Análise da produção de β-cinamomina

A análise da produção da elicitina foi efectuada em filtrados de meios de cultura dos isolamentos selvagens (PA45 e PA37) e transformados geneticamente (FATSS e 13C), cultivados em meio V8C ou MSE, durante 5 ou 15 dias.

I.2.9.1. Precipitação de proteínas de filtrados de meios de cultura

Num tubo Eppendorf de 1,5 ml foram colocados 1 ml de meio de cultura e 250 µl duma solução de ácido tricloroacético (100% p/v), misturando por pipetagem. Seguiu-se um período de arrefecimento de 30 min em gelo. A mistura foi depois centrifugada a 16000 g durante 10 min. O sobrenadante foi eliminado e o pellet lavado com 1 ml de acetona (100%) e, em seguida, com 1 ml de éter dietílico (100%). Por fim, o pellet foi ressuspenso em 16 µl de uma solução 1,0 M Tris pH 9,5.

I.2.9.2. Electroforese de proteínas em gel SDS-PAGE

A electroforese foi realizada no sistema Mini Protean II (BIORAD). A “sandwich” constituída pelas placas de vidro e espaçadores foi montada e colocada no suporte. A solução do Gel de Separação [Acrilamida 17,5% (p/v)] foi, cuidadosamente, introduzida na sandwich, de modo a evitar a formação de bolhas de ar. Após ter sido adicionada a quantidade apropriada de gel de separação (até o topo do gel atingir o nível de 1 cm abaixo do topo do vidro mais pequeno), foi colocada uma camada de etanol (100%) no topo do gel, de modo a

assegurar que a superfície do gel ficasse lisa e sem declives. A polimerização do gel ocorreu à temperatura ambiente durante 45 min. Em seguida, o etanol foi retirado e no seu lugar foi introduzida a solução do Gel de Concentração [Acrilamida 4% (p/v)]. O pente foi montado na

sandwich e o seguiu-se mais um período de polimerização durante 30 min. De seguida, a sandwich foi colocada no eléctrodo e este foi inserido no tanque de electroforese; foi

adicionado tampão de corrida no interior e no exterior do eléctrodo, assegurando que, tanto a base como o topo do gel, se encontravam imersos em tampão. O pente foi retirado e a integridade dos poços foi verificada.

Preparação da solução do gel de separação: foram misturados 5,830 ml de solução Acrilamida/Bis-acrilamida [Acrilamida 30% (p/v); Bis-acrilamida 0,8% (p/v)], 3,750 ml de Tris-HCl 1,0M pH 8,8 , 50 µl de solução SDS 20% (p/v), 337 µl de água destilada estéril e 25 µl de solução persulfato de amónia 20% (p/v) (solução preparada no momento da preparação do gel). Imediatamente antes de verter a mistura na sandwich, foram adicionados 10 µl de TEMED.

Preparação da solução do gel de separação: foram misturados 5,830 ml de solução Acrilamida/Bis-acrilamida [Acrilamida 30% (p/v); Bis-acrilamida 0,8% (p/v)]; 3,750 ml de Tris-HCl 1,0 M, pH 8,8; 50 µl de solução SDS 20% (p/v); 337 µl de água destilada esterilizada e 25 µl de uma solução de persulfato de amónia 20% (p/v) (solução preparada no momento da preparação do gel). Imediatamente antes de verter a mistura na sandwich foram adicionados 10 µl de TEMED.

Preparação da solução do gel de concentração: foram misturados 1,665 ml de solução Acrilamida/Bis-acrilamida [Acrilamida 30% (p/v); Bis-acrilamida 0,8% (p/v)]; 1,25 ml de Tris-HCl 1,0 M, pH 8,8; 50 µl de solução SDS 20% (p/v), 7 ml de água destilada esterilizada e 25 µl de uma solução de persulfato de amónia 20% (p/v) (solução preparada no momento da preparação do gel). Imediatamente antes de verter a mistura na sandwich, foram adicionados 25 µl de TEMED.

Preparação do tampão de corrida: a 800 ml de água destilada foram adicionados 14,4 g de glicina, 6 g de Tris e 5 ml de solução SDS 20% (p/v). Foi acrescentada água destilada até perfazer um litro de tampão.

Transformação genética de Phytophthora cinnamomi

e silenciamento dos genes das elicitinas Material e Métodos

Preparação do tampão redutor: foram misturados 10 ml de uma solução Tri-HCl 1,0 M, 12,5 ml de glicerol, 2,5 g de SDS, 1,93 g de DTT e 250 mg de azul de bromofenol. Foram preparadas alíquotas para preservação do tampão a –20ºC.

