4 MATERIAL E MÉTODO
4.6 Análise da liberação de metaloproteinases da matriz
A produção de metaloproteinases da matriz (MMP-3 e MMP-8) foi avaliada por ensaios imunoenzimáticos (ELISA) utilizando os Kits DuoSet® ELISA Development System (R&D Systems, Minneapolis, USA) (Figura 10). Assim, microplacas de 96 poços (Nunc) foram previamente sensibilizadas com anticorpos de captura anti-MMP-3 ou anti-MMP-8 (R&D Systems). As placas foram mantidas overnight, em temperatura ambiente e depois foi feita lavagem abundante com PBS contendo Tween 20. (Figura 11). Após a lavagem, foi feito bloqueio (Figura 11) com a adição de Reagente Diluente (PBS contendo 1% de Soro Bovino Albumina–BSA) e a placa foi mantida em temperatura ambiente por 1 h. Após uma nova lavagem, amostras dos sobrenadantes de cada poço da cultura de células e os controles da reação (curva- padrão) foram adicionados e as placas mantidas por 2 h em temperatura ambiente (Figura 12). Os testes foram realizados em duplicata para cada amostra. Após lavagem abundante com PBS contendo Tween 20 foi acrescentado anticorpo de detecção anti-MMP-3 ou anti-MMP-8 marcado com biotina (Figura 12). Após 2 h de incubação, as placas foram novamente lavadas e foi adicionada estreptoavidina conjugada com peroxidase (R&D Systems) e foram mantidas por 20 minutos ao abrigo da luz. Repetiu-se a lavagem abundante com PBS contendo Tween 20 e a reação foi revelada (Figura 13) com solução de substrato cromogênico que contem Reagente A (peróxido de hidrogênio) e Reagente B (tetrametilbenzidina) (R&D Systems) (Figura 10). A reação foi bloqueada após os 20 minutos com ácido sulfúrico 2 N (Figura 14). As densidades ópticas (DO) foram lidas no leitor de microplacas (Biotek) (Figura 15) com comprimento de onda de 450 nm e os níveis de MMP-3 e MMP-8 presentes nos sobrenadantes das culturas foram determinados. Os
39
resultados foram analisados estatisticamente, pela análise de variância ANOVA, com nível de significância de 5%, e pelo teste de Tukey.
A B
Figura 10 - Kit e Reagentes utilizados para quantificação de MMP. a) Kit DuoSet® ELISA Development System (R&D Systems, Minneapolis, USA; b) Reagente A e Reagente B (R&D Systems, Minneapolis, USA).
A B
Figura 11 - Procedimentos realizados no ensaio imunoenzimático a) lavagem da placa com PBS contendo Tween 20; b) adição de Reagente Diluente (Bloqueio).
A B
Figura 12 - Procedimentos realizados no ensaio imunoenzimático. a) adição das amostras e dos controles; b) adição de anticorpo de detecção anti-MMP-3.
A B
Figura 13 – Revelação da reação: a) adição da solução de substrato cromogênico que reage com a peroxidase; b) resultado da reação após 20 minutos.
Figura 14 - Procedimento realizado no ensaio imunoenzimático: bloqueio da reação anterior com ácido sulfúrico 2 N.
Figura15 - Leitor de microplacas (Biotek) utilizado para realizar as leituras das densidades ópticas (DO).
5. RESULTADOS
5.1 Produção de MMP-3
Os valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxinas de E. coli nas concentrações 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL, em diferentes períodos de tempo (24, 48 e 72 h), estão apresentados nas Tabelas 1 a 4, respectivamente.
Tabela 1 – Valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação por endotoxina de E. coli (controle), nos diferentes períodos de tempo Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 63,28 391,92 712,83 2 113,12 239,90 814,36 3 58,36 245,05 711,34 4 77,48 192,09 622,25 5 155,72 189,00 385,58 6 106,36 124,27 895,61 7 328,50 677,14 617,28 8 369,67 797,30 2105,77 9 158,58 291,93 327,18 10 118,75 273,87 339,11
Tabela 2 – Valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 5 EU/mL, nos diferentes períodos de tempo
Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 913,33 1623,23 2629,09 2 879,72 2312,72 2589,09 3 1050,20 1157,65 2008,72 4 759,70 1503,54 2105,00 5 892,18 2521,21 1991,66 6 869,59 1988,33 2045,01 7 1095,62 2532,12 2268,33 8 1322,45 2185,46 2100,03 9 1191,53 2238,77 2126,39 10 1286,06 2119,75 2125,59
* grupo ativado com 5 EU/mL de endotoxina.
