Análise de rbcL

Para a matriz da porção final do rbcL (993-rbcS), as 18 amostras foram inteiramente sequenciadas, com 615 pb (usando o primer RrbcS original) ou 603 pb (com o primer RrbcS modificado). À estas amostras foram adicionadas 22 sequências do Genbank sendo Chondria collinsiana (GU330225) e Chondria littoralis (KF672853) os grupos externos. Árvores bayesiana, de distância (NJ), máxima parcimônia (MP) e máxima verossimilhança (ML) foram geradas a partir delas. Nessa análise 115 sítios foram filogeneticamente informativos para parsimônia.

A mostra a árvore consenso gerada de Neighbor-joining com valores de probabilidade posterior (PP) da inferência bayesiana (IB) e de bootstrap para NJ, MP e ML representado nos ramos.

65 Figura 16. Árvore consenso enraizada de Neighbor-joining inferida para sequências do rbcL de espécimes do complexo Laurencia. Chondria collinsiana e Chondria littoralis foram utilizadas como grupo externo. A espessura dos ramos representa os valores de probabilidade posterior (PP) da Análise Bayesiana onde, os ramos mais espessos representam valores entre 0,95 e 1,00; ramos de espessura intermediária representam valores entre 0,90 e 0,94 e, ramos de espessura normal representam valores abaixo de 0,94. Os valores de bootstrap (2000 réplicas) referentes às análises de Neighbor-joining (NJ) e Máxima Parcimônia (MP) e de Máxima Verossimilhança (ML) (100 réplicas) estão expressos nos ramos, nesta ordem. Sequências do Genbank estão identificadas com os números de acesso entre parênteses. As análises foram realizadas nos programas MrBayes versão 3.2.5 (IB), PAUP versão 4.0a146 (MP) e MEGA7 (NJ e ML).

rbcL

NJ/MP/ML

Laurencia dendroidea – SP-Brasil (AF465810)

L. dendroidea (como L. scoparia)_ES-Brasil (AY593971) L. dendroidea – RJ-Brasil (GU330237)

L. dendroidea – RJ-Brasil (GU330222)

LD05 LD04 LD03 LD02 LD01

L. dendroidea – BA-Brasil (GU330228) L. dendroidea – Ilhas Canárias (EF686000) Laurencia intricata – Cuba (GU330238) Laurencia intricata – México (AF465809) Laurencia intricata – USA (AY588410)

Laurencia catarinenses – Ilhas Canárias (KF492781) Laurencia catarinenses – Ilhas Canárias (KF492779) Laurencia catarinenses – Ilhas Canárias (KF492776)

Laurencia aldingensis – RJ-Brasil (JF810351)

LA09 LA08 LA07 LA06 LA05 LA04 LA03 LA01 LA02

Palisada flagellifera – ES-Brasil (EF061647) Palisada flagellifera – RJ-Brasil (GU330227)

Palisada perforata – RJ-Brasil (EU256331)

LI03 LI04 LI02 LI01

Laurenciella marilzae – Ilhas Canárias (EF686003) Laurenciella marilzae – México (HQ115065) Laurenciella marilzae – Portugal (KF492798) Laurenciella marilzae – SP-Brasil (GU938189) Chondria collinsiana – RJ-Brasil (GU330225)

Chondria littoralis – USA (KF672853)

89/96/70 99/100/99 99/100/99 99/97/97 92/59/90 99/100/99 99/100/97 58/76/62 75/80/90 70/78/69 99/98/90 61/67/63 64/76/76 69/58/78 99/100/91 88/91/81 0.01 substituições/sítio L aur enc ie ll a P al is ada L aur enc ia

66 A estatística bayesiana aplicada a análises filogenéticas se torna muito interessante, pois gera tanto uma árvore estimada quanto o grau de incerteza de cada grupo naquela árvore (Andrade et al., 2007). E nesse estudo, como as duas principais finalidades foram, não fazer inferências filogenéticas mas, gerar um barcode para os táxons estudados e promover o correto agrupamento deles, a árvore escolhida foi a de NJ, até mesmo como forma de comparação com as árvores geradas com os outros genes estudados. Mas não deixando de obter os resultados de grau de incerteza de cada grupo naquela árvore, que são os dados de probabilidade posterior (PP).

