Grupo III: parâmetros pós-fixação 1 Parâmetros de armazenamento
3. MATERIAIS E MÉTODO:
3.6. Análise do DNA extraído
Para a visualização dos amplicons gerados pelos primers descritos, as amostras foram analisadas por eletroforese em gel de agarose a 1%, corado com Gel RedTM (Biotium®). Após, o gel de agarose foi fotografado sobre luz ultra-violeta no equipamento Edas KODAK.
Componentes Volume
H2O 6,5 µl
Primer β-actina F (300nM) 1,25 µl
Primer β-actina R (300nM) 1,25 µl
Top Taq Master Mix (Qiagen®) 12 µl
DNA (10ng/µl) 2 µl
4. RESULTADOS:
As fotomicrografias a seguir apresentam a condição de normalidade das amostras incluídas em parafina de um caso recente (coletado em 2009 – N09-35):
Fig.4. Fotomicrografia de amostra de baço recente incluída em parafina. 100x.
Fig.6. Fotomicrografia de amostra de cérebro recente incluída em parafina. 100x
As tabelas 2, 3 e 4 a seguir apresentam os resultados das concentrações de DNA em ng/µl/cm² (média ± dp), obtidas das amostras de baço, fígado e cérebro, respectivamente (n= 10). Cada uma das tabelas apresenta os resultados obtidos pelos 3 métodos de extração: fenol- clorofórmio, kit comercial (QIAGEN® QIAamp Mini) e Salting-Out. Após a extração e quantificação, realizou-se a reação de PCR para o gene da β- actina (136pb) e amelogenina (212-206pb) nos 3 métodos. O sucesso da amplificação está expresso em porcentagem do total de amostras.
De acordo com os resultados obtidos, houve 100% de taxa de amplificação nas amostras congeladas, utilizadas neste estudo como controle. Houve maior taxa de amplificação pelo gene da β-actina em amostras recentes parafinas, se comparada com as amostras arquivadas por 1 e 5 anos. Nos três tipos de tecido, todas as amostras selecionadas para reação de PCR pelo gene da amelogenina foram amplificadas.
Foram estudados um total de 450 amostras e realizadas 615 reações de PCR.
Em todas as amostras extraídas com fenol-clorofórmio, recuperou-se uma maior quantidade de DNA em todos os tempos, se comparado com os outros tipos de extração.
Tabela 2. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de amplificação (expresso em porcentagem) para o gene da β-actina e amelogenina em amostras de baço congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e amostras de baço armazenadas por 1 ano e 5 anos (n= 10 cada).
Tabela 2. Análise de baço Congeladas Recentes 1 ano 5 anos
Parafinadas Fenol 523,5 ± 88,8 323,9 ± 135,6 1009,5 ± 526,6 312,5 ± 141,7 Kit 117,4 ± 50,7 21,2 ± 18,8 14,9 ± 8,3 34,4 ± 19,7 Salting-Out 80,5 ± 52,5 21,2 ± 20,1 10,5 ± 6 19,2 ± 24,1 β-actina (+) Fenol 100% 100% 60% 50% β-actina (+) Kit 100% 100% 50% 50% β-actina (+) Salting-Out 100% 100% 100% 100% Amelogenina (+) Fenol 100% - 0% - Amelogenina (+) Kit 100% 100% 0% - Amelogenina (+) Salting-Out 100% - - -
Tabela 3. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de amplificação (expresso em porcentagem) para o gene da β-actina e amelogenina em amostras de fígado congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e amostras de fígado armazenadas por 1 ano e 5 anos (n= 10 cada).
Tabela 3. Análise de fígado Congeladas Recentes 1 ano 5 anos Parafinadas Fenol 1522,7 ± 693,7 313,2 ± 152,4 1045,6 ± 572,4 274,4 ± 127,8 Kit 80,7 ± 61,8 27,5 ± 15,8 14 ± 10,2 24,3 ± 21,8 Salting-Out 70,5 ± 50,2 11,7 ± 7,1 16,2 ± 11,8 7,6 ± 4,2 β-actina (+) Fenol 100% 90% 70% 40% β-actina (+) Kit 100% 100% 60% 60% β-actina (+) Salting-Out 100% 100% 70% 100% Amelogenina (+) Fenol 100% - 0% - Amelogenina (+) Kit 100% 100% 0% - Amelogenina (+) Salting-Out 100% - - -
Tabela 4. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de amplificação (expresso em porcentagem) para o gene da B-actina e amelogenina em amostras de cérebro congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e amostras de cérebro armazenadas por 1 ano e 5 anos (n= 10 cada).
