TTAGGG Blocos de homologia
1.6. CROMATINA TELOMÉRICA: PAPEL NA REGULAÇÃO DO TAMANHO DOS TELÔMEROS E DA ATIVIDADE DA TELOMERASE
1.6.1. Composição da cromatina telomérica de eucariotos
A cromatina telomérica de eucariotos está constituída por proteínas que se associam especificamente aos telômeros, as quais também estão envolvidas na manutenção da arquitetura nuclear, na ativação e repressão de genes adjacentes aos telômeros e na localização dos cromossomos dentro do núcleo [128]. Essas proteínas se classificam de acordo com a sua afinidade pelo DNA telomérico em proteínas que se associam à dupla fita e proteínas que se associam à simples fita rica em G [46]. Dentro do primeiro grupo estão Rap1 em S. cerevisiae [129, 130], Trf1 e Trf2 em mamíferos [131, 132] e Taz1 em Schizosaccharomyces pombe [133, 134] que geralmente atuam como reguladores negativos da telomerase [122]. No segundo grupo encontram-se Tebp α/β de Oxytricha nova [135], Pot1 em S. pombe e humanos [136], Cdc13 [137, 138] e Rpa-1 em leveduras [139] que ao contrário, funcionam na sua maioria como reguladores positivos da manutenção dos telômeros [122]. Componentes da maquinaria de reparo do DNA (por exemplo, o complexo Mre11) e da via de junção terminal não homóloga (por exemplo, Ku70/80) além de fatores de silenciamento de genes (por exemplo, complexo Rap1/Sir2), também são encontrados associados aos telômeros, atuando como reguladores positivos da manutenção dessas seqüências [43, 44, 140]. Essas proteínas todas, juntamente com a telomerase formam uma estrutura de ordem maior que protege os terminais dos cromossomos [43].
Existem evidências de conservação das proteínas teloméricas entre organismos eucariotos distantes. Embora as proteínas Pot tenham sido originalmente identificadas com base na similaridade de seqüência com a região N-terminal da subunidade α da proteína Tebp de O. nova [136], não existe similaridade aparente entre essas proteínas e Cdc13. Estas três proteínas pertencem a uma superfamília que contém motivos do tipo "OB fold" [141, 142] (Figura 12). O "OB fold" é um motivo estrutural pequeno utilizado para a ligação de oligonucleotídeos/oligossacarídeos e oligopeptídeos [143] formado por 5 fitas β que formam 2 pacotes ortogonais antiparalelos de folhas β [144]. Os primeiros "OB fold" citados na literatura foram: subunidade β da verotoxina 1 de Escherichia coli, nuclease de estafilococo e o domínio
de ligação do anticódon de aspartil-tRNA sintetase [143]. Subseqüentemente estes foram identificados em muitas outras proteínas, incluindo a subunidade 1 da proteína de replicação A ("Replication Protein A": Rpa-1) [145].
Figura 12. Comparação estrutural do motivo de ligação ao DNA ("DNA binding domain": DBD)
da proteína Cdc13 com o motivo do tipo “OB fold” do domínio NH2-terminal da proteína α-Tebp
de O. nova. (A) Imagem dos dois motivos do tipo “OB fold”. O DBD de Cdc13 (resíduos 10-148) é
mostrado em verde, e o motivo do tipo “OB fold” da proteína α-Tebp de O. nova (resíduos 37-150) é mostrado em amarelo. (B) Comparação das interfaces de ligação ao DNA dos dois motivos do tipo “OB fold”. As cores são apresentadas como descrito em A, com resíduos de contato do DBD de Cdc13 (esquerda) em vermelho e os resíduos de contato do motivo do tipo “OB fold” do domínio NH2-terminal da proteína α-Tebp de O. nova (direito) em verde. Esta figura foi girada 40° a partir de A para ilustrar a diferença de tamanho entre as duas interfaces.
Ilustração retirada de: [146].
A proteína α-Tebp de O. novarelacionada com as proteínas Pot contém quatro motivos do tipo "OB fold", três dos quais participam integralmente na associação ao DNA. Em Cdc13 o motivo de ligação ao DNA ("DNA binding domain": DBD) exibe um alto grau de similaridade estrutural com os motivos "OB fold". Os alinhamentos das seqüências revelam que não existe similaridade apreciável entre o DBD de Cdc13 e os motivos do tipo "OB fold" de O. nova. Esta relação estrutural sugere que embora existam divergências na seqüência primária de aminoácidos, Cdc13 compartilha um ancestral comum com a proteína α-Tebp de O. nova e com as proteínas Pot. A similaridade estrutural entre o DBD de Cdc13 e outras proteínas envolvidas
na proteção dos telômeros demonstra que os motivos do tipo "OB fold" são elementos estruturais conservados para a ligação das proteínas ao terminal simples fita telomérico [146].
A Rpa, outra proteína que contém domínio "OB fold" e tem função telomérica em leveduras [139], foi originalmente purificada a partir de extratos de células como um componente essencial para a replicação in vitro do DNA do vírus de primatas (SV40). Ela se liga com alto grau de afinidade à simples fita de DNA e com muito menor afinidade a dupla fita de DNA e a de RNA. Esta proteína também está envolvida em processos importantes da célula como replicação, recombinação, regulação da transcrição através da associação a seqüências reguladoras específicas, "checkpoint" e reparo de DNA. Também pode estar envolvida na interação proteína-proteína e na fosforilação regulada pelo ciclo celular [147]. A Rpa constitui um complexo protéico estável que tanto em humanos, leveduras e kinetoplastida está formado por três subunidades (70, 32 e 14 kDa) [147-149]. Outras proteínas homólogas que ligam DNA na forma de simples fita têm sido identificadas em outros organismos eucariotos, indicando que a Rpa é um membro de uma família de proteínas que se associam ao DNA na forma desimples fita [147, 149].
O papel telomérico da Rpa está bem exemplificado em S. cerevisiae. Mutantes duplos POL12/RPA-1 mostraram redução do tamanho dos telômeros e diminuição da viabilidade celular [150]. Além disso, a interação da proteína Cdc13 de leveduras com a subunidade catalítica da DNA polimerase α e Rpa interfere directamente no metabolismo telomérico [151]. Foi demonstrado recentemente por Schramke e col. [139], que em leveduras a Rpa está presente nos telômeros e que a perda da região N-terminal da Rfa-2 (subunidade 2 da Rpa) reduz consideravelmente o tamanho da seqüência telomérica, demonstrando que ela é necessária para a manutenção do tamanho dos telômeros. Estes autores também mostraram que a Rpa atua em uma via que envolve a telomerase (Est2) e Tel1 (regulador positivo da telomerase), regulando a ação enzimática durante a fase S do ciclo celular por facilitar a ligação da proteína Est1 ao telômero (Figura 13). Em humanos, a Rpa-1 também se associa com as helicases das síndromes de Werner e Bloom, e vai proteger longas regiões de DNA que foram desenroladas e que estavam previamente associadas à proteína telomérica Trf2 [152].