Expressão dos genes das elicitinas

Estudos filogenéticos sugerem que a diversidade genética observada na família das elicitinas é anterior ao fenómeno de especiação e que nas diferentes espécies de Phytophthora esta variedade é mantida por selecção purificante (Jiang et al., 2006). Daqui pode deduzir-se que os diferentes grupos de elicitinas possuem funções distintas, sendo esta hipótese corroborada pela sua expressão diferencial e específica.

Em P. infestans, os genes eli que se encontram em cluster mostram padrões de expressão similares, com um elevado nível de expressão em micélio: foi proposto que o agrupamento destes genes é importante para a sua expressão simultânea (Jiang et al., 2006).

Os membros da família das elicitinas apresentam uma expressão diferencial no espaço e no tempo, tal como foi demonstrado em diversos estudos focalizados em padrões de expressão específica. Os genes eli e ell são diferencialmente expressos ao longo do ciclo de vida de Phytophthora (exposto na introdução do Capítulo II), tal como foi demonstrado através da contagem de transcritos em bibliotecas de ESTs provenientes de zoósporos, esporângios e micélio de P. infestans e P. sojae e hibridações de mRNA isolado de micélio, esporângios, zoósporos, quistos e quistos germinados de P. infestans e P. parasitica (Jiang et

al., 2006). Também, os níveis de expressão dos genes eli e ell diferem significativamente.

Globalmente, a expressão dos genes eli parece ser mais elevada do que os genes ell, com a excepção de sol3a, que é um dos genes mais expressos nos zoósporos de P. sojae. (Jiang et

al., 2006). A diferença nos níveis de expressão entre os genes eli e ell também poderá estar

relacionada com diferenças no conteúdo GC3 (codões com G ou C na terceira posição) das regiões codificantes. Numa extensa pesquisa realizada em P. sojae foi verificado que os genes mais expressos possuem geralmente um conteúdo GC3 mais elevado que os genes menos expressos (Jiang e Govers, dados não publicados citados em Jiang et al., 2006). Em P.

brassicae, P. infestans, P. ramorum e P. sojae, o GC3 médio dos genes eli é de 86%, mais

alto que os 75% dos genes ell, em concordância com os níveis mais altos de expressão dos genes eli quando comparados aos dos genes ell (Jiang et al., 2006).

Quotob et al. (2003) também analisaram a expressão genética das elicitinas em ESTs derivadas de micélio cultivado in vitro, de locais de infecção e de zoósporos e observaram que em P. sojae, elicitinas das classes IA, IB, II e III foram detectadas apenas em micélio e locais de infecção e as elicitinas com sequências primárias mais divergentes apenas se expressavam em zoósporos.

Panabières et al. (1998) expressaram o gene da β-criptogeína em P. infestans e verificaram que os promotores das elicitinas são funcionais e podem ser regulados por factores idênticos em várias espécies, pois a quantidade de β-criptogeína produzida na estirpe de P. infestans transformada foi semelhante à produzida no isolamento de P. cryptogea que forneceu o transgene. Também observaram que a produção global de elicitinas canónicas é constante dentro de um dado isolamento e que as elicitinas das classes IA e IB podem ser

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substituídas entre si, mesmo que sejam elicitinas de outra espécie, sem aparente modificação fenotípica do patogénio (à excepção do comportamento em tabaco, que passou de não necrosante a necrosante). O papel das elicitinas canónicas parece assim ser comum nas várias espécies de Phytophthora e idêntico para as classes IA e IB.