Tabela 3 – Valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 10 EU/mL nos diferentes períodos de tempo
Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 2111,71 2151,88 2240,23 2 2160,29 2407,64 2343,36 3 2208,83 2127,78 2248,26 4 2036,61 2309,19 2657,44 5 2200,07 2144,57 2303,76 6 2095,19 2323,09 2503,51 7 2154,07 2126,32 2205,18 8 2452,40 2510,98 2588,54 9 2147,27 2327,90 2406,83 10 2100,89 2363,71 2576,07
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Tabela 4 – Valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 20 EU/mL nos diferentes períodos de tempo
Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 2092,73 2119,75 2174,51 2 2422,19 2514,55 2542,49 3 2515,32 2577,41 2589,83 4 2392,70 2474,19 2402,79 5 2396,58 2447,03 2561,11 6 1491,69 1527,82 1528,86 7 1621,40 1538,76 1624,82 8 1505,68 1555,76 1564,79 9 1449,82 1484,56 1482,80 10 1607,69 1516,43 1617,01
* grupo ativado com 20 EU/mL de endotoxina.
Após análise estatística, em relação ao tempo, pode-se verificar que houve aumento significativo da produção de MMP-3 (24, 48 e 72 h), exceto no grupo ativado com endotoxina na concentração 20 EU/mL. Assim, no grupo controle houve aumento significativo da produção de MMP-3 do tempo 24 ou 48 h para 72 h (p<0,05). No grupo ativado com 5 EU/mL de endotoxinas, houve aumento significativo na produção de MMP-3 do tempo de 24 h para os tempos de 48 ou 72 h. No grupo ativado com 10 EU/mL de endotoxinas, no período de 24 h a produção de MMP-3 foi significativamente inferior ao período de 72 h (p<0,05). Já no grupo ativado com 20 EU/mL, os valores da produção de MMP-3 foram similares em todos os períodos avaliados (p>0,05). As tabelas 5 a 8 demonstram os valores médios ± desvios-padrão da produção de MMP-3 em cada grupo, em função do tempo, e a formação de grupos homogêneos.
Tabela 5 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação (controle)
Tempo média desvio-padrão Grupos homogêneos
24 154,98 108,21 A
48 342,25 221,70 A
72 753,13 514,30 B
Tabela 6 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 5 EU/mL
Tempo média desvio-padrão Grupos homogêneos
24 1026,00 193,14 A
48 2018,30 453,77 B
72 2198,90 229,53 B
Tabela 7 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 10 EU/mL
Tempo média desvio-padrão Grupos homogêneos
24 2166,70 112,78 A
48 2279,30 134,66 A B
72 2407,30 163,99 B
Tabela 8 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 20 EU/mL
Tempo média desvio-padrão Grupos homogêneos
24 1949,60 452,30 A
48 1975,60 490,33 A
45
Com relação à concentração de endotoxina utilizada na ativação celular, pode-se verificar que, em relação ao controle, houve significativo aumento na produção de MMP-3 (p<0,05) após ativação com diferentes concentrações de endotoxina (5, 10 e 20 EU/mL). Comparando-se as concentrações de endotoxinas, somente no tempo de 24 h houve diferença significante entre a concentração 5 EU/mL em relação às concentrações 10 ou 20 EU/mL (p>0,05). Nos períodos de 48 e 72 h, não houve diferença significante entre as concentrações de endotoxinas utilizadas (p>0,05) na ativação celular. Os valores médios e desvios-padrão de cada grupo e a formação de grupos homogêneos, nos tempos 24, 48 e 72 h, estão demonstrados nas tabelas 9 a 11.
Tabela 9 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 0, 5, 10 e 20 EU/mL nos período de 24 h
Concentrações de
endotoxina (EU/mL) média desvio-padrão Grupos homogêneos
0 (controle) 154,98 108,21 A
5 1026,00 193,14 B
10 2166,70 112,78 C
20 1949,60 452,30 C
Tabela 10 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 0, 5, 10 e 20 EU/mL nos período de 48 h
Concentrações de
endotoxina (EU/mL) média desvio-padrão Grupos homogêneos
0 (controle) 342,25 221,70 A
5 2018,30 453,77 B
10 2279,30 134,66 B
Tabela 11 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 0, 5, 10 e 20 EU/mL nos período de 72 h
Concentrações de
endotoxina (EU/mL) média desvio-padrão Grupos homogêneos
0 (controle) 753,13 514,30 A
5 2198,90 229,53 B
10 2407,30 163,99 B
20 2008,90 484,80 B
5.2 Produção de MMP-8
Os valores médios da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxinas de E. coli nas concentrações 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL, em diferentes períodos de tempo (24, 48 e 72 h), estão apresentados nas Tabelas 12 a 15, respectivamente.
