Análise da interação do complexo LaGT1 com o DNA telomérico

Como foi descrito anteriormente (item 5.1), três complexos DNA-proteína que interagem com a fita telomérica rica em G foram identificados nas frações da coluna de DEAE-agarose originadas dos extratos protéicos S100 e nuclear de promastigotas de L. (L.) amazonensis utilizando-se ensaios de EMSA. LaGT1 foi identificado como o complexo de maior mobilidade eletroforética, o mais abundante nos dois extratos protéicos e o complexo que se associa mais especificamente com a fita telomérica rica em G [Fernández e col., item 5.1]. A purificação dos extratos S100e nuclear em coluna de troca iônica DEAE-agarose, mostrou que LaGT1 foi obtido em todas as frações das colunas eluídas com concentrações de 75-800 mM de NaOAc.

Para analisar a interação do complexo LaGT1 com o DNA telomérico de L. (L.) amazonensis foram realizados testes de interação (reações in vitro de interação proteína-DNA por EMSA) utilizando-se a fração de 400 mM de NaOAc da coluna de DEAE-agarose do extrato S100 e diferentes oligonucleotídeos contendo a seqüência telomérica rica em G de L. (L.) amazonensis. Para estes ensaios foram utilizados oligonucleotídeos contendo permutações da seqüência telomérica no terminal 3' (oligonucleotídeos Tel1-Tel6, Tabela 1 do item 5.1) e oligonucleotídeos com 5 e 6 repetições da seqüência telomérica (oligonucleotídeos Tel30 e Tel36, item 4.4.4), marcados radioativamente no terminal 5' com a enzima polinucleotídeo quinase do bacteriófago T4. Os produtos dessas reações foram submetidos a EMSA e a "UV cross-linking" como mostrado nasFiguras 25A e 25B. Os resultados mostram que o complexo LaGT1 é formado com todos os oligonucleotídeos de seqüência telomérica Tel1 a Tel6 (Figuras 25A e 25B, linhas 2-7). Esse complexo também é formado com os oligonucleotídeos das seqüências teloméricas de 30 nt (Tel30) e 36 nt (Tel36) (Figuras 25A e 25B, linhas 9 e 11, respectivamente). Utilizando-se ensaio de "UV cross-linking" seguido de fracionamento por SDS-PAGE mostra-se que LaGT1 é formado ao menos por duas bandas de tamanho aproximado de 18-20 kDa (Figura 25B, linhas 2-7).

Figura 25. O complexo LaGT1 é formado com oligonucleotídeos de seqüências teloméricas ricas em G permutadas na extremidade 3' (Tel1-Tel6) assim como com Tel30 e Tel36. A) EMSA e B) Ensaio

de "UV cross-linking" utilizando-se a fração de 400 mM NaOAc da coluna de DEAE-agarose originada do extrato S100 e os oligonucleotídeos Tel1 (linhas 2), Tel2 (linhas 3) , Tel3 (linhas 4), Tel4 (linhas 5), Tel5 (linhas 6), Tel6 (linhas 7), Tel30 (linhas 9) e Tel36 (linhas 11) marcados radioativamente no terminal 5'. Reações sem extrato protéico (linhas 1, 8 e 10). Os produtos foram fracionados em: A) em gel não desnaturante 6% em 0,5X TBE e em B) em gel de SDS-PAGE 12% usando-se tampão de amostra para proteínas contendo 2-mercaptoetanol.

5.2.3.2. Estimativa das constantes de dissociação (Kd) dos complexos LaGT1-LaGT3 com

seqüências teloméricas ricas em G

Como parte da caracterização dos complexos proteína-DNA telomérico LaGT1-LaGT3 de L. (L.) amazonensis foram analisadas outras propriedades de interação com seqüências simples fitas teloméricas (na forma de DNA para LaGT1 e de DNA e RNA para LaGT2 e LaGT3), estimando-se as constantes de dissociação (Kd) dos três complexos.