A estatística bayesiana aplicada é um método estatístico altamente relacionado com a ML, em que a hipótese ótima é aquela com a máxima PP - que é dada pela verossimilhança multiplicada pela probabilidade a priori desta hipótese (Holder & Lewis, 2003). No presente estudo, apesar da árvore filogenética apresentar uma topologia um pouco diferente daquelas obtidas com os outros genes, também mostrou que o complexo Laurencia é monofilético com PP de 100% em relação aos táxons usados como grupos externos. Para todos os valores absolutos de PP obtidos na análise de IB, verificar anexo 2.

O gênero Laurenciella foi o mais basal com suporte alto de bootstrap para todas as análises (99 para NJ e ML e 100 para MP). As amostras LI do presente estudo ficaram agrupadas num único ramo (também com suporte alto de bootstrap) e separadas de Laurecia marilzae com uma divergência de 1,1 a 1,3% (Tabela 11). Pode-se notar também que o gênero Palisada se posicionou como grupo irmão de Laurenciella, assim como aconteceu nas análises de COI-5P.

Ao que se pensava anteriormente, que esta espécie LI era a Laurencia intricata devido às similaridades morfológicas, estes resultados vieram mais uma vez corroborar que definitivamente não o são. Laurencia intricata de Cuba, Mexico e USA divergiram com 9,5% (53 nt) das amostras LI, além de terem se agrupado ao gênero Laurencia, como grupo irmão de Laurencia dendroidea com suporte moderado de bootstrap e PP.

67 Tabela 11. Porcentagem de divergência (porção inferior) e número de nucleotídeos divergentes (porção superior) entre as sequências do rbcL de espécimes de Laurenciella sp., Laurenciella marilzae e Laurencia

intricata obtidos no programa PAUP versão 4.0a146. Sequências do Genbank apresentam informações do

local de coleta e estão identificadas com os números de acesso entre parênteses.

Sequências 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 LI CU (GU330238) ID 0 0 53 53 53 53 56 55 62 55 2 LI MX (AF465809) 0,0 ID 0 53 53 53 53 56 55 62 55 3 LI US (AY588410) 0,0 0,0 ID 53 53 53 53 56 55 62 55 4 LI01 9,5 9,5 9,5 ID 0 0 0 7 6 7 6 5 LI02 9,5 9,5 9,5 0,0 ID 0 0 7 6 7 6 6 LI03 9,5 9,5 9,5 0,0 0,0 ID 0 7 6 7 6 7 LI04 9,5 9,5 9,5 0,0 0,0 0,0 ID 7 6 7 6 8 LM Can (EF686003) 10,0 10,0 10,0 1,3 1,3 1,3 1,3 ID 1 0 1 9 LM MX (HQ115065) 9,8 9,8 9,8 1,1 1,1 1,1 1,1 0,2 ID 0 0 10 LM PT (KF492798) 11,1 11,1 11,1 1,2 1,2 1,2 1,2 0,0 0,0 ID 0 11 LM SP (GU938189) 9,8 9,8 9,8 1,1 1,1 1,1 1,1 0,2 0,0 0,0 ID

LI01-04: amostras do presente estudo; LI: Laurencia intricata; LM: Laurenciella marilzae

Na árvore filogenética do rbcL enraizada em NJ, as amostras LA01-09 do presente estudo foram fielmente agrupadas num único ramo com 100% de afinidade. Junto a elas, no mesmo ramo, agrupou-se Laurencia aldingensis do RJ, que não apresentou divergência alguma (Tabela 12).

Numa relação também próxima, com suporte alto de PP e bootstrap para todas as análises, vê-se

Laurencia catarinensis num ramo vizinho, mas claramente separado de do ramo das LA01-09. A

variação interespecífica de Laurencia catarinensis com as LA01-09 do presente estudo e

Laurencia aldingensis do RJ foi de 0,5%, o que representa 3 nt divergentes.