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Tabela 12 – Valores médios da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação por endotoxina de E. coli (controle), nos diferentes períodos de tempo Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 1893,36 2295,33 2056,14 2 1490,35 1837,69 1999,26 3 1202,75 1568,78 3503,92 4 908,56 1801,75 3680,98 5 1625,70 1826,04 2617,54 6 1088,51 1847,46 2212,66 7 1325,37 2356,83 4029,48 8 1800,76 2735,03 3926,28 9 1436,96 2494,08 3421,77 10 1264,68 1990,22 3202,14
* grupo controle: sem ativação por endotoxina.
Tabela 13 – Valores médios da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 5 EU/mL nos diferentes períodos de tempo
Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 554,88 797,98 1202,75 2 520,74 981,38 1084,02 3 418,99 1007,29 1068,09 4 754,30 1158,99 984,41 5 710,26 1010,36 1477,66 6 804,86 1313,26 1242,35 7 825,76 921,74 1084,02 8 1334,91 1371,17 1688,79 9 1282,31 1081,07 1693,72 10 1366,14 1445,86 1841,67
Tabela 14 – Valores médios da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 10 EU/mL nos diferentes períodos de tempo
Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 622,91 1490,58 1047,05 2 369,17 1112,95 1171,23 3 907,36 1009,64 1069,04 4 792,59 1148,52 1297,52 5 416,68 1078,48 1048,38 6 691,65 1496,34 1376,12 7 496,07 676,15 582,46 8 867,17 1263,04 1378,82 9 485,77 464,04 513,58 10 953,97 1301,70 548,35
* grupo ativado com 10 EU/mL de endotoxina.
Tabela 15 – Valores médios da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 20 EU/mL nos diferentes períodos de tempo
Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 445,01 568,91 605,20 2 393,78 543,01 543,50 3 380,74 670,54 608,82 4 326,77 594,32 681,01 5 237,82 521,04 704,31 6 177,11 435,92 942,13 7 269,19 294,60 618,68 8 192,80 356,85 593,80 9 208,01 554,41 590,70 10 210,23 844,24 684,32
49
Após análise estatística, em relação ao tempo, pode-se verificar que houve aumento significativo da produção de MMP-8 (24, 48 e 72 h), independente da concentração de endotoxina utilizada na ativação celular. Assim, em todas as amostras, incluindo o grupo controle, houve aumento significativo da produção de MMP-8 do tempo de 24 até 72 h. No grupo ativado com 5 EU/mL de endotoxinas, houve significativo aumento da produção de MMP-8 do tempo 24 h para 72 h (p<0,05). Nos grupos ativados com 10 ou 20 EU/mL, houve aumento significativo da produção de MMP-8 do tempo 24 h para 48 h (p<0,05) e do tempo 24 para 72 h (p<0,05), sendo que os períodos de 48 h e 72 h apresentaram valores semelhantes (p>0,05). As tabelas 16 a 19 demonstram os valores médios ± desvios-padrão da produção de MMP-8 em cada grupo, em função do tempo, e a formação de grupos homogêneos.
Tabela 16 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação (controle)
Tempo média desvio-padrão Grupos homogêneos
24 1403,70 310,14 A
48 2075,30 372,29 B
72 3065,00 779,64 C
Tabela 17 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 5 EU/mL
Tempo média desvio-padrão Grupos homogêneos
24 857,31 349,68 A
48 1108,90 209,59 A B
Tabela 18 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 10 EU/mL
Tempo média desvio-padrão Grupos homogêneos
24 660,33 213,83 A
48 1104,10 328,63 B
72 1003,30 337,80 B
Tabela 19 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 20 EU/mL
Tempo média desvio-padrão Grupos homogêneos
24 284,15 95,72 A
48 538,38 155,83 B
72 657,25 111,86 B
Com relação à concentração de endotoxina utilizada na ativação celular, pode-se verificar que, em relação ao controle, houve significativa redução da produção de MMP-8 após ativação com endotoxinas nas diferentes concentrações. A produção de MMP-8 nos grupos ativados com 5 e 10 EU/mL foram semelhantes entre si (p>0,05) e significativamente inferior ao grupo controle (p<0,05). A produção de MMP-8 no grupo ativado com 20 EU/mL foi significativamente inferior a de praticamente todos os grupos avaliados (p<0,05). Os valores médios e desvios-padrão de cada grupo e a formação de grupos homogêneos, nos tempos 24, 48 e 72 h, estão demonstrados nas tabelas 20 a 22.