Tabela 4. Análise de cérebro Congeladas Recentes 1 ano 5 anos Parafinadas Fenol 524,8 ± 205,9 182,6 ± 125,7 335,2 ± 115,4 157 ± 69,3 Kit 10,3 ± 3,9 11 ± 7 7,2 ± 4,3 14,5 ± 8,3 Salting-Out 148,6 ± 89,6 6,3 ± 3,1 6,5 ± 4,4 7,9 ± 6,3 β-actina (+) Fenol 100% 70% 70% 50% β-actina (+) Kit 100% 100% 20% 40% β-actina (+) Salting-Out 100% 100% 80% 100% Amelogenina (+) Fenol 100% - 0% - Amelogenina (+) Kit 100% 100% 0% - Amelogenina (+) Salting-Out 100% - - -
Os gráficos a seguir apresentam as comparações entre os métodos de extração (kit comercial, fenol-clorofórmio e Salting-Out) em relação ao grau de pureza do DNA extraído em amostras de fígado, baço e cérebro congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas), armazenadas por 1 ano e por 5 anos.
Nota-se que, em todas as amostras extraídas pelo método Salting-Out, há um menor grau de pureza e heterogeneidade entre os tempos, se comparado com os outros métodos. A extração pelo kit comercial rendeu maior grau de pureza, porém na extração com fenol-clorofórmio, houve maior homogeneidade entre os tempos.
Gráfico 1. Grau de pureza (A260/A280) do DNA extraído de amostras de baço coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e arquivadas por 1 ano e 5 anos, nos diferentes métodos de extração.
Gráfico 2. Grau de pureza (A260/A280) do DNA extraído de amostras de fígado coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e arquivadas por 1 ano e 5 anos, nos diferentes méto dos de extração.
DNA extraído de amostras de baço
0 0,5 1 1,5 2 2,5 1 ano 5 anos 2009 parafinadas Congeladas
Kit Comercial Fenol Salting-out
G ra u d e p u re za ( A 26 0/ A 28 0)
DNA extraído de amostras de fígado
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 G ra u d e p u re za ( A 26 0/ A 2 80 ) 1 ano 5 anos 2009 parafinadas Congeladas
Kit Comercial Fenol Salting-out DNA extraído de amostras de fígado
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 G ra u d e p u re za ( A 26 0/ A 2 80 ) 1 ano 5 anos 2009 parafinadas Congeladas
Gráfico 3. Grau de pureza (A260/A280) do DNA extraído de amostras de cérebro coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e arquivadas por 1 ano e 5 anos, nos diferentes métodos de extração.
As figuras a seguir apresentam a amplificação dos produtos de PCR das amostras, com os genes da β-actina e amelogenina em gel de agarose 1% corada com GelRed®. Cada número e letra identificados no gel representam um indivíduo e seu respectivo órgão, ou seja, 12, 13, 20, etc significa o código do indivíduo e as letras “B”, “C” e “F” significam “baço”, “cérebro” e “fígado” respectivamente. As letras “T” e “N” significam “formalina tamponada” e “formalina não-tamponada”, respectivamente. Em cada gel foram utilizados um controle negativo (água MilliQ), um controle positivo (K562® Promega) e um padrão de peso molecular (pGem® Promega).
Como pudemos observar, as fotografias dos géis mostram a maioria das amostras amplificadas pelos genes estudados. De acordo com nossos resultados, as amostras recentes apresentam uma intensidade de banda maior quando comparada às amostras armazenadas por 1 e 5 anos.
A amplificação dos produtos de PCR pelo método Salting-Out apresentou maior taxa de amplificação, porém há a presença de “fundo manchado” em todos os géis realizados.
