análise morfológica em HE e semiquantitativa da expressão imuno-histoquímica das proteínas CLIC4 e α-SMA em amostras de material parafinado das lesões. Para verificar associações foram utilizados os testes do Qui-quadrado de Pearson e Exato de Fisher, assumindo uma significância de 5%. Para buscar correlação foi utilizado o teste de Spearman. Resultados: Dentre os CCEO a maioria ocorreu em pacientes do sexo masculino (n=11/55,0%), com idade media de 66,95 anos e a localização anatômica mais acometida foi língua (n=9/45,0%). Para o CVO o sexo com maior frequência foi o feminino (n=9/60,0%), a idade media foi de 61,71 anos, e a localização mais acometida foi o rebordo alveolar (n=4/26,7%) e a mucosa labial (n=4/26,7%). Para a análise da expressão de CLIC4 foi considerada sua localização celular. Comparando as lesões para a marcação de CLIC4 no núcleo, citoplasma e núcleo/citoplasma das células epiteliais tumorais não foi observada diferença significativa. Quando comparada a expressão de CLIC4 no estroma dos CCEO e CVO foi observada diferença significativa (p<0,0001). A análise da imunomarcação de α-SMA nas células mesenquimais dos CCEO e CVO revelou um aumento da expressão desta proteína no estroma tumoral de ambos os tumores, não sendo observada diferença significativa entre as lesões. Quando comparada a imuno-expressão de αSMA e CLIC4 no estroma dos CCEO e CVO foi observada correlação positiva, mas não significativa no CCEO (r: 0,350 e p: 0,130). Já no CVO foi observada uma correlação positiva e significativa entre as proteínas CLIC4 e α-SMA (r: 0,612 e p: 0,015). Em conclusão, os resultados do presente estudo sugerem que a diminuição ou ausência da marcação nuclear da proteína CLIC4, associada ao aumento de expressão desta proteína no estroma tumoral parece contribuir para o processo de carcinogênese e progressão do CCEO e CVO e pode ter influência na expressão de α-SMA.

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Abstract

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Among the malignant neoplasias affecting the oral cavity, oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most frequent presenting high rates of morbidity and mortality, and oral verrucous carcinoma (OVC), which exhibits a behavior distinct from a low grade variant of oral squamous cell carcinoma. The development and progression of these malignant neoplasms are related to the imbalance in the regulation of cell division and death associated to the tumor microenvironment. CLIC4 protein is related to the regulation of the cell cycle, being supraregulated in response to apoptosis and also participating in the process of transdifferentiation of fibroblasts in cancer-associated fibroblasts (CAF), which now express α-SMA. CAFs are the main cellular components of the tumor microenvironment, having been related to the aggressiveness and prognosis of several tumors. The aim of this study was to evaluate the immunoexpression of CLIC4 and α-SMA proteins in oral carcinomas. The sample consisted of 20 cases of OSCC, 15 cases of OVC and 5 cases of OM. From the medical records, clinical data regarding the age, gender and location of the lesion were collected. A morphological analysis was performed on HE and semiquantitative immunohistochemical expression of the CLIC4 and α-SMA proteins in samples of paraffin-shaped lesion material. Pearson's Chi-square test and Fisher's exact test were used to verify associations. The Spearman test was used to search for correlation. Significance was set at of 5%. Results: Among the OSCC, the majority occurred in male patients (n = 11; 55.0%), with a mean age of

66.95 years and the most affected anatomic location was tongue (n = 9; 45.0%). The OVC was the female sex (n = 9; 60.0%), the mean age was 61.71 years, and the alveolar ridge was the most affected (n = 4; 26.7%) and lip mucosa (n = 4; 26.7%). For the analysis of CLIC4 expression, its cellular location was considered. Comparing the lesions for CLIC4 labeling in the nucleus, cytoplasm and nucleus /cytoplasm of tumor epithelial cells, no significant difference was observed. When comparing CLIC4 expression in the OSCC and OVC stroma, a significant difference was observed (p <0.0001). The analysis of α-SMA immunostaining in mesenchymal cells of OSCC and OVC revealed an increase in the expression of this protein in the tumor stroma of both tumors, and no significant difference was observed between the lesions. When comparing the immunoexpression of αSMA and CLIC4 in the stroma of OSCC and OVC, a positive correlation was observed but not significant in OSCC (r: 0.350 and p: 0.130). In the OVC, a positive and significant correlation was observed between the CLIC4 and α-SMA proteins (r: 0.612 and p: 0.015). In conclusion, the results of the present study suggest that the decrease or absence of CLIC4 protein nuclear marking associated with increased expression of this protein in the tumor stroma seems to contribute to the process of carcinogenesis and progression of CCEO and CVO and may have an influence on expression of α-SMA.

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LISTA DE ILUSTRAÇÔES

FIGURA 1. (A) Sinalização de TGF-β em célula normal promovendo a translocação nuclear de CLIC4 e Schnurri-2. A CLIC4 no núcleo inibe a ligação de p- Smad2-3 a PPM1a e outras fosfatases ,e assim retarda a sua desfosforilação, prolongando o sinal de TGF-β. (B) A ausência de CLIC4 em células tumorais impediria a estabilização de P-Smad2-3, levando a desfosforilação, e consequentemente diminuindo a responsividade ao TGF-β nestas células (SHUKLA, YUSPA , 2010)...

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FIGURA 2. Imunoexpressão de CLIC4 e α-SMA em carcinomas de células escamosas

orais. Legenda: A – Imunoexpressão de CLIC4 em CCEO (IHQ, 1000µm); B – Imunoexpressão de CLIC4 exclusivamente em citoplasma e em núcleo e citoplasma nas células tumorais de CCEO (IHQ, 50µm); C- Perda de expressão nuclear de CLIC4 em células tumorais de CCEO (IHQ, 50µm); D- Imunoexpressão de CLIC4 no estroma tumoral de CCEO (IHQ, 500µm); E- Em detalhe, imunoexpressão de CLIC4 em células fusiformes no estroma de CCEO (IHQ, 50 µm); Imunoexpressão de α-SMA em CCEO (IHQ, 500 µm)...

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FIGURA 3. Imunoexpressão de CLIC4 e α-SMA em carcinomas verrucosos orais. Legenda:

A- imunoexpressão de CLIC4 em CVO (IHQ, µm); B- Imunoexpressão de CLIC4 exclusivamente em citoplasma e em núcleo e citoplasma nas células tumorais de CVO (IHQ, µm); C- Áreas de perda de expressão nuclear de CLIC4 em células de CVO. D- Imunoexpressão de CLIC4 no estroma tumoral de CVO (IHQ, µm); E- Em detalhe, imunoexpressão de CLIC4 em células fusiformes no estroma de CVO (IHQ, µm); F - Imunoexpressão de α-SMA em CVO (IHQ, µm)...

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FIGURA 4. Imunoexpressão de CLIC4 e α-SMA em mucosa oral normal. Legenda; A –

Imunoexpressão de CLIC4 em mucosa oral normal evidenciando marcação nas células do epitélio e ausência de marcação nas células fusiformes do tecido

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conjuntivo (IHQ, 500 µm); B – Imunoexpressão de CLIC4 no núcleo das células das camadas basal e parabasal do epitélio da mucosa oral (IHQ, 50 µm); C – ausência de imunomarcação de α-SMA em mucosa oral normal, evidenciando-se apenas marcação da proteína nos vasos (IHQ,500 µm)...

QUADRO 1 Quadro evidenciando a especificidade para os anticorpos que serão utilizados,

diluição, tempo de incubação e

fabricante... 53

QUADRO 2 Quadro evidenciando as variáveis que serão analizadas, bem como a sua classificação e categorização...

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LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Distribuição absoluta e relativa dos casos de CCEO e CVO de acordo com os parâmetros clínicos de localização e sexo...

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TABELA 2. Distribuição dos casos de carcinoma de células escamosas oral e carcinoma verrucoso oral de acordo com a imunoexpressão de CLIC4 em núcleo, em citoplasma e em núcleo e citoplasma nas células neoplásicas e imunoexpressão de CLIC4 células mesenquimais de morfologia fusiforme do estroma tumoral...

