Análises do UPA

Para a análise filogenética baseada no UPA, foram geradas 35 sequências (370 pb). Destas sequências, 18 são do presente estudo, 16 do Genbank (sendo a Chondria dangeardii o grupo externo) e 1 sequência gentilmente cedida pela Profa. Dra. Valéria Cassano (IB/USP) que foi utilizada como sequência modelo (Laurenciella intricata). Para a matriz do UPA foram geradas árvores de distância (NJ), máxima parcimônia (MP) e máxima verossimilhança (ML) na qual 35 sítios foram filogeneticamente informativos para parsimônia.

A Figura 14 mostra a árvore consenso da análise de distância com valores de bootstrap para NJ, MP e ML representado nos ramos.

55 Figura 14. Árvore consenso enraizada de Neighbor-joining (NJ) inferida para sequências do UPA de espécimes do complexo Laurencia. Chondria dangeardii foi utilizada como grupo externo. Os valores de bootstrap (2.000 réplicas) referentes às análises de Neighbor-joining (NJ) e de Máxima Parcimônia (MP) e de Máxima Verossimilhança (ML) (100 réplicas) estão expressos nos ramos, nesta ordem. Sequências do Genbank estão indentificadas com os números de acesso entre parênteses. As análises foram realizadas no programa PAUP versão 4.0a146.

UPA

84/63/90

Chondria dangeardii – Hawaii (HQ421169)

LA01 LA02 LA03 LA08 LA06 LA07 LA05 LA04 LA09

Laurencia majuscula – Hawaii (HQ420941) Laurencia majuscula – Hawaii (HQ421514) Laurencia majuscula – Hawaii (HQ421529)

LD01 LD02 LD04 LD03 LD05

Laurencia sp ARS2011 – Hawaii (HQ421537) Laurencia nidifica – Hawaii (HQ420935) Laurencia sp ARS2011 – Hawaii (HQ421168) Laurencia obtusa – Hawaii (KC795895)

Laurencia mcdermidiae – Hawaii (HQ421155) Laurencia sp ARS2011 – Hawaii (HQ420951) Laurencia sp ARS2011 – Hawaii (HQ421088) Laurencia sp ARS2011 – Hawaii (HQ421516)

Palisada yamadana – Hawaii (HQ421478) P. Parvipapillata – Hawaii (HQ421473) Chondrophycus sp ARS2011 – Hawaii (HQ421454)

Chondrophycus undulatus – Hawaii (HQ421531) Laurenciella intricata VCassano

LI03 LI01 LI02 LI04 0.001 substitutições/sítio NJ/MP/ML 55/92/92 99/-/66 97/100/100 97/100/94 64/63/73 53/-/59 60/68/- 63/55/58 67/69/- 59/-/- Lau re n ciella _Chon droph yc u s Palis ada Lau re n cia 84/63/90

56 Essa análise mostrou que o complexo Laurencia é monofilético em relação ao táxon usado como grupo externo. Todos os gêneros tiveram uma separação muito bem definida – Laurencia stricto sensu no topo, seguido por Palisada, Chondrophycus e, o mais novo gênero incluído no complexo – Laurenciella, se mostrou o mais basal da topologia.

As nove amostras de Laurencia aldingensis do presente estudo foram agrupadas num mesmo ramo apresentando suporte alto de bootstrap para a análise de ML, moderado para NJ e MP. A amostra LA01 divergiu das outras em até 4 nucleotídeos (Tabela 1). Isso pode ser a resposta de um sequenciamento menos robusto por esta ser uma amostra mais antiga, o que pode ter comprometido a qualidade da análise nessa região do gene. No entanto, o agrupamento se mostrou muito claro, com separações muito bem definidas das outras espécies. Não existe no banco de dados, sequências de UPA de Laurencia aldingensis e nada verdadeiramente similar foi encontrado.

Tabela 5. Porcentagem de divergência (porção inferior) e número de nucleotídeos divergentes (porção superior) entre as sequências do UPA de espécimes de Laurencia aldingensis obtidos no programa BioEdit versão 3.3.19.0. Sequências 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 LA01 ID 3 4 3 3 3 3 3 3 2 LA02 0,9 ID 1 0 0 0 0 0 0 3 LA03 1,1 0,3 ID 1 1 1 1 1 1 4 LA04 0,9 0 0,3 ID 0 0 0 0 0 5 LA05 0,9 0 0,3 0 ID 0 0 0 0 6 LA06 0,9 0 0,3 0 0 ID 0 0 0 7 LA07 0,9 0 0,3 0 0 0 ID 0 0 8 LA08 0,9 0 0,3 0 0 0 0 ID 0 9 LA09 0,9 0 0,3 0 0 0 0 0 ID

Mais onze táxons relacionados às minhas amostras de Laurencia dendroidea foram inseridos para gerar a árvore de UPA. Estes táxons foram selecionados baseando-se no índice de similaridade obtido através do algotitmo BlastN dentro do site do NCBI.

Um grande ramo com várias sub-ramificações foi gerados nessa árvore, não deixando muito evidente as separações entre os táxons. Mas, mesmo nessas condições, consegue-se verificar o

57 agrupamento da Laurencia mcdermidiae com as amostras de Laurencia sp. do Hawaii e o agrupamento da Laurencia nidica com outra Laurencia sp. do Hawaii (HQ421168) mesmo que com suporte baixo a moderado de bootstrap.

Esses agrupamentos permitiram visualizar um ramo ascendente, no qual estão agrupados as amostras de Laurencia dendroidea em estudo e as amostras de Laurencia majuscula do Hawaii, que já foi comprovado pertencerem ao mesmo táxon juntamente com Laurencia obtusa e

Laurencia filiformis (Cassano et al. 2012). Assim, a amostra de Laurencia obtusa do Hawaii

(KC795895) separada deste ramo faz acreditar que a taxonomia desta ou das outras amostras da parte inferior do clado precisa ser revista pelos autores ou o UPA usado não conseguiu resolver muito claramente espécies filogeneticamente próximas.