O agrupamento num único ramo, associado à ausência de divergência entre as amostras de LA01- 09 e Laurencia aldingensis do RJ, nos leva a concluir que elas são pertencentes ao mesmo táxon.

68 Tabela 12. Porcentagem de divergência (porção inferior) e número de nucleotídeos divergentes (porção superior) entre as sequências do rbcL de espécimes de Laurencia aldingensis e Laurencia catarinensis obtidos no programa PAUP versão 4.0a146. Sequências do Genbank apresentam informações do local de coleta e estão identificadas com os números de acesso entre parênteses.

Sequências 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 LA01 ID 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 3 2 LA02 0,0 ID 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 3 3 LA03 0,0 0,0 ID 0 0 0 0 0 0 0 3 3 3 4 LA04 0,0 0,0 0,0 ID 0 0 0 0 0 0 3 3 3 5 LA05 0,0 0,0 0,0 0,0 ID 0 0 0 0 0 3 3 3 6 LA06 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 ID 0 0 0 0 3 3 3 7 LA07 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 ID 0 0 0 3 3 3 8 LA08 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 ID 0 0 3 3 3 9 LA09 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 ID 0 3 3 3 10 LA RJ (JF810351) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 ID 3 3 3 11 LC Can (KF492776) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 ID 0 0 12 LC Can (KF492781) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,0 ID 0 13 LC Can (KF492779) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,0 0,0 ID

LA01-09: amostras do presente estudo; LA: Laurencia aldingensis; LC: Laurencia catarinensis.

Todas as amostras de L. dendroidea foram agrupadas com suporte alto de PP e bootstrap nas análises testadas As amostras do presente estudo não tiveram divergência de nucleotídeos entre si em suas sequências. As maiores porcentagens de divergência ocorreu quando comparadas com as amostras das Ilhas Canárias (0,9%, 5 nt) e Bahia (0,7%, 4 nt). As variações com relação às amostras do RJ, SP e ES foram ausentes (Tabela 13).

69 Tabela 13. Porcentagem de divergência (porção inferior) e número de nucleotídeos divergentes (porção superior) entre as sequências do rbcL de espécimes de Laurencia dendroidea obtidos no programa BioEdit versão 3.3.19.0. Sequências do Genbank apresentam informações do local de coleta e estão identificadas com os números de acesso entre parênteses.

Sequências 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 LD01 ID 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 2 LD02 0,0 ID 0 0 0 4 5 0 0 0 0 3 LD03 0,0 0,0 ID 0 0 4 5 0 0 0 0 4 LD04 0,0 0,0 0,0 ID 0 4 5 0 0 0 0 5 LD05 0,0 0,0 0,0 0,0 ID 4 5 0 0 0 0 6 LD BA (GU330228) 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 ID 4 4 4 4 4 7 LD Can (EF686000) 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,7 ID 5 5 5 5 8 LD RJ (GU330222) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,7 0,9 ID 0 0 0 9 LD RJ (GU330237) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,7 0,9 0,0 ID 0 0 10 LD SP (AF465810) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,7 0,9 0,0 0,0 ID 0 11 LD ES (AY593971) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,7 0,9 0,0 0,0 0,0 ID

LD01-05: amostras do presente estudo; LD: Laurencia dendroidea

Pode-se verificar então, que as amostras LD01-05 do presente estudo, apesar de terem sido coletadas em épocas e lugares diferentes, são pertencentes ao mesmo táxon e estão intimamente agrupadas com Laurencia dendroidea, o que nos levar a inferir que são a mesma entidade taxonômica.

O gene rbcL, mesmo que não tenha sido sequenciado por inteiro, apenas a última porção dele, foi suficiente para separar táxons divergentes e agrupar amostras pertencente à mesma entidade taxonômica. É um gene difícil de trabalhar, até que os primers certos sejam ajustados para os organismos em estudo. Mas é um gene que traz bastante confiabilidade para avaliar as relações filogenéticas entre os organismos fotossintetizantes.