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

CCEO

CLIC

CTLA4

Carcinoma de Células Escamosas Oral

Canais Intracelulares de Cloro/Cloreto

Do inglês, cytotoxic T-lymphocyte–associated antigen 4, traduzido como antígeno 4 associado a linfócito T citotóxico

CV

CVO

DNA

Carcinoma Verrucoso

Carcinoma Verrucoso Oral

Do inglês, deoxyribonucleic acid, traduzido como ácido desoxirribonucleico

EGF

EGFR

Do inglês, EpidermalGrowth Factor, traduzido como fator de crescimento epidérmico

Do inglês, EpidermalGrowth Factor Receptor, traduzido como receptor do fator de crescimento epidérmico

FAC

FNDC1

Fibroblastos Associados ao Câncer

Do inglês, Fibronectin type III domain containing 1

FSP1

GM-CSF

Do inglês, Fibroblast-specific protein 1,traduzido como proteína 1 específica de fibroblasto

Do inglês, Granulocyte-macrophage colony-stimulating

factor, traduzido como fator estimulador de colônia de

granulócitos-macrófagos

HGF

HPV

Do inglês, Hepatocyte growth fator, traduzido como fator de crescimento de hepatócitos

Do inglês, human papillomavirus, traduzido como papilloma vírus humano

IGF-II Do inglês, Insulin-like growth factor 2, traduzido como fator de crescimento semelhante a insulina 2

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IL

KGF

Interleucina

Do inglês, keratinocyte growth factor, traduzido como fator de crescimento de queratinócitos MEC MO MYC Matriz Extracelular

Organização Mundial da Saúde

Do inglês, polymerase chain reaction, traduzido como reação em cadeia da polimerase

Do inglês, programmed death 1, proteína de morte celular programada 1

PDGF Do inglês, Platelet-derived growth fator, traduzido como fator de crescimento derivado de plaquetas

PDGFR

PDL

PINP

SERPINE1

Do inglês, Platelet-derived growth factor receptors, traduzido como receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas

Do inglês, Programmed death-ligand, ligante da proteína de morte celular

Pró-peptídeo N-terminal do colágeno tipo I

Do inglês, serpin peptidase inhibitor, clade E, member 1

SDF-1

STC2

Do inglês, stromal cell-derived factor 1, traduzido como fator derivado das células do estroma-1

Do inglês, stanniocalcin 2

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TGF-β Do inglês TransformingGrowthFactorβ, traduzido como fator de transformação do crescimento-β

TNF-α

TNM

Do inglês Tumor Necrosis Fator α, traduzido como fator de necrose tumoral

Classificação Tumor Nódulo Metástase

UFRN Universidade Federal Do Rio Grande do Norte

VEGF Do inglês, Vascular endothelial growth fator, traduzido como

fator de crescimento endotelial vascular

α-SMA Do inglês α-SmoothMuscleActin, traduzido como alfa actina de músculo liso

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 24 2 REVISÃO DE LITERATURA. ... 27

2.1 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL ... 27 2.2 CARCINOMA VERRUCOSO ORAL ... 31 2.3 CANAIS INTRACELULARES DE CLORO 4 (CLIC4) ... 34 2.4 FIBROBLASTOS ASSOCIADOS AO CÂNCER ... 39

3 OBJETIVOS ... 48 3.1 OBJETIVOS GERAIS ... 48 3.2 OBJETIIVOS ESPECÍFICOS ... 48 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 50 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ... 50 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO. ... 50 4.3 POPULAÇÃO E AMOSTRA. ... 50 4.4 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA. ... 50

4.4.1 Critérios de inclusão ... 50 4.4.2 Critérios de exclusão ... 51

4.5 ESTUDO CLÍNICO ... 51 4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO. ... 51 4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO. ... 51

4.7.1 Coloração pelo método imuno-histoquímico. ... 51 4.7.2 Análise do perfil imuno-histoquímico ... 53

4.8 VARIÁVEIS DO ESTUDO ... 54 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA. ... 54

5 RESULTADOS ... 57

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA. ... 57 5.2 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE CLIC4. ... 58 5.3 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE SMA NO ESTROMA TUMORAL... 60 5.4 CORRELAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS CLIC4 E SMA NO

ESTROMA TUMORAL... 60

6 DISCUSSÃO. ... 65 7 CONCLUSÕES ... 71

20 8 REFERÊNCIAS ... 73 9 APÊNDICES. ... 86 10 ANEXOS ... 89

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1. INTRODUÇÃO

Dentre as neoplasias malígnas que acometem a cavidade oral, o carcinoma de células escamosas é o mais frequente, sendo a oitava neoplasia maligna mais comum no mundo, apresentando altas taxas de mortalidade (RODRIGUES et al., 2014). Estima-se que, anualmente, cerca de 300.000 novos casos de câncer na cavidade oral surjam na população mundial e que, aproximadamente 145.400 pacientes virão a óbito em decorrência da doença (FERLAY et al., 2015). No Brasil, a estimativa para o ano de 2016 foi de 15.490 novos casos, e o número de mortes no ano de 2013 foi de 5.401 (INCA 2015). Em contrapartida, o carcinoma verrucoso oral é incomum, e embora também seja uma neoplasia maligna, exibe crescimento lento, sem tendência a metastizar, possuindo um bom prognóstico (EL- NAGGAR et al., 2017; ALONSO et al., 2017).

A carcinogênese oral é um processo multifásico complexo, que envolve a inter-relação de fatores capazes de promover danos irreparáveis ao DNA dos ceratinócitos orais, levando a um fenótipo maligno. (WARNAKULASURIYA, 2009; VIJAYAVEL e ASWAT, 2013).

Uma das vias de sinalização citadas na literatura é conduzida pela família dos canais intracelulares de cloro (CLIC), cujas funções estão relacionadas à regulação do ciclo celular (SHUKLA e YUSPA 2010). Dentre as proteínas produzidas por esta família, destaca-se a CLIC4, que vem sendo muito estudada em diversos tipos de câncer (SUH et al., 2007a; YAO et al., 2009; SUH et al., 2012).

A proteína CLIC4 está presente no citoplasma e nas mitocôndrias dos ceratinócitos, sendo supraregulada em resposta a apoptose mediada pelas proteínas p53 e cMyc (SUH et al., 2005; SUH et al., 2007b). Observou-se que nas células de tecido normal a CLIC4 está localizada no núcleo, porém em células tumorais é encontrada no citoplasma. Também foi identificado que esta proteína é subregulada em fibroblastos de tecidos normais, mas é supra- regulada no estroma tumoral quando está ocorrendo a conversão de fibroblastos para miofibroblastos (SUH et al., 2007a).

Os fibroblastos associados ao câncer (FAC) (também denominados miofibroblastos) são os principais constituintes celulares do estroma de muitos carcinomas (CARNEIRO- LÚCIO, 2013). São células que apresentam um imunofenótipo híbidro com características de fibroblastos e de células musculares lisas, capazes de expressar a isoforma α da actina de músculo liso (α-SMA) (KELLERMANN et al., 2008).

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Estas células são capazes de sintetizar e secretar proteínas da matriz extracelular (MEC), proteases e diversos fatores (DE-ASSIS et al., 2012). Estudos mostram que a presença de FACs no estroma estimula a proliferação das células neoplásicas e cria um ambiente permissivo para o processo de invasão tumoral e metástase (KELLERMANN et al., 2007; DE ASSIS et al., 2012).

Diante das funções e vias de atuação da CLIC4 na tumorigênese e do papel dos FAC na promoção do crescimento e da invasão tumoral, torna-se necessário identificar se existe associação desta proteína na carcinogênese oral e se há correlação entre a sua superexpressão no estroma com o aumento do número de FAC. Assim, o presente trabalho tem por objetivo identificar e comparar expressão da proteína CLIC4 e a presença de FAC através da imunoexpressão de α-SMA, para verificar se há diferença de expressão entre o CCEO e o CVO, já que estas neoplasias malignas apresentam comportamento biológico distinto.