DNA extraído de amostras de cérebro
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1 1 ano 5 anos 2009 parafinadas congeladas
Kit Comercial Fenol Salting-out
G ra u d e p u re za A 26 0/ A 28 0
Fig. 7. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras de fígado, baço e cérebro recentes parafinadas, extraídas pelo método fenol- clorofórmio (B = baço, F = fígado, C = cérebro, T = formalina tamponada, NT = formalina não tamponada, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo - K562 e pGem = padrão de peso molecular).
Fig. 8. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras de fígado, baço e cérebro recentes parafinadas, extraídas pelo método de kit comercial (B = baço, F = fígado, C = cérebro, T = formalina tamponada, NT = formalina não tamponada, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo - K562 e pGem = padrão de peso molecular).
pGem 33BT 33BN 33CN 33CT 33FT 33FN 33BT 35BN Neg Pos pGem
pGem 35CT 35CN 35FT 35FN 34CT 34CN Neg Pos pGem
222 179 126
136pb 136pb
pGem 33CN 35BT 34CN 34CT 35FT 33BT 33FN 35CT Neg Pos pGem
pGem 35FN 35CN 33CT 35BT 33BN 33FT Neg Pos pGem
136pb 222 179 126 222 179 126
Fig. 9. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras de fígado, baço e cérebro recentes parafinadas, extraídas pelo método de Salting-out. (B = baço, F = fígado, C = cérebro, T = formalina tamponada, NT = formalina não tamponada, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo - K562 e pGem = padrão de peso molecular).
Fig. 10. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 1 ano, extraídas pelo método de fenol-clorofórmio (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo - K562 e pGem= padrão de peso molecular).
pGem 33FT 33FN 33BT 33BN 35FT 35FN 35BT 35BN pGem
pGem 36BT 36BN 36FT 36FN 34CT 37BT 37BN Neg Pos pGem
pGem18F 18B 18C 19F 19B 19C 24F 24B 24C 25F 25B 25C Neg PospGem
136 pb
pGem18F 18B 18C 19F 19B 19C 24F 24B 24C 25F 25B 25C Neg PospGem
136 pb 136 pb 136pb 222 179 126
Fig. 11. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 1 ano, extraídas pelo método de kit comercial (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo - K562 e pGem = padrão de peso molecular).
Fig. 12. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 1 ano, extraídas pelo método de
Salting-Out (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo - água, Pos =
controle positivo - K562 e pGem= padrão de peso molecular). 136pb
222 179 126
18F 18B 18C 19F 19B 19C 24C 24F 24B 25F neg 25C pospGem
222 179 126 136pb
pGem 17B 17F 19B 19F 19C 16B 18B 24C 24F 24BpGem
pGem25F 25C 25B 26B 27C 13C 18C 20Cneg pos pGem
222 179 126 136pb
pGem 17B 17F 19B 19F 19C 16B 18B 24C 24F 24BpGem
pGem25F 25C 25B 26B 27C 13C 18C 20Cneg pos pGem
222 179 126 222 179 126 136pb 136pb pGem 17B 17F 19B 19F 19C 16B 18B 24C 24F 24BpGem
Fig. 13. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 5 anos, extraídas pelo método de fenol-clorofórmio (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo - K562 e pGem= padrão de peso molecular).
Fig. 14. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 5 anos, extraídas pelo método kit comercial (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo - água, Pos= controle positivo - K562 e pGem= padrão de peso molecular).
pGem 2C 3C 4C 5C 6C 7B 9F 9B 10C 5C pGem
pGem 5F 11C 4F 12F 4B 13F neg neg pos pGem
222 179 126 136pb
pGem 2C 3C 4C 5C 6C 7B 9F 9B 10C 5C pGem
pGem 5F 11C 4F 12F 4B 13F neg neg pos pGem
222 179 126 136pb
pGem 2C 3C 4C 5C 6C 7B 9F 9B 10C 11C 12F 4B 7C 13F 14F 15F pos neg pGem
136pb
pGem 2C 3C 4C 5C 6C 7B 9F 9B 10C 11C 12F 4B 7C 13F 14F 15F pos neg pGem pGem 2C 3C 4C 5C 6C 7B 9F 9B 10C 11C 12F 4B 7C 13F 14F 15F pos neg pGem
.
Fig. 15. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 5 anos, extraídas pelo método
Salting-Out (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo - água, Pos =
controle positivo - K562 e pGem= padrão de peso molecular).