51
Tabela 20 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 0, 5, 10 e 20 EU/mL nos período de 24 h
Concentrações de
endotoxina (EU/mL) média desvio-padrão Grupos homogêneos
0 (controle) 1403,7 310,14 A
5 857,3 349,68 B
10 660,3 313,83 B
20 284,1 95,72 C
Tabela 21 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 0, 5, 10 e 20 EU/mL nos período de 48 h
Concentrações de
endotoxina (EU/mL) média desvio-padrão Grupos homogêneos
0 (controle) 2075,3 372,29 A
5 1108,9 209,59 B
10 1104,1 328,63 B
20 538,4 155,83 C
Tabela 22 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 0, 5, 10 e 20 EU/mL nos período de 72 h
Concentrações de
endotoxina (EU/mL) média desvio-padrão Grupos homogêneos
0 (controle) 3065,0 779,64 A
5 1336,7 312,18 B
10 1003,3 337,80 B C
6.1 Da metodologia
Na presente pesquisa, para verificar os efeitos da endotoxina sobre a produção de metaloproteinases da matriz, foi selecionada a linhagem celular humana U937 (monócitos/macrófagos), pois os macrófagos têm importante papel no início e manutenção do processo inflamatório periapical, incluindo reabsorção óssea (Grenier; Grignon, 2006). Estudos têm demonstrado que endotoxinas (LPS) têm a capacidade de se ligar ao receptor CD14 na superfície de monócitos e macrófagos e induzir a liberação de citocinas envolvidas no processo inflamatório, incluindo metaloproteinases da matriz (MMP) (Hong et al., 2004; Grenier; Grignon, 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008). A linhagem U937 foi selecionada, pois é muito utilizada em diversos estudos recentes que avaliam os efeitos de LPS em macrófagos, como a produção de diversas citocinas e também de MMP (Maldonado et al., 2004; Grenier; Grignon, 2006; Nareika et al., 2007; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008).
Como as células da linhagem U937 (monócitos) não são aderentes, foi preciso realizar a diferenciação celular para macrófagos maduros (Hojo et al., 2000; Jiang et al., 2003; Vogel et al., 2005; Grenier; Grignon, 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008). Para obter esta diferenciação, foram realizados primeiramente dois pilotos: a) as células foram mantidas em phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) na concentração 5 μg/mL por 48 h para promover aderência celular (Vogel et al., 2005); b) as células foram mantidas em PMA na concentração 10
53
ng/mL por 48 h para promover aderência celular (Tanabe; Grenier, 2008). Após a realização destes pilotos, um maior número de células aderidas viáveis foram obtidas com a metodologia proposta por Tanabe e Grenier (2008), entretanto, foi também realizado um terceiro piloto, utilizando concentração intermediária de PMA (1 Pg/mL) por 48 h, a qual promoveu um maior número de células viáveis aderidas, sendo este protocolo selecionado para a presente pesquisa.
Foi utilizado o teste de exclusão com azul de tripan (0,5%) para verificar a viabilidade celular, pois este é um método confiável, utilizado por vários autores (Chang et al., 2002; Vogel et al., 2005; Bodet et al., 2006; Bodet et al., 2007; Oliveira et al., 2007). A quantidade de células viáveis distribuídas em cada poço da placa foi padronizada em 1x106 células/mL, quantidade previamente relatada na literatura (Bodet et al., 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008).
Para promover ativação celular foi utilizada endotoxina purificada de E. coli. Embora esta bactéria não seja comumente encontrada no interior dos canais radiculares com polpa necrosada, sua endotoxina apresenta a estrutura básica do componente lipídico, que representa o centro ativo responsável pelas propriedades tóxicas do LPS (Yin et al., 2003). Além disso, endotoxina de E. coli é considerada padrão e é utilizada na maioria dos trabalhos relatados na literatura (Jiang et al., 2004; Maldonado et al., 2004; Oliveira et al., 2005; Oliveira et al., 2007; Jiang et al., 2006; Lee et al., 2007; Nareika et al., 2007).