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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL

Os cânceres orais (CO) estão entre tumores malígnos mais prevalentes na população mundial. O termo câncer oral refere-se ao conjunto de neoplasias malignas que podem acometer os diferentes tecidos da cavidade oral e dos lábios. Destes CO, cerca de 90% a 95% dos casos são de carcinoma de células escamosas oral (CCEO), seguido pelo carcinoma verrucoso, tumores de glândula salivar menor, sarcomas e melanoma (MARSH et al., 2011; CHI et al., 2015; OLIVEIRA et al., 2015). O CCEO, também conhecido como carcinoma espinocelular ou carcinoma epidermóide, é uma neoplasia maligna que se origina do epitélio escamoso que reveste a mucosa oral e o vermelhão dos lábios (MARSH et al., 2011).

O CCEO acomete predominantemente homens após a quinta década de vida. O Intituto Nacional do Câncer (INCA) estimou para o ano de 2016 o surgimento de aproximadamente 15.490 novos casos na população brasileira, sendo que destes, 11.140 lesões acometeriam homens e 4350 mulheres (INCA, 2016).

A incidência do CCEO difere de um país para o outro devido às diferenças na exposição dos indivíduos aos fatores de risco. O estilo de vida, os hábitos, a herança cultural e o nível intelectual da população, além dos aspectos socioeconômicos, expectativa de vida e qualidade dos serviços de saúde, influenciam não só na incidência como também no grau de morbidade e mortalidade relacionadas ao CCEO (BRENER et al., 2007). O Brasil se destaca entre os países ocidentais por exibir uma alta prevalência de CO, sendo a maior dentre os da América Latina (WARNAKULASURIYA, 2009).

O CCEO é causado por mutações e alterações epigenéticas do DNA, que levam a superexpressão de oncogenes e o silenciamento de genes supressores de tumor, afetando de forma irreversível a regulação do processo de divisão e morte celular dos ceratinócitos que revestem a mucosa oral. Essas células tornam-se autônomas sendo capazes de degradar a membrana basal e invadir os tecidos vizinhos e, em estágios mais avançados, se disseminar através dos vasos para linfonodos regionais e órgãos distantes. Estas alterações são induzidas pela exposição a agentes mutagênicos que podem ser químicos, físicos ou microorganismos (BAGAN e SCULLY, 2009; SCULLY 2011).

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Diversos fatores de risco estão associados ao desenvolvimento do CCEO. O consumo de tabaco e álcool, exposição crônica aos raios solares, papiloma vírus humano (HPV) e alterações genéticas são apontados como possíveis agentes etiológicos. Geralmente estes fatores atuam de forma sinérgica sobre as células epiteliais que revestem a mucosa oral contribuindo para sua transformação maligna (MARUR et al., 2010; ERNANI e SABA, 2015; WEATHERSPOON et al., 2015). O uso crônico de tabaco e álcool e o sinergismo desses dois fatores são reconhecidos como os principais fatores de risco relacionados ao desenvolvimento desta neoplasia. Mais de 60 substâncias carcinogênicas capazes de promover danos diretos ao DNA foram identificadas na fumaça inalada do tabaco e muitos destes carcinógenos também são encontrados no tabaco de mascar (PETTI, 2009). Já o mecanismo carcinogênico do álcool ainda não foi completamente elucidado. Acredita-se que o produto de seu metabolismo, o acetaldeído, possa agir como um solvente facilitando a passagem de carcinógenos através das membranas celulares (YOKOYAMA, MIZUKAMI, YOKOYAMA, 2015). Assim, o tabaco seria um agente iniciador e o álcool um agente promotor da carcinogênese (COTRAN et al., 2009).

A participação efetiva do HPV de alto risco, principalmente os do tipo 16 e 18, no processo de carcinogênese em orofaringe é comumente citado na literatura (KAWAKAMI et al., 2013). Entretanto, a associação deste vírus na etiopatogênese do CCEO ainda é controversa. Diversos estudos sobre a presença do HPV em CCEO mostraram índices de positividade variando de 0% a 100% (METGUD et al. 2012). Entretanto, a simples evidência da infecção pelo vírus não é suficiente para determinar uma transformação maligna em cavidade oral, pois a maioria dos pacientes infectados pelo HPV não desenvolvem cânceres. Assim, a hipótese mais provável para uma possível associação do HPV com a carcinogênese oral, não é sua presença isolada, mas sim a interação sinérgica do vírus com outros carcinógenos (LÜBBE et al., 1996; METGUD et al. 2013).

O CCEO pode se desenvolver a partir da mucosa oral aparentemente normal ou ser antecedido por lesões potencialmente malignas como a leucoplasia e a eritroplasia na cavidade oral e a queilite actínica no lábio. Esta neoplasia manifesta-se clinicamente de forma variada, podendo se apresentar como um nódulo exofítico papilar ou verrucoso ou como uma lesão endofítica de aspecto ulcerado ou crateriforme, e ainda como placas leucoplásicas, eritroplásicas ou eritroleucoplásicas. Na fase inicial geralmente as lesões são assintomáticas, o que pode explicar a demora na procura dos pacientes por aconselhamento profissional, o que

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consequentemente resulta no diagnóstico da doença em um estágio mais avançado. (MONTERO e PATEL, 2015; NEVILLE et al., 2016)

Esta neoplasia malígna pode surgir em qualquer região anatômica da cavidade oral, sendo mais frequente em língua e assoalho bucal (EL-MOFTY et al., 2014; RIKARDSEN et al., 2014). Os tumores de língua apresentam um pior prognóstico quando comparados a outros sítios anatômicos da cavidade oral, orofaringe ou laringe (RUSTHOVEN et al., 2008). O lábio inferior é outro sítio bastante acometido, principalmente em indivíduos que se expõem cronicamente a radiação solar (RODUST et al., 2009; CZERNINSKI; ZINI; SGAN-COHEN; 2010). Nos países como a Índia, onde a população tem o hábito de mascar betel, a localização mais comum é a mucosa jugal (MUTTAGI et al., 2012).

Histopatologicamente o CCEO caracteriza-se como uma neoplasia maligna de origem epitelial que pode exibir variáveis graus de diferenciação escamosa. Observam-se lençóis, ilhas, ninhos ou cordões de células malignas que invadem o tecido conjuntivo subjacente. As células tumorais tendem a apresentar diversas atipias como aumento da relação núcleo- citoplasma, pleomorfismo celular e nuclear, núcleos hipercromáticos ou vesiculosos com nucléolos evidentes e mitoses atípicas. A produção de pérolas de ceratina no interior do parênquima tumoral e áreas focais de necrose também podem ser vistas. No estroma tumoral frenquentemente nota-se a presença de uma reação inflamatória (NEVILLE et al., 2016; EL- NAGGAR et al., 2017).

A lesão progride invadindo profundamente o tecido conjuntivo, adiposo, músculo e osso subjacentes, podendo ser encontrada invasão perineural e vascular. (NEVILLE et al., 2016; EL-NAGGAR et al., 2017).

Devido aos variados aspectos microscópicos que o CCEO pode exibir, muitos estudos foram realizados visando correlacionar o comportamento biológico do tumor com os achados histopatológicos da lesão. Assim, diversos sistemas de classificação foram propostos, destacando-se os de Broders (1920), Jakobsson et al. (1973), Anneroth, Batsakis e Luna (1987), Bryne (1998), Brandwein-Gensler et al. (2005), Almangush et al. (2014). A Organização Mundial de Saúde (OMS) sugere que a gradação histológica do tumor seja baseada no grau de diferenciação celular, classificando as lesões como pouco, moderadamente ou bem diferenciadas (EL- NAGGAR et al., 2017).

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Apesar dos avanços nas pesquisas em tentar identificar características moleculares e os melhores sistemas de gradação histopatológica como fatores prognósticos para o CCEO, a utilização do estadiamento clínico do paciente baseado no sistema TNM, continua sendo a mais utilizada para indicar o tratamento e prognóstico dos pacientes. Neste sistema a letra T representa o tamanho do tumor primário, N metástases nos linfonodos regionais e M presença ou ausência de metástases à distância (KREPPEL et al., 2011; NEVILLE et al., 2016).