16 µl de cada amostra foram misturados com 4 µl de tampão redutor. As amostras foram aquecidas a 100ºC durante 5 min e aplicadas no gel.

A corrida foi realizada a 120 V até a frente de migração atingir o gel de separação; a restante corrida foi realizada a 175 V.

I.2.9.3. Detecção por coloração com azul de Coomassie

Após o final da corrida electroforética, o gel foi retirado da sandwich, imerso em solução de coloração de Coomassie e agitado nessa mesma solução durante 30 min. Em seguida, o gel foi lavado com água destilada e agitado em solução de descoloração (que foi mudada várias vezes). O tempo de descoloração foi variável (de 1 h a períodos de uma noite), dependendo do momento em que se considerava que a coloração não específica já não interferia na leitura dos resultados. Após a descoloração, o gel foi fotografado.

Preparação de solução de coloração de Coomassie: foram misturados 500 ml de etanol, 100 ml de ácido acético e 3 g de azul de Coomassie R-250. Foi acrescentada água destilada até perfazer um litro de solução.

Preparação de solução de descoloração: foram misturados 100 ml de metanol, 100 ml de ácido acético e 800 ml de água destilada.

I.2.9.4. Detecção por Western blotting

O procedimento de transferência capilar das proteínas do gel para a membrana foi realizado com o auxílio do sistema Trans-Blot SD semi-dry transfer cell (BIORAD), de acordo com instruções do fabricante.

Dois pedaços de papel Extra Thick Blot (BIORAD) e uma membrana Trans-Blot

Transfer Medium (nitrocelulose, 0,2 µm) (BIORAD) foram cortados com tamanho

semelhante ao gel. O gel e a membrana foram equilibrados com o tampão de transferência Bjerrum e Schaffer-Nielsen (BSN) (48 mM Tris, 39 mM glicina, 20 % metanol, pH 9,2) durante 15 min. A sandwich de transferência foi montada sobrepondo, sucessivamente, em

cima do ânodo de platina do aparelho, um pedaço de papel Extra Thick Blot, a membrana, o gel SDS-PAGE e finalmente o outro pedaço de papel extra thick blot. As bolhas de ar foram excluídas a cada colocação de um novo elemento na sandwich através do movimento de rotação de uma pipeta limpa em cima da cada nova camada. Foram colocados 10 ml de tampão BSN no topo da sandwich e o excesso removido da placa do ânodo. A placa do cátodo foi montada sem perturbar o empilhamento. A tampa de segurança foi fechada e o aparelho foi ligado com os parâmetros de potência de acordo com o tamanho e natureza do gel: 15 V durante 20 min.

Para avaliar o sucesso da transferência, a membrana foi corada com uma solução Ponceau S [Ponceau S 0.5 % (p/v), ácido acético 1% (v/v)] durante 8 min, com agitação suave. As bandas do marcador molecular foram assinaladas com cortes de chisato. A coloração foi, depois, removida com uma lavagem com água destilada, durante 8 min com agitação suave.

Para a detecção das proteínas, a superfície da membrana que não continha proteínas foi bloqueada, de modo a evitar ligações não específicas: a membrana foi tratada com um solução de PBS-T [1 litro de Phosphate Buffered Saline (Sigma) + 500 µl Tween 20], durante 30 min, sob agitação suave.

A membrana foi depois tratada durante 16 h, a 4ºC, com o anticorpo primário contra a β-cinamomina(cedido por Carlos Novo) diluído 1000x em solução PBS-T. Após este período, a membrana foi lavada três vezes com solução PBS-T, durante 10 min sob agitação suave.

A membrana foi, em seguida, tratada durante 2 h, sob agitação suave, com o anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina anti Ig G de coelho, diluído 6700x em solução de PBS-T. Após este período, a membrana foi lavada três vezes com solução PBS-T, durante 10 min sob agitação suave.

Finalmente, a membrana foi imersa em solução de revelação, BCIP/NBT (5-Bromo-4-

Chloro-3-Indolyl Phosphate / Nitro Blue Tetrazolium) (Sigma), e mantida no escuro durante,

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Nota 1

Segurança Biológica: todos os materiais infectados (meios de cultura, material de laboratório, etc.) foram autoclavados durante 1 h a 121ºC, antes de serem colocados no lixo, para inactivação dos propágulos bacterianos e de P. cinnamomi usados neste trabalho.

Nota 2

Quando não especificada outra referência, os procedimentos básicos de biologia molecular atrás descritos seguiram as recomendações de Sambrook et al., (1989).