As metaloproteinases da matriz (MMP) representam uma família de endopeptidases zinco-dependentes com atividades proteolíticas sobre vários componentes da matriz extracelular (Krane, 1994; Lin et al., 2001). Os macrófagos expressam várias MMP, incluindo colagenases (MMP-1, MMP-8), gelatinases (MMP-2, MMP-9), estromelisinas (MMP-3, MMP-7, MMP-12) e colagenase-3 (MMP-13) (Goetzl et al., 1996; Imai et al., 1998; Wahlgren et al., 2002).
Tendo em vista que MMP-3 (Shin et al., 2002; Pita et al., 2009) e MMP-8 (Wahlgren et al., 2002; Sulkala et al., 2007) estão relacionadas com inflamação pulpar e periapical, no atual estudo, foram selecionados estas MMP (estromelisina: MMP-3 e colagenase: MMP-8) para verificar se a endotoxina apresenta capacidade de induzir a produção destas MMP na mesma linhagem celular.
Com relação às diferentes concentrações de endotoxinas utilizadas para ativação celular, foram padronizadas as concentrações de 5, 10 e 20 EU/mL, baseado no estudo de Hong et al. (2004), que utilizaram as concentrações de 1, 5 e 10 EU/mL de LPS por 24 h para verificar a expressão gênica de MMP-1 em macrófagos (linhagem J 774, camundongo). No presente estudo, foi acrescentada a concentração de 20 EU/mL para verificar se esta concentração promoveria maior ativação celular, sem causar efeitos citotóxicos (morte celular). A ativação por diferentes concentrações de endotoxinas é importante para verificar se a produção de MMP é dependente da dose de endotoxina ou apenas da sua presença (dose-independente).
Com relação ao tempo de ativação celular, foram avaliados na presente pesquisa três diferentes períodos de tempo: 24, 48 e 72 h. A maioria dos estudos que avaliam os diferentes efeitos de LPS em cultura de macrófagos, incluindo produção de citocinas e MMP, avaliam apenas no período de 24 h (Hong et al., 2004; Maldonado et al., 2004; Bodet et al., 2006; Grenier; Grignon, 2006; Nareika et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008). Em 2007, Bodet et al. avaliaram, em fibroblastos, os efeitos de LPS na produção de diferentes MMP e seus inibidores após estimulação por 6, 24 e 48 h. Assim, tornou-se interessante também verificar, em macrófagos, se a produção de MMP aumenta de acordo com o aumento do período de ativação.
A detecção de MMP na presente pesquisa foi realizada pelo ensaio imunoenzimático ELISA utilizando Kits específicos (R & D System). Estes Kits utilizam anticorpos anti-MMP-3 ou anti-MMP-8 total
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humana, ou seja, conseguem detectar MMP-3 ativa somada a forma pró- MMP-3 ou MMP-8 ativa somada a forma pró-MMP-8. Estes kits foram selecionados pois são os mais utilizados na literatura (Figueredo et al., 2003; Maldonado et al., 2004; Bodet et al., 2006; Grenier; Grignon, 2006; Nareika et al., 2007; Sundararaj et al., 2008; Tanabe; Grenier, 2008).
6.2 Dos resultados
Com relação aos resultados obtidos da produção das MMP em função do tempo, pode-se verificar que houve aumento significativo da produção de MMP-3 e MMP-8 em função do aumento de tempo, exceto no grupo MMP-3 ativado por 20 EU/mL, em que o aumento da produção de MMP-3 não foi significativo em relação ao tempo. Na maioria das amostras, incluindo o grupo controle (sem ativação por endotoxina), houve aumento da produção de MMP-3 e MMP-8 à medida que o tempo aumentou, de 24 até 72 h. Estes resultados concordaram com os estudos de Chang et al. (2002) e Bodet et al. (2007). Chang et al. (2002) verificaram que a produção de MMP-2, em fibroblastos do ligamento periodontal humano, aumentou significativamente de acordo com o tempo, sendo que para esta linhagem celular, o nível de MMP-2 começou a aumentar no 4º dia. Bodet et al. (2007) também demonstraram que a produção de MMP-2 e MMP-3 em fibroblastos aumentou em função do tempo tanto nas amostras do grupo controle (sem ativação) como nas ativadas por LPS.