O prognóstico dos pacientes com CCEO depende do estágio do tumor (KREPPEL, et al., 2011). Os CCEO frequentemente metastatizam para os linfonodos cervicais (NOGUTI et al, 2012). A presença de metástase regional é considerada um importante fator prognóstico para o CCEO, estando diretamente relacionado a uma menor sobrevida global dos pacientes (SUSLU et al., 2013). Os mecanismos pelos quais os CCEO frequentemente metastatizam não estão completamente elucidados. No entanto, para os tumores de língua e assoalho bucal, especula-se que a propagação metastática especula-seria favorecida por características anatômicas específicas da região, como a ampla rede de vasos linfáticos, que poderia favorecer o transporte de células tumorais para os linfonodos regionais (CHUNG et al., 2010; SUSLU et al., 2013).

A análise de genes e proteínas específicas relacionadas ao CCEO e o papel do microambiente tumoral na progressão da doença vem sendo cada vez mais estudado. Sabe-se que as células neoplásicas dependem de um microambiente tumoral altamente complexo para o seu desenvolvimento e progressão nos tecidos adjacentes (ALBINI e SPORN, 2007). As principais células estromais que compõem o microambiente tumoral são os FACs (Fibroblastos Associados ao Câncer), células inflamatórias e outras células de suporte, como as células endoteliais sanguíneas e linfáticas (CURRY, 2014). Estas células desempenham um importante papel na progressão tumoral, pois são capazes de secretar fatores estimuladores necessários para criar um ambiente que permita a invasão das células neoplásicas (MARSH et al., 2011).

O tatamento de escolha para o CCEO é a ressecção cirúrgica do tumor, que pode ser associado à radioterapia e/ou quimioterapia dependendo do estágio do tumor, da localização da lesão e da condição sistêmica do paciente (MONTERO, PATEL, 2015). Protocolos quimioterápicos associados à radioterapia são indicados para pacientes em estágios mais avançados da doença (HINO et al.,2014). Além disso, outras estratégias terapêuticas estão sendo empregadas, como a utilização de anticorpos monoclonais que tem como alvo, por

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exemplo, o bloqueio dos inibidores de checkpoints, tais como PD-1 (Nivolumab e Pembrolizumab) e seus ligantes (PD-L1 e PD-L2) e CTLA-4 (Ipilimumab), anti-EGFR (Cetuximab e Nimotuzumab) e anti-EpCAM (Catumaxomab) (EGAN et al., 2007). Apesar dos avanços nas pesquisas e opções de tratamento, o prognóstico dos pacientes ainda é pobre, com

sobrevida de 50 a 60% para um período de 5 anos (BAGAN e SCULLY, 2009).

2.2. CARCINOMA VERRUCOSO ORAL

O carcinoma verrucoso oral (CVO) é uma variante incomum e de baixo grau do carcinoma de células escamosas oral (CCEO) (ACKERMAN, 1948; EL-NAGGAR et al., 2017). Embora o termo carcinoma verrucoso tenha sido utilizado pela primeira vez em 1944 em uma série de caos relatados por Buford, Ackerman e Robinson, esta lesão só foi detalhadamente descrita por Ackerman em 1948, que a caracterizou como uma neoplasia verrucosa, bem diferenciada, de crescimento lento e sem tendência a metastatizar. (ACKERMAN, 1948; NEVILLE et al., 2016). É uma neoplasia maligna que cursa com características de um tumor benigno. Embora possa destruir os tecidos adjacentes, exibe um crescimento predominante horizontal, e com maior tendência para erodir do que infiltrar (KOCH et al., 2001; HOSSEINPOUR et al., 2016)

O CV acomete predominantemente pacientes do sexo masculino (ACKERMAN, 1948;

WALVEKAR et al., 2009; EL-NAGGAR et al., 2017), entretanto alguns estudos apontam uma

maior frequência no sexo feminino (McCOY; WALDRON,1981; TORNES et al., 1985;). Ocorre geralmente em pacientes acima da sexta década de vida (OLIVEIRA et al., 2006; ALONSO et al., 2017), entretanto o estudo de Walvekar et al., 2009, realizado na Índia, encontrou uma maior prevalência entre a quinta e a sexta décadas de vida.

A cavidade oral é o sítio mais acometido pelo carcinoma verrucoso. Outras áreas como a pele, laringe, seio piriforme, esôfago, cavidade nasal e seios paranasais, meato auditivo externo, ducto lacrimal, escroto, pênis, vulva, vagina, colo do útero e perineo podem ser afetadas (KRAUS; PEREZ-MESA, 1966; SPIRO, 1998; WALVEKAR et al., 2009).

Assim, ele pode receber diversas denominações dependendo da região acometida, sendo na pele denominado de CV ou carcinoma cutâneo papilomatoso, na área genital de tumor de Bushke-Loewenstein, na região plantar de epitelioma cuniculatum, e na boca como tumor de Ackerman, CV oral ou CV de Ackerman ( LÜBBE et al., 1996).

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Na cavidade oral, as regiões mais acometidas são a mucosa jugal, seguida por rebordo alveolar mandibular e gengiva (ACKERMAN, 1948; VIDYASAGAR et al., 1992;

WALVEKAR et al., 2009). A lesão também pode aparecer em língua e palato duro (TERADA,

2011; ALONSO et al., 2017). Uma associação entre lesões no palato duro e rebordo alveolar

superior mostrou um comportamento mais agressivo do carcinoma verrucoso (WALVEKAR et

al., 2009).

A etiopatogênese do CVO não está clara, no entanto, estudos demonstraram fortes associações com o uso de tabaco, com destaque para o uso de tabaco sem fumo (de mascar), além do rapé (ACKERMAN, 1948; EL-NAGGAR et al., 2017). Nos pacientes que mascam fumo ou utilizam rapé, as lesões podem aparecer nas áreas de mucosa que continuamente

entram em contato com o tabaco (EL-NAGGAR et al., 2017). A associação com o vírus do

papiloma humano (HPV) não está clara. Os estudos de Noble-Topham et al., 1993 e Shroyer et

al., 1993 sugerem uma associação entre HPV e CVO pela detecção do DNA de HPV dos tipos

6, 11, 16 e 18 por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tecidos de CVO. Entretanto, a simples evidência da infecção pelo vírus não é suficiente para determinar uma transformação maligna em cavidade oral, pois a maioria dos pacientes infectados pelo HPV não desenvolve

cânceres, sendo necessários cofatores (LÜBBE et al., 1996). Fujita et al., 2008 detectaram o

DNA de HPV em 70% dos tecidos bucais não neoplásicos de controle e 48% dos CVO, e sugerem que o desenvolvimento de CV oral pode exigir uma rápida replicação do HPV e ativação durante a hiperqueratinização do epitélio oral, bem como a inativação do supressor de tumor p53, proteína envolvida na infecção por HPV. A carcinogênese viral provavelmente dá-se pela supressão ou mutação do gene p53, que é responsável pela atividade celular supressora tumoral (LÜBBE et al., 1996).

Considera-se que a mutação genética no TP53 esteja associada à patogênese do CVO, uma vez que a proteína p53 se mostra superexpressa mediante análise imuno- histoquímica em amostras de CV, assim como ocorre em outras neoplasias malignas de cabeça e pescoço (DRACHENBERG et al., 1997; MOHTASHAM et al., 2013).

Clinicamente, o CVO apresenta-se como uma lesão espessa e exofítica, que exibe uma supefície papilar ou verrucosa. A coloração depende da quantidade de ceratina produzida. Na maioria dos casos apresentam-se como lesões brancas, podendo também ser eritematosas ou rosadas. (NEVILLE et al., 2016; EL-NAGGAR et al., 2017).