As amostras LD em estudo variam entre si com no máximo 3 nucleotídeos (0,9% de divergência) e estas mesmas divergem dos espécimes de Laurencia majuscula com até 4 nucleotídeos (1,1%) como mostra na (Tabela 6).

O ramo de Laurencia dendroidea na árvore de UPA se mostrou confuso. E, se fôssemos fazer uma correlação entre todos os táxons ali presentes, a divergência seria de até 2,5%. O que é muito alto para uma variação intraespecífica de um gene conservado. Por isso acredita-se haver mais de uma espécie presente nesse grupo. No entanto, L. majuscula, juntamente com as amostras de L.

dendroidea do presente estudo LD01-05 e Laurencia sp. (HQ421537), podem pertencer ao mesmo

58 Tabela 6. Porcentagem de divergência (porção inferior) e número de nucleotídeos divergentes (porção superior) entre as sequências do UPA de espécimes de Laurencia dendroidea e táxons relacionados obtidos no programa BioEdit versão 3.3.19.0. Sequências do Genbank apresentam informações do local de coleta e estão identificadas com os números de acesso entre parênteses.

Sequências 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 L. majuscula HI (HQ420941) ID 0 2 7 5 6 6 6 4 6 4 3 1 1 1 2 2 L. majuscula HI (HQ421514) 0 ID 2 7 5 6 6 6 4 6 4 3 1 1 1 2 3 L. majuscula HI (HQ421529) 0,6 0,6 ID 9 7 8 8 8 6 8 6 4 3 3 3 4 4 L. mcdermidiae HI (HQ421155) 1,9 1,9 2,5 ID 6 3 3 3 5 3 9 8 6 6 6 7 5 L. nidifica HI (HQ420935) 1,4 1,4 1,9 1,7 ID 3 5 5 1 5 7 6 4 4 4 5 6 L. obtusa HI (KC795895) 1,7 1,7 2,2 0,9 0,9 ID 2 2 2 2 8 7 5 5 5 6 7 Laurencia sp HI (HQ421088) 1,7 1,7 2,2 0,9 1,4 0,6 ID 2 4 0 8 7 5 5 5 6 8 Laurencia sp HI (HQ420951) 1,7 1,7 2,2 0,9 1,4 0,6 0,6 ID 4 2 8 7 5 5 5 6 9 Laurencia sp HI (HQ421168) 1,1 1,1 1,7 1,4 0,3 0,6 1,1 1,1 ID 4 6 5 3 3 3 4 10 Laurencia sp HI (HQ421516) 1,7 1,7 2,2 0,9 1,4 0,6 0 0,6 1,1 ID 8 7 5 5 5 6 11 Laurencia sp HI (HQ421537) 1,1 1,1 1,7 2,5 1,9 2,2 2,2 2,2 1,7 2,2 ID 6 4 4 4 5 12 LD01 0,9 0,9 1,1 2,2 1,7 1,9 1,9 1,9 1,4 1,9 1,7 ID 2 2 2 3 13 LD02 0,3 0,3 0,9 1,7 1,1 1,4 1,4 1,4 0,9 1,4 1,1 0,6 ID 0 0 1 14 LD03 0,3 0,3 0,9 1,7 1,1 1,4 1,4 1,4 0,9 1,4 1,1 0,6 0 ID 0 1 15 LD04 0,3 0,3 0,9 1,7 1,1 1,4 1,4 1,4 0,9 1,4 1,1 0,6 0 0 ID 1 16 LD05 0,6 0,6 1,1 1,9 1,4 1,7 1,7 1,7 1,1 1,7 1,4 0,9 0,3 0,3 0,3 ID

As amostras de Laurenciella desse trabalho foram agrupadas num mesmo ramo apresentando suporte alto de bootstrap para MP e ML (92%) e baixo para NJ (55%). Isso se deve ao fato da amostra LI04 ter tido 1 nucleotídeo divergente e 4 nucleotídeos ambíguos no cromatograma (entre 90 e 250 pb), que também foram computados pelo programa no percentual de divergência (1,4%). No entanto, todas as outras amostras, incluindo a sequência cedida pela Prof. Dra. Valéria Cassano, apresentaram 100% de identidade e nenhum nucleotídeo divergente (Tabela 7).

59 Tabela 7. Porcentagem de divergência (porção inferior) e número de nucleotídeos divergentes (porção superior) entre as sequências do UPA de espécimes de Laurenciella sp. obtidos no programa BioEdit versão 3.3.19.0. Sequências 1 2 3 4 5 1 Laurenciella intricataRJ_Vcassano ID 0 0 0 5 2 LI01 0 ID 0 0 5 3 LI02 0 0 ID 0 5 4 LI03 0 0 0 ID 5 5 LI04 1,4 1,4 1,4 1,4 ID

Apesar da amostra LI04 não ter tido um sequenciamento tão bom quanto as outras amostras, isso não foi um impeditivo para demonstrar que todas são pertencentes à mesma espécie. O que também foi sustentado pelas análises dos outros marcadores.

O UPA, apresenta vantagens por ser um marcador pequeno, que pode ser sequenciado com apenas um par de primers. No presente estudo, apesar de ter conseguido separar muito bem os gêneros, não conseguiu fazer delimitações muito claras entre as espécies do gênero Laurencia. Essa baixa resolução para delimitar espécies próximas já foi reportada por outros autores (Clarkston e Saunders 2010, Sherwood et al. 2010, Costa et al. 2012, Milstein et al. 2012, Soares, 2015) e agora também no presente estudo.