A expressão dos genes inf foi analisada por Northern blotting em várias situações. Inf1 foi abundantemente expresso in vitro, em micélio cultivado em vários meios de cultura e a sua expressão não foi detectada em esporângios, zoósporos, quistos ou quistos em germinação (Kamoun et al., 1997b). In planta, durante a primeira fase de infecção da batateira (correspondente a uma relação de biotrofia), a expressão do gene inf1 não foi detectada. O transcrito inf1 só foi detectado 3 dias após a infecção e os seus níveis mais altos ocorreram aos dias 5 e 6, quando o patogénio se encontrava em esporulação e era constatada necrose dos tecidos. Nos dias seguintes, o nível de inf1 decresceu (Kamoun et al., 1997b). Noutro estudo, a presença dos genes inf1 e inf2 (codificantes para elicitinas da classe III) foi revelada, por RT-PCR semi-quantitativa, durante a infecção de tomateiro: inf e inf2B foram detectados logo após um dia da inoculação, ao passo que inf2A foi detectado três dias após a inoculação (Huitema et al., 2005). Os picos de expressão também foram atingidos em tempos distintos, sendo que inf1 atingiu um máximo numa fase mais tardia da infecção, ao quarto dia, enquanto que inf2A obteve o auge ao terceiro dia e inf2B ao terceiro e quarto dias, indicando que estas proteínas são funcionalmente relevantes para a patogenicidade de P. infestans (Huitema et al., 2005). Foi demonstrado que os dois isolamentos de P. infestans para os quais foi evidenciada ausência natural de produção de INF1 (Kamoun et al., 1998a) expressam genes inf2 (Huitema

et al., 2005).

Foi demonstrado que isolamentos de P. parasitica produtores de elicitinas in vitro e virulentos em tabaco sofrem uma diminuição de expressão destes genes in planta, durante interacções compatíveis com tabaco ou outras plantas (Colas et al., 2001). Esta sub-regulação parece estar ligada exclusivamente aos isolamentos patogénicos para o tabaco já que os isolamentos avirulentos para tabaco e patogénicos para outros vegetais continuam a expressar o gene durante a infecção (Colas et al., 2001). Assim, a redução de produção de elicitinas durante a invasão de tabaco por P. parasitica pode constituir um meio de evasão do reconhecimento do sistema específico de defesa do tabaco, sendo as possíveis funções das elicitinas asseguradas por uma quantidade ínfima de proteínas (Colas et al., 2001), cuja presença não seria detectável pelo hospedeiro. Esta estratégia de evasão terá sido levada ao limite por isolamentos de P. parasitica de tabaco que, apesar de reterem os genes das

elicitinas, não as expressam in vitro (Kamoun et al., 1993b). Curiosamente, também foi encontrado um isolamento de tomateiro onde não foram detectados genes de elicitinas, que se tornou totalmente avirulento em tomate e tabaco (Kamoun et al., 1993b) e que não apresenta esporulação sexuada ou assexuada (M: Coffey, comunicação pessoal citada em Kamoun et

al., 1994). Por outro lado, os isolamentos de P. infestans para os quais foi evidenciada

ausência de produção de INF1 (Kamoun et al., 1998a) mas que expressam os genes inf2 (Huitema et al., 2005) apresentam variações fenotipicas relativamente à capacidade de esporulação, com culturas com e sem esporulação (Kamoun et al., 1998a).

Métodos imunológicos também foram utilizados para analisar a presença de elicitinas durante interacções compatíveis. Foram detectadas elicitinas um ou dois dias depois da inoculação das plantas nos casos das interacções P. capsici/tomateiro, P. capsici/pimento e P.

parasitica/tomateiro, num padrão que comprova que o patogénio sintetiza as elicitinas à

medida que coloniza a planta (Devergne et al., 1994). Brummer et al. (2002) provaram por meios imunocitoquímicos que o padrão de produção de quercinina durante o processo de infecção de raízes de Quercus robur acompanha o padrão de crescimento do patogénio durante os primeiros 5 dias após a infecção. Esta elicitina foi localizada à volta das hifas, no espaço apoplástico e dentro das células invadidas do hospedeiro. Estes resultados indicam que as elicitinas também poderão actuar como toxinas, de modo a enfraquecer o tecido do hospedeiro.

A expressão do gene da citricolina, elicitina de P. citricola, durante a interacção do patogénio com plântulas de faia foi quantificada por RT-PCR em tempo real (Fleischmann et

al., 2005). Durante o crescimento do patogénio nas raízes finas do hospedeiro, o gene foi

induzido três dias após a inoculação, numa altura em que é esperada a esporulação. O pico de expressão foi atingido ao quinto dia e após 7 dias a presença do gene já era muito baixa, embora o crescimento do oomiceta tivesse progredido ainda durante mais algum tempo. Isto é semelhante ao padrão de expressão encontrado para o gene inf1 de P. infestans, que foi elevada após a infecção das folhas e durante a esporulação, mas reduzida pouco antes da destruição dos tecidos (Kamoun et al., 1997b). Contudo, o colapso das raízes não foi observado em faia.

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