Histopatologicamente, o CVO caracteriza-se como uma neoplasia maligna que se origina do epitélio de revestimento da mucosa oral, observando-se uma marcante hiperplasia

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decorrente da proliferação de células bem diferenciadas, sem um grau significativo de atipias que, quando presentes, são discretas e observadas em região de camada basal. A superfície da lesão exibe projeções curtas e embotadas ou longas e pontudas, observando-se também, abundante produção de ceratina (geralmente paraceratina) que preenche as numerosas fendas e criptas entre estas projeções, formando tampões de ceratina. Na base da lesão nota-se cristas amplas e alongadas que parecem ´´empurrar´´ o tecido conjuntivo subjacente, no entanto a lâmina basal permanece intacta. Em muitos casos, um intenso infiltrado inflamatório crônico no tecido conjuntivo subjacente pode ser observado. Disceratose e microabcessos intraepiteliais, também podem estar presentes ao exame microscópico (NEVILLE et al., 2016; EL-NAGGAR et al., 2017). Além disso, focos de CCEO podem ser vistos em 20% dos casos de CV, tornando-se um tumor híbrido e conferindo um potencial metastático (NEVILLE et al., 2016).

A associação dos achados clínicos e histopatológicos é necessária para o diagnóstico correto, descartando outras lesões que clinicamente podem se assemenlhar ao CV, tais como hiperplasia verrucosa, CCEO, candidíase crônica e condiloma acuminado (RAJENDRAN et

al., 1989; OLIVEIRA et al., 2006; MEHROTRA et al., 2012).

O tratamento de escolha para o CV é a cirurgia, sendo tratado de forma mais conservadora. Porém tumores híbridos devem receber o mesmo tratamento que os CCEO

(WALVEKAR et al., 2009; ALONSO et al., 2017).

A radioterapia pode ser utilizada como tratamento alternativo, entretanto ela está relacionada um pior controle local, sendo menos efetiva que a cirurgia (NEVILLE et al., 2016). Alguns casos de transformação anaplásica após a realização de tratamento radioterápico foram relatados (MEDINA et al., 1984). No entanto, outros estudos não indicam que a radiação promove risco significativo de transformação anaplásica (THARP; SHIDNIA, 1995; McCAFFREY et al., 1998; MILLER et al., 2010).

A quimioterapia não é considerada um tratamento definitivo, mas pode ser empregada para reduzir temporariamente o tamanho da lesão ou nos casos de tumores inoperáveis (NEVILLE et al., 2016).

O prognóstico do CVO é bom, apresentando sobrevida de 79,9% a 88,9% dos pacientes após 5 anos (KOCH et al., 2001). As recidivas são incomuns e, quando ocorrem, podem aparecer como um carcinoma de células escamosas (MEDINA, DICHTEL; LUNA, 1984;

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A ocorrência de lesões híbridas pode ser observada. Nestes casos nota-se, além do carcinoma verrucoso, áreas de invasão que já representam um CCEO, resultando em um aumento nas chances de recidiva da lesão, pois esta adquire os fatores prognósticos do

carcinoma de células escamosas (THARP; SHIDNIA, 1995; NEVILLE et al., 2016).

2.3 CANAIS INTRACELULARES DE CLORO 4 (CLIC4)

Os canais de transporte de íons estão entre os mecanismos celulares e alvos terapêuticos mais estudados. Dentre estes, destacam-se os canais de cálcio cuja, terapia alvo desempenha importante papel no tratamento de algumas doenças cardiovasculares. Os canais de transporte de cloro desempenham importantes funções na regulação de algumas proteínas e contribuem para a homeastase celular (SUH; YUSPA, 2005; SHUKLA; YUSPA, 2010). Mutações em genes desta família estão associadas com alterações neuromusculares, ósseas, respiratórias, doenças renais e neoplasias (LI; WEINMAN, 2002; PERETTI et al., 2015). Assim, as diversas classes de canais iônicos devem ser estudadas devido à possibilidade de desenvolvimento de terapias alvo para o controle do câncer e outras doenças (SUH; YUSPA, 2005; SHUKLA;YUSPA 2010). Nesta perspectiva, estudos experimentais identificaram que o veraparil (inibidor de canal de cálcio) eleva a ação da quimioterapia no tratamento do câncer sugerindo que, neste contexto os inibidores de transporte de íons servem como agentes modificadores no tráfego da droga através das membranas (SUH, YUSPA 2005).

Os canais de cloro são classificados com base nas diferenças estruturais (SUH et al. 2012). O transporte de cloro intracelular é fundamental para regulação eletrogênica das membranas intracelulares, manutenção do pH, balanço elétrico e controle do volume das organelas (SUH et al., 2007a).

Os CLICs (canais intracelulares de cloro) são proteínas dimórficas e podem fazer transição entre as formas ligadas à membrana ou solúveis no citoplasma. Exibem tamanho que varia de 24 a 65 KDa, com domínio central principal de p64, variando entre si nos terminais carboxi e amino. O domíno transmembranar hidrofóbico que pode ser usado para se inserir na membrana e facilitar o transporte de íons cloro. Estes canais intracelulares localizam-se nas diferentes organelas e estruturas celulares, possuindo múltiplos domínios de interação proteína/proteína, sítios de fosforilação e sítios de modificação lipídica. (SUH et al., 2005; SUH, 2012; PERETTI et al., . 2015).

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A família CLIC é composta por 7 genes (CLIC1-CLIC5, P64 e parchorina) que são associados aos canais intracelulares de ânios cloro (SUH et al., 2012; PERETTI et al., 2015). Dentre as proteínas produzidas pela família CLIC, destaca-se a CLIC4 (também conhecido como mtCLIC, p64H1, RS43) que tem sido amplamente estudada na carcinogênese em pele e outros órgãos como fígado, rim e cérebro (SUH et al., 2007a; SUH et al., 2012). Assim como as outras proteínas CLIC, a CLIC4 é uma proteína dimórfica, possuindo um domínio transmembranar encontrado em membranas intracelulares, incluindo a membrana mitocondrial interna, a rede trans de Golgi e o retículo endoplasmático. A CLIC4 solúvel é abundante no citoplasma. Esta proteína também possui um sinal de localização nuclear funcional (NLS), locais de fosforilação para proteína quinase C, proteína quinase A e caseína quinase II e vários locais de ligação de proteínas. Pode também ser encontrada no citoesqueleto e em vesículas secretórias (SUH e YUSPA, 2005; SUH et al., 2007 a,b).

A CLIC4 exibe alto nível de expressão na pele (FERNANDES-SALAS et al., 2002). A localização celular de CLIC4 varia de acordo com o tipo de célula. Nos ceratinócitos esta proteína é encontrada no citoplasma e na membrana mitocondrial in terna. A CLIC4 citoplasmática é translocada para o núcleo em múltiplos tipos de células, incluindo os ceratinócitos, em condições de estresse metabólico, parada do crescimento celular, apoptose e danos ao DNA (SUH et al., 2007a,b). A resposta apoptótica à superexpressão de CLIC4 é direcionada através de uma via mitocondrial, resultando na diminuição do potencial de membrana mitocondrial, lançamento do citocromo C e ativação de caspases (SUH et al., 2005). Nos tecidos normais, a CLIC4 é muito expressa no núcleo de células epiteliais e pouco expressa nas células do tecido conjuntivo. Esta proteína quando encontrada no núcleo de células não neoplásicas pode significar uma parada do crescimento ou apoptose, dependendo do seu nível de expressão. (SUH et al 2012). A CLIC4 nuclear também é necessária para a diferenciação de ceratinócitos e adipócitos (KITAMURA, YAMAZAKI, 2001). Entretanto, em células neoplásicas esta proteína está presente no citoplasma e subregulada ou ausente no núcleo, mantendo uma relação direta entre a sua redução neste componente celular e a progressão da neoplasia (SUH et al., 2005). Observa-se também uma supra-regulação no estroma, estando associado à converção de células em miofibroblastos através de sua co-expressão com α-SMA (SUH et al., 2007c). A CLIC4 é a transcrição mais supraregulada durante a conversão de fibroblastos em miofibroblastos e a sobrexpressão desta

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proteína melhora a expressão da alfa actina do músculo liso (α-SMA), associada à transdiferenciação de fibroblastos em miofibroblastos (SHUKLA et al., 2014).