A Kd do complexo LaGT1 foi estimada utilizando-se 9 fmol do oligonucleotídeo de seqüência telomérica simples fita na forma de DNA Tel6 (Tabela 1 do item 5.1) e diluições seriadas em duplicata das frações obtidas por cromatografia de troca iônica dos extratos S100 (400 mM de NaOAc) e nuclear (500 mM de NaOAc) (item 5.1). Dados das análises quantitativas desses ensaios por Scion Image para Windows (www.scioncorp.com), foram plotados em gráficos de regressão não linear a fim de se obter os valores de Kd usando o programa GraphPad Prism (versão 4.0, 2003; www.graphpad.com). As curvas resultantes estão mostradas na Figura 25. A Kd estimada para o complexo LaGT1/Tel6 formado a partir de proteínas do extrato S100 e do extrato nuclear foi de 12,80 nM.

As Kd dos complexos LaGT2 e LaGT3 foram estimadascomo para LaGT1, utilizando-se os oligonucleotídeos de seqüênciasteloméricas simples fita nas formas de DNA (Tel6) e RNA (Tel6RNA) (tabela 1 do item 5.1). Para esses ensaios foram utilizadas diluições seriadas em duplicata das frações obtidas por cromatografia de afinidade do extrato S100 (item 5.1), que apresentavam atividade de LaGT2 (0,6 M de KCl) e LaGT3 (2,2 M de KCl) e 5 fmol dos oligonucleotídeos acima mencionados. Os valores das Kd foram obtidas plotando-se dados das análises quantitativas dos ensaios em gráficos de regressão não linear usando o programa GraphPad Prism (versão 4.0, 2003; www.graphpad.com). As curvas resultantes estão mostradas nas Figuras 27A e 27B. Os valores das Kd estimadas para cada complexo foram: LaGT2/Tel6, 16,62 nM; LaGT2/Tel6RNA, 1,50 nM; LaGT3/Tel6, 9,02 nM e LaGT3/Tel6RNA, 2,06 nM.

Figura 26. Estimativa da constante de dissociação (Kd) do complexo LaGT1 formado com proteínas

de extrato S100 e de extrato nuclear de L. (L.) amazonensis e o oligonucleotídeo de seqüência telomérica simples fita na forma de DNA (Tel6). A Kd foi estimada por EMSA utilizando-se 9 fmol do

oligonucleotídeo Tel6 marcado radioativamente e diluições seriadas em duplicata das frações obtidas por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-agarose: frações de 400 mM NaOAc do extrato S100 e de 500 mM NaOAc do extrato nuclear, que contêm atividade de LaGT1. Após as análises quantitativas dos resultados usando o programa Scion Image para Windows, os valores de Kd foram estimados por

regressão não linear usando o programa GraphPad Prism. O valor da Kd estimada para o complexo

Figura 27. Estimativa das constantes de dissociação (Kd) dos complexos LaGT2 e LaGT3 com

oligonucleotídeos de seqüências teloméricas simples fita nas formas de DNA (Tel6) e RNA (Tel6RNA). Em A) e B) as Kd foram estimadas a partir da análise quantitativa de EMSA utilizando-se 5

fmol dos oligonucleotídeos marcados radioativamente: Tel6 (esquerda) ou Tel6RNA (direita) e diluições duplicadas seriadas das frações obtidas por cromatografia de afinidade que apresentavam atividade de LaGT2 e LaGT3, respectivamente 0,6 M KCl e 2,2 M KCl. Após as análises quantitativas dos resultados usando o programa Scion Image para Windows, os valores das Kd foram estimados por regressão não

linear usando o programa GraphPad Prism. A) Estimativa das Kd dos complexos LaGT2/Tel6 (16,62 nM)

e LaGT2/Tel6RNA (1,50 nM). B) Estimativa das Kd dos complexos LaGT3/Tel6 (9,02 nM) e

5.2.3.3. Ensaio de renaturação das proteínas que fazem parte dos complexos LaGT2 e