Como o aumento de MMP-3 e MMP-8 em função do tempo também ocorreu no grupo controle (sem ativação por endotoxina), é provável que este aumento tenha ocorrido devido ao aumento no número de células na cultura (O’Boskey; Panagakos, 1998), o que resultou em um maior número de enzimas presente nos sobrenadantes. De acordo com
os resultados da presente pesquisa, as células mesmo sem ativação por endotoxinas produziram MMP-3 e MMP-8. Isto pode ser atribuído à expressão gênica destas MMP nesta linhagem celular, pois a expressão da maioria das MMP é induzida, em pequeno número, a um nível constante (Palosaari et al., 2003).
Além disso, o tratamento com PMA pode ter induzido a liberação de MMP-3 e MMP-8 no grupo controle. Bodet et al. (2007) ativaram cultura de fibroblastos com LPS ou PMA por 6, 24 e 48 h e verificaram que no caso de MMP-2, a utilização de PMA não induziu aumento da produção de MMP-2 em relação ao controle (sem ativação), já com relação à MMP-3, a utilização de PMA promoveu produção de MMP-3 superior ao grupo controle. Grenier e Grignon (2006) e Tanabe e Grenier (2008) realizaram o tratamento da linhagem celular (U937) com phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) e demonstraram que os macrófagos diferenciados por este tratamento produziram MMP-9 na ausência de LPS (grupo controle). Este resultado corrobora com o presente estudo, no qual houve produção de MMP-8 também no grupo controle, mas diverge quanto à redução da produção de MMP-8 observada após ativação de LPS.
Esta significativa redução da produção de MMP-8, em relação ao controle, após ativação com diferentes concentrações de endotoxinas, também difere de Sundararaj et al. (2008) que, semelhante ao presente estudo, avaliaram a produção de MMP-8 por monócitos (U937) e, utilizando reação ELISA (Kits R & D) encontraram aumento significativo, em relação ao grupo controle, da produção desta MMP após ativação com 100 ng/mL de LPS por 24 h.
Uma das possíveis explicações para esta divergência de resultados em relação ao trabalho de Sundararaj et al. (2008), estaria no fato que estes autores não induziram a diferenciação celular de monócitos para macrófagos maduros com uso de PMA, que é um potente ativador da proteína C quinase e regula a expressão de COX-2 (Jiang et al., 2003).
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Esta diferenciação celular utilizada na presente pesquisa e em diversos trabalhos (Hojo et al., 2000; Jiang et al., 2003; Vogel et al., 2005; Grenier; Grignon, 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008) leva a alterações permanentes dos parâmetros celulares como na morfologia, na função, no metabolismo e no crescimento celular (Dini et al., 2009). Além disso, é alterada também a propriedade dos monócitos humanos em metabolizar ácido araquidônico e liberar prostaglandina após estimulação. Os macrófagos derivados de monócitos passam a ser mais responsivos ao LPS e, portanto, passam a liberar maior quantidade de PGE2, segundo Jiang et al. (2003). Estes autores compararam a produção de fosfofolipase A2 citosólica (cPLA2), cicloxigenase 1 e 2 (COX- 1 e 2), ácido araquidônico e PGE2 entre monócitos (U937) ativados com LPS e PMA e macrófagos diferenciados de monócitos (U937) com uso de PMA, também ativados com LPS e PMA. Os macrófagos ativados com LPS apresentaram maior produção de ácido araquidônico e PGE2 do que os monócitos ativados com LPS. Os monócitos só produziram uma quantidade significativa de ácido araquidônico e PGE2 quando ativados por PMA, além disso, ao contrário dos macrófagos que expressaram COX-1 e COX-2, os monócitos expressaram somente COX-1.
Esta capacidade dos macrófagos derivados de monócitos serem mais responsivos ao LPS e, portanto, liberar uma maior quantidade de PGE2, via COX-2, poderia explicar a redução característica da produção de MMP-8 observada no presente estudo, pela hipótese de que a produção desta MMP-8 estaria relacionada à presença de PGE2 ou COX-2. Neste caso, a presença de COX-2 ou a presença excessiva de PGE2 poderia ter efeito inibitório à produção de MMP-8. Diversos estudos relatam que a expressão de MMP por macrófagos ativados com LPS pode ocorrer por meio de uma via dependente de PGE2 e AMPc (Wahl; Corcoran, 1993; Zhang et al., 1998) ou independente de PGE2 (Zhang et