Vários sinais celulares são conhecidos por induzirem a expressão de CLIC4, incluindo TGF-β, TNF-α, p53, danos ao DNA e estresse celular (PADMAKUMAR et al., 2014). Nos queratinócitos e outros tipos de células, a expressão de transcrição CLIC4 é regulada por p53 e factor de necrose tumoral (TNFα) (SUH et al., 2005; MALIK et al., 2010). Esta proteína é regulada de forma positiva em resposta à atividade transcricional p53 e é essencial para apoptose mediada por p53 e c-Myc (SUH et al., 2005; SUH et al., 2007b).

A expressão reduzida ou ausente de CLIC4 no núcleo das células tumorais pode ser associada à perda de resposta de TGFβ e a mutações em p53. Sugere-se que a necessidade de CLIC4 durante a apoptose dependente de p53 esteja relacionada ao seu papel na responsividade ao TGF-β (SHUKLA e YUSPA, 2010). O TGFβ melhora a expressão e a associação da CLIC4 e Schnurri-2 promovendo a translocação nuclear destas proteínas. Uma vez dentro do núcleo, eles se dissociam e a CLIC4 nuclear se liga as Smads 2 e 3 fosforiladas previnindo sua desfosforilação por fosfatases Smad. Ao inibir a desfosforilação de Smad, a CLIC4 nuclear prolonga a permanencia no núcleo de p-Smad2 e 3 e aumenta a responsividade de TGFβ e consequentemente o desempenho de suas funções, incluindo a parada do crescimento e ativação transcricional. Assim, a diminuição da CLIC4 no núcleo de células tumorais poderia levar a uma redução adicional na sinalização de TGFβ por falta de inibição da desfosforilação de Smad que a presença de CLIC4 teria oferecido (SHUKLA e YUSPA, 2010).

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FIGURA 1- (A) Sinalização de TGF-β em célula normal promovendo a translocação nuclear

de CLIC4 e Schnurri-2. A CLIC4 no núcleo inibe a ligação de p-Smad2-3 a PPM1a e outras fosfatases ,e assim retarda a sua desfosforilação, prolongando o sinal de TGF-β. (B) A ausência de CLIC4 em células tumorais impediria a estabilização de P-Smad2-3, levando a desfosforilação, e consequentemente diminuindo a responsividade ao TGF-β nestas células.

Fonte: SHUKLA, YUSPA, 2010.

CLIC4 é um gene de resposta direta para a transcrição mediada por p53, sendo necessário para apoptose mediada por p53 (FERNANDEZ-SALAS et al., 2002). A p53 pode ser crucial para a parada do crescimento induzida por TGFβ e a falta de p53 ou a perda de expressão dominante de função da p53 mutante dificulta o efeito citostático de TGFβ

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prejudicando a indução da expressão de p21 mediada por TGFβ em alguns tipos de célula. Assim, uma vez que a p53 regula a expressão de CLIC4, isto pode refletir, pelo menos em parte, em várias respostas de TGFβ, devido a necessidade de CLIC4 na responsividade de TGFβ (SHUKLA e YUSPA et al., 2010). Além disso, a perda de CLIC4 poderia ajudar na tumorigênese e na progressão tumoral pela inibição da diferenciação.

O TGF-β é uma citocina que regula fatores de transcrição, proteínas do citoesqueleto, moléculas de matriz extracelular, citocinas e receptores e proteínas de transporte, incluindo a CLIC4(RONNOV-JESSEN et al., 2002). Enquanto os componentes de sinalização de TGF-β desempenham um importante papel na supressão tumoral em neoplasias malígnas de origem epitelial, em certos contextos e dependendo do estágio do câncer, o TGFβ atua aumentando a progressão do tumor, contribuindo para a criação de um rico estroma que facilitará a invasão e metástase de células tumorais. Vale ressaltar que o TGF- β está envolvido em muitos estágios do câncer, tendo sido relacionado ao aumento da síntese de proteases, indução da angiogenêse, redução da resposta imune e transição epitélio/mesenquima (YAO et al., 2009).

O estudo de Yao et al., 2009 mostrou que o TGF-β causa a regulação positiva da CLIC4 através da produção de espécies reativas de oxigênio durante a transdiferenciação de fibroblastos para miofibroblastos no estroma de câncer de ovário.

CLIC4 é o gene mais suprapregulado durante a conversão de fibroblastos em miofibroblastos mediados por TGF-β (RONNOV-JESSEN et al.,2002). Shukla et al., 2014 observaram que meios condicionados a partir de linhagens de células tumorais induzem a expressão tanto de CLIC4 como de alfa actina de músculo liso (α-sma) nos fibroblastos do estroma através da sinalização de TGF-β. Estes autores identificaram também que na ausência de CLIC4 a conversão de fibroblastos em miofibroblastos induzidos por TGF-β é bastante prejucada.

Foi obeservado que fibroblastos bloqueados para CLIC4, mesmo após a indução de TGF-β, reduziram acentuadamente a ativação de p38MAPK. Além disso, o bloqueio p38MAPK inibe substancialmente a capacidade de TGF-β para regular a expressão de α- SMA, indicando uma função importante da via p38 na expressão de α-SMA mediada por β. Assim, o TGF-β regula a conversão de miofibroblastos através da sinalização p38MAPK. (SHUKLA et al., 2014)

Nos ceratinócitos, o TGF-β provoca translocação nuclear CLIC4 em conjunto com Schnurri-2 e CLIC4 nuclear prolonga a sinalização de Smad inibindo a interação fosfo-Smad

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2/3 com a fosfatase PPM1a (SHUKLA e YUSPA, 2010). Da mesma forma, Schnurri-2 é igualmente abundante em fibroblastos, e CLIC4 inibe a interação de fosfo-Smads com PPM1a no entanto, a segmentação de CLIC4 na ativação p38 mediada por TGF-β parece ser a via dominante responsável pela regulação da conversão de fibroblastos a miofibroblas por TGF-β. Em fibroblastos dérmicos primários a p38 é responsável pela expressão de α-SMA dependente de TGF-β (SHUKLA et al., 2014)

Lima et al., 2016 observaram que a localização da CLIC 4 pode constituir um evento importante no controle celular, estando relacionada a carcinogênese labial. Os autores ressaltam que a CLIC 4 pode ter sua função alterada ou exercer influência sobre outras proteínas como p53alterada, TNF-α, TGF-β e α-SMA e que, o aumento dos miofibroblastos no tecido conjuntivo pode estar relacionado à progressão de queilites actínicas para carcinomas de células escamosas de lábio inferior.

Orimo et al., 2005 relataram que, em tumores de mama, a secreção de fator 1 por miofibroblastos do estroma recruta células endoteliais e estimula o crescimento tumoral. A CLIC 4 sofre influência deste mesmo fator que se co-localiza junto a α-SMA tanto no tecido normal quanto no neopálasico, auxiliando na angiogênese.

Considerando o alto nível de expressão de CLIC4 em miofibroblastos no estroma de muitos tipos de cânceres epiteliais e a redução acentuada dos marcadores de miofibroblatoss na ausência de CLIC4, o desenvolvimento de uma terapia alvo para CLIC4 poderia ser empregada como abordagem específica para inibir a progressão do tumor (SHUKLA et al., 2014). Embora, essa possibilidade seja especulativa, as pesquisas apontam um papel importante da CLIC4 no desenvolvimento do câncer.

2.4. FIBROBLASTOS ASSOCIADOS AO CÂNCER

Os fibroblastos são o principal tipo de célula do estroma tumoral. A presença de um subtipo específico de fibroblasto, denominado miofibroblasto, é frequente no estroma de carcinomas, e muitos estudos sugerem que estas células estão envolvidas no processo de iniciação e progressão de diversos tumores, incluindo o CCEO (OTRANTO et al., 2012).

Os fibroblastos associados ao câncer (FAC), fibroblastos reativos ou miofibroblastos (denominação geralmente empregada quando as células não estão associadas ao câncer) são

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células mesenquimais altamente especializadas que adiquirem a capacidade de expressar alfa actina de músculo liso (α SMA) e de sintetizar altos níveis de proteínas da matriz extracelular (MEC), proteases e fatores de crescimento, como o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e o fator de crescimento de ceratinócitos (KGF) (HINZ e GABBIANI, 2003; ORIMO e WEINBERG, 2006; KELLERMANN et al., 2008).

Os miofibroblastos são células que exibem um fenótipo híbrido entre fibroblastos e células do músculo liso (BADID et al., 2000; KELLERMANN et al., 2008). Estas células estão presentes em pequenas quantidades na maioria dos órgãos, em especial naqueles locais cuja força mecânica é necessária (EYDEN, 2008).

Morfologicamente são caracterizadas como células alongadas, fusiformes ou estreladas, com núcleo regular e central, pequenos nucléolos, citoplasma rico em filamentos de actina, com retículo endoplasmático rugoso e complexo de Golgi bem desenvolvidos devido a intensa síntese e secreção de citocinas, mediadores inflamatórios, fatores de crescimento, hormônios, componente da matriz extracelular, como o colágeno, proteínas de adesão e proteases (MICKE e OSTMAN, 2004; EYDEN, 2008). Ultraestruturalmente estas células são caracterizadas pela presença de um aparato contrátil organizado sob a forma de feixes periféricos de miofilamentos de actina conectados aos complexos de adesão localizados na superfície da célula denominados fibronexos, um complexo transmembrânico formado por actina, integrina e fibronectina, que estabelecem contato entre a célula e a matriz extra-celular (MEC) (POWELL, 2005; EYDEN, 2008). Os miofilamentos ligam-se às integrinas, as quais se conectam à fibronectina existente na MEC formando um sistema mecanotransdutor capaz de transmitir a força contrátil gerada pelas fibras de estresse à MEC (GABBIANI et al., 2003). Os miofibroblastos podem também se conectar uns aos outros e a outras células através de aderências e junções gap (MICKE e OSTMAN, 2004).

Inicialmente acreditava-se que os miofibroblastos originavam-se apenas de populações celulares residentes nos tecidos, com ênfase para os fibroblastos. Entretanto, dependendo do tecido e de outras características do microambiente diversos tipos celulares podem sofrer trandiferenciação para miofibroblastos, como células endoteliais (HINZ et al., 2007), células musculares lisas, pericitos (SCHURCH et al., 2007; HINZ, 2010), células estreladas do pâncreas e do fígado (HINZ et al., 2007) e adipócitos (DE WEVER et al., 2008). Outros potenciais precursores incluem as células-tronco mesenquimais residentes nos tecidos, os

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fibrócitos derivados da medula óssea e a transição epitélio-mesenquimal (HINZ et al., 2007; EYDEN, 2008; EYDEN et al., 2009).

O processo de diferenciação de células precursoras em miofibroblastos é dividido em duas fases. Inicialmente, a célula adquire feixes contráteis que garantem força necessária para promover sua migração e remodelação da MEC. Estas células são chamadas de´´proto- miofibroblastos`` e possuem menor capacidade contrátil. Estes proto-miofibroblastos na presença de estresse mecânico ou fatores de crescimento, principalmente o TGF-β, diferenciam-se em miofibroblastos através da inclusão de α-SMA. O TGF-β induz os fibroblastos a sintetizarem a fibronectina, a qual estimula a síntese de α-SMA que, por sua vez, é incorporada às fibras de estresse conferindo a atividade altamente contrátil dos miofibroblastos (HINTZ et al, 2001a; HINZ et al, 2001b; EYDEN, 2008).

A origem dos miofibroblastos através do processo de transdiferenciação de fibroblastos pré-existentes é o mais aceito na literatura (GABBIANI et al., 2001). Entretanto, estudos sugerem que os miofibroblastos estromais são muitas vezes originados de células epiteliais que sofreram TEM, tendo sido relatado a possível ocorrência de TEM concomitantemente ao aumento da expressão de marcadores de FACs em carcinomas (KALLURI; ZEISBERG 2006; TRUJILLO et al., 2011; JENSEN et al, 2015).

A α-SMA é descrito como o marcador mais importante para identificar miofibroblastos diferenciados, embora esta proteína citoplasmática também seja encontadas em outros tipos celulares como as células musculares lisas e as células mioepiteliais (CHEN et al., 2007; KELLERMMAN et al., 2008). O papel mecânico desta proteína é reconhecido como sendo sua principal função, estando relacionada à contratilidade celular. Além disso, a α-SMA também exerce múltiplas funções no componente celular como: ligar o citoesqueleto a diferentes proteínas transmembranares em uma variedade de junções, regular a atividade de alguns receptores, servindo também como um conector do citoesqueleto a diversas cascatas de sinalização (SJOBLOM, SALMAZO, DJINOVI´C-CARUGO et al., 2008). Assim, esta proteína além de atuar nos processos de contratilidade e mobilidade, também está envolvida na divisão, adesão e manutenção da morfologia celular (CHAPONNIER; GABBIANI, 2004). Com relação a função mecânica, sabe-se que a força celular de tração é exercida pelos miofibroblastos atuando essencialmente na remodelação tecidual (CHEN et al., 2007).

Geralmente, os miofibroblastos são negativos para antígenos presentes em células musculares lisas, como as cadeias pesadas de miosina de músculo liso, desmina e caldesmon

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(SCHURCH et al., 2007; EYDEN, 2008). Entretanto, dependendo da origem, localização e condição patológica os miofibroblastos podem expressar outros marcadores como laminina, desmina, calponina, caldesmon, miosina de músculo liso e proteína de ativação dos fibroblastos, revelando que o padrão de expressão destas proteínas nestes tipos celulares pode variar (MICKE e OSTMAN, 2004). Estas células são normalmente negativas para citoqueratinas, CD68, CD31 e CD34 (DE WEVER et al., 2008; SALGUEIREDO- GIUDICE.et al., 2011)

Os miofibroblastos foram identificados no estroma de diversos tumores sólidos malignos como carcinomas orais, carcinomas de mama, carcinomas hepatocelulares e melanomas (DE WEVER et al 2008; DE-ASSIS et al., 2012) Estudos revelaram que a presença de miofibroblastos no estroma tumoral está associado a um pior prognóstico em alguns cânceres (KELLERMANN et al., 2007; SOBRAL et al., 2011; DE-ASSIS et al., 2012). Supõe-se que isto ocorra devido a capacidade destas células em sintetizar produtos que modulam inúmeros eventos biológicos como crescimento, diferenciação, adesão, migração e invasão de células neoplásicas (DE WEVER et al 2008)

Os fibroblastos associados ao câncer (FACs) são um grupo especializado de células que partilham uma morfologia semelhante aos miofibroblastos presentes nos processos de cicatrização de feridas, sendo frequentemente encontrados no estroma de cânceres, principalmente em região de front de invasão (KALLURI e ZEISBERG, 2006; KELLERMANN et al., 2008). Assim como os miofibroblastos de fibroses, os FAC também expressam α-SMA e não entram em apoptose, permanecendo no estroma tumoral e causando desmoplasia devido à deposição excessiva de MEC (PIETRAS; ÖSTMAN, 2010).

Os FAC têm sido caracterizados morfologicamente como células grandes e largas, diferente dos fibrócitos, que geralmente são finos, ondulados e pequenos (KALLURI e ZEISBERG., 2006; SUNG et al., 2011; LIU et al., 2011). Porém, um estudo realizado em carcinomas de células escamosas esofágico mostrou que os FAC estromais se apresentavam histologicamente diferentes, alguns se assemelhando a fibrócitos normais, e outros com morfologia distinta de FACs. Quando as células se mostravam finas e onduladas eram classificadas com o fenótipo de FAC maduro. Quando amostravam morfologia de células fusiformes largas, arredondadas eram classificadas como fenótipo FAC imaturo. Os autores observaram que o subtipo histológico imaturo foi associado a uma diminuição da sobrevida global, demonstrando que, para estes tumores a classificação histológica do fenótipo FAC é clinicamente relevante podendo representar um marcador de prognóstico (HA et al., 2014).

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No entanto, no trabalho realizado por Dourado et al., 2016 em CCEO, a correlação dos subtipos histológicos de FAC com os achados clinicopatológicos não apresentou resultados estatisticamente significantes.

Os FACs diferem dos fibroblastos normais pela superexpressão anormal de SMA, aumento da expressão de proteínas da MEC e de enzimas proteolíticas (EGEBLAD et al., 2005).

Um único marcador para FAC ainda não foi identificado. Isto, em parte, é devido à heterogeneidade destas células, sendo possivelmente reflexo de sua célula de origem, do tecido

em que eles se desenvolvem e do seu estado de ativação. Sabe-se que, fibroblastos de diferentes

locais anatômicos têm perfil de expressão consideravelmente diferente podendo mostrar vários graus de expressão de α-SMA (CHANG. et al., 2002; HA et al., 2014)

Alguns critérios foram sugeridos para caracterização de FAC, como a positividade para α- SMA, enzima de maturação do colágeno tipo I prolil-4-hidroxilase, vimentina e a negatividade para citoqueratinas (DE WEVER et al., 2008). Outros marcadores citados são a proteína específica de fibroblastos-1 (FSP-1), o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e o seu receptor (PDGFR) (KALLURI; ZEISBERG, 2006; HA et al., 2014).

A expressão isolada de α-SMA para a caracterização de FAC em CCEO foi significativente associada a tumores mais agressivos e maior mortalidade, sugerindo que este marcador possa ser utilizado de forma independente para caracterização de FAC em CCEO (VERED et al., 2010b; BELLO et al., 2011). Entretanto, Mao et al., 2013 sugerem que marcadores adicionais são necessários para uma boa especifidade devido à grande heterogeneidade de fenótipos destas células.

O trabalho de Pinto et al., 2015, comparou o secretoma de fibroblastos orais normais e FACs por meio de proteômica baseada em espectrometria de massas e análise de redes biológicas, e revelou que proteínas superexpressas pelos FACs estão envolvidas na organização e remodelação da MEC e no metabolismo do colágeno. As proteínas mais expressas pelos FACs foram FNDC1 (fibronectin type III domain containing 1), SERPINE1(serpin peptidase

inhibitor, clade E, member 1) e STC2 (stanniocalcin 2). O estudo também observou, através de

análise imunoistoquímica, que a expressão de PINP (pró- peptídeo N-terminal do colágeno tipo I) é significativamente correlacionada com a presença de FACs no front tumoral e a uma menor taxa de sobrevida em pacientes com CCEO.

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Devido à capacidade dos miofibroblastos de síntizar e secretar diversos fatores como, TGF-β, HGF, PDGF, GM-CSF, KGF, pesquisas sugerem que estas células têm uma participação importante no estímulo à proliferação de células tumorais (DESMOULIÈRE et al., 2004; BHOWMICK et al, 2004; BAGLOLE et al., 2006). Além disso, sabe-se que as células neoplásicas de CCEO são capazes de induzir a diferenciação de fibroblastos primários em miofibroblastos através da secreção de TGF-β (LEWIS et al., 2004). O TGF-β exerce importante função no desenvolvimento tumoral devido o seu papel na indução da proliferação celular e ativação de miofibroblastos, na produção excessiva de matriz extracelular e na indução da TEM devido ao rompimento das junções intercelulares (IKUSHIMA; MIYAZONO, 2010)

O estudo realizado por Kellermann et al 2008, revelou que as células do CCE oral atuam no processo de diferenciação dos fibroblastos orais primários normais em miofibroblastos através da secreção de TGF-β e que, as linhagens celulares de CCE oral tratadas em meio condicionado com miofibroblastos tiveram um aumento nos índices de proliferação das células neoplásicas. Para os autores, os resultados obtidos revelam a existência de efeitos parácrinos entre células neoplásicas e fibroblastos orais normais, caracterizados pela indução da diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos e pela modulação da proliferação das células tumorais.

Pesquisas confirmam o importante papel indutor do parênquima tumoral no surgimento dos FACs no estroma de CCEO (ETEMAD-MOGHADAM et al.,2009; DE_ASSIS et al., 2012). O estudo de Vered et al., 2007, com carcinogênese experimental na mucosa oral de ratos, revelou que em áreas de epitélio normal, hiperceratótico e displásico, os miofibroblastos eram escassos ou ausentes no tecido conjuntivo subjacente. Entretanto, nas regiões de carcinoma superficial ou invasivo, foi visto um aumento significativo no número de miofibroblastos, por vezes em proximidade com as células tumorais. Além disso, outros trabalhos utilizando imunoistoquímica, não detectaram miofibroblastos em mucosa oral normal ou em displasias, independente do seu grau histológico, sendo observada a presença de FAC apenas no estroma tumoral, principalmente na região de front de invasão (KELLERMANN et al., 2007; DE_ASSIS et al., 2012)

Estudos revelam o papel dos FAC na indução da TEM em células tumorais (DING et al., 2014; JENSEN et al., 2015). O trabalho de Vered et al., 2010a, constatou uma diminuição da expressão de marcadores epiteliais, como a E-caderina, entre as células tumorais de CCEO

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que estão em contato direto com os miofibroblastos do estroma, sustentando a hipótese de que os FAC representam células malignas epiteliais que sofreram o processo de TEM.

Sugere-se que a presença de FACs no estroma cria um ambiente permissivo para o processo de invasão tumoral e metástase (DE ASSIS et al., 2012). Wheeler et al.,2014 em seu estudo com modelo animal murino, observaram que a injeção heterotópica de células de CCE de cabeça e pescoço com fibroblastos normais ou FACs, revelou que as células de CCE com FACs tiveram um maior crescimento do tumor primário, de metástases linfonodais e à distância, quando comparadas à injeção com fibroblastos normais.

Pesquisas clínicopatológicas revelam que níveis elevados de FAC no estroma de CCEO, principalmente no front de invasão têm correlação significativa com parâmetros clínicos como um maior tamanho do tumor, recidiva regional, presença de metástase cervical oculta e à distancia (KELLERMANN et al., 2008; MARSH et al.,2011; LI et al., 2015). O estudo de Kellermann et al., 2007 avaliou através de análise imuno-histoquímica a presença de miofibroblastos em CCE de língua, displasias epiteliais e mucosa oral normal, e constatou que os miofibroblastos estão presensentes apenas no estroma dos carcinomas, particularmente no front de invasão tumoral. Além disso, foi observado que nos pacientes cujos tumores possuíam uma abundante quantidade de miofibroblastos no front de invasão tumoral as taxas de sobrevida geral eram menores. Os autores propõem que análise da quantidade de miofibroblastos nos CCEs de língua poderia ser útil na determinação do prognóstico. Corroborando com estes achados, Li et al., 2015 apontam os FACs como fator prognóstico para pacientes com CCEO.

Os FAC podem propiciar a migração das células tumorais provavelmente devido a secreção de proteases capazes de degradar componentes da MEC, como as MMPs-2, -3 e -9 (DE-WEVER et al., 2008). Sobral et al., 2011 constataram, em estudo in vitro com ensaio de invasão em matrigel, que os FACs foram capazes de aumentar a síntese de metaloproteinases nas células tumorais, particularmente as MMPs-1, -2, -9 e -13 e de induzir a invasão das células de CCEO através do matrigel. Além disso, outros estudos sugeriram que a secreção de quimiocinas (DALY; MCILREAVEY; IRWIN, 2008) e lamininas (FRANZ et al., 2010) também são capazes de estimular o processo de invasão tumoral.

As citocinas secretadas por estas células promovem a infiltração de células imunes e consequente indução da angiogênese, colaborando na disseminação metastática das células tumorais (GERBER et al., 2009). Entretanto, a indução à angiogênese parece não ser