As figuras a seguir apresentam as amplificações dos produtos de PCR do gene da amelogenina do DNA extraído pelo método de fenol-clorofórmio e kit comercial.
Podemos observar que, nas amostras extraídas com fenol-clorofórmio, não houve amplificação do gene da amelogenina. Por outro lado, nas amostras extraídas com kit comercial, houve amplificação do gene e, portanto, a identificação sexual do indivíduo.
pGem 1B 2B 2C 3F 3C 4B 4F 4C pGem
pGem 5B 5F 5C 6B 6F 6C neg pos pGem
136pb
222 179 126
pGem 1B 2B 2C 3F 3C 4B 4F 4C pGem
pGem 5B 5F 5C 6B 6F 6C neg pos pGem
136pb
222 179 126
Fig. 16. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da amelogenina em amostras de fígado, baço e cérebro recentes parafinadas, extraídas pelo método fenol- clorofórmio (B = baço, F = fígado, C = cérebro, T = formalina tamponada, NT = formalina não tamponada, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo - K562, pGem = padrão de peso molecular e XY = padrão da amelogenina).
Fig. 17. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da amelogenina em amostras de fígado, baço e cérebro recentes parafinadas, extraídas pelo método kit comercial (B= baço, F = fígado, T = formalina tamponada, NT = formalina não tamponada, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo - K562, pGem = padrão de peso molecular e XY = padrão da amelogenina).
pGem XY 30CT 30CN 30BT 30BN 30FT 30FN neg pos XY pGem
218
222 179 126
pGem XY 30CT 30CN 30BT 30BN 30FT 30FN neg pos XY pGem
218
222 179 126
212
pGem 30BT 30BN 30FT 30FN neg pos pGem
212pb
pGem 30BT 30BN 30FT 30FN neg pos pGem
Análise do processo de fixação e inclusão:
As tabelas a seguir apresentam a concentração do DNA extraído (ng/µl) em amostras somente fixadas pela formalina (Tabela 5) e em amostras processadas pelos banhos de xilol e etanol (Tabela 6).
Podemos observar que as amostras de baço apresentaram maior rendimento de DNA extraído em relação às amostras de cérebro. Entretanto, não houve diferença na quantidade de DNA entre as etapas.
Tab. 5. Concentração do DNA extraído das amostras de baço e cérebro fixadas em formalina tamponada e não-tamponada por 24h.
Tipo de Concentração
Amostra Inicial (ng/ul)
baço tamponado I 52,36
baço tamponado II 37,34
baço tamponado III 40,11
baço não tamponado I 50,73
baço não tamponado II 56,47
baço não tamponado III 45,45
cérebro tamponado I 4,64
cérebro tamponado II 4,01
cérebro tamponado III 5,99
cérebro não tamponado I 6
cérebro não tamponado II 7,04
Tab. 6. Concentração do DNA extraído das amostras de baço e cérebro fixadas em formalina tamponada e não-tamponada por 7 dias e processadas nos banhos de xilol e etanol.
Tipo de Concentração
Amostra Inicial (ng/ul)
baço tamponado I 31,54
baço tamponado II 38,5
baço não tamponado I 28,85
baço não tamponado II 32,16
cérebro tamponado I 12,11
cérebro tamponado II 12,35
cérebro não tamponado I 14,14
cérebro não tamponado II 14,18
As figuras a seguir apresentam a amplificação dos produtos de PCR pelo gene da amelogenina em amostras somente fixadas (Figura 18) e em amostras processadas pelos banhos de etanol e xilol (Figura 19).
De acordo com os nossos resultados, houve identificação sexual do indivíduo (sexo masculino, apresentando duas bandas) nas amostras de baço que foram somente fixadas. Entretanto, nas amostras processadas pelos banhos, houve amplificação do gene, porém não houve a diferenciação das bandas (X e Y).
Fig. 18. Amplificação dos produtos de PCR da amelogenina em amostras de baço (B) e cérebro (C) fixadas em formalina tamponada (T) e não tamponada (N) e DNA extraído após 24h de fixação (pGem = padrão de peso molecular, Neg = controle negativo - água e Pos = controle positivo, K562).
Fig. 19. Amplificação dos produtos de PCR da amelogenina em amostras de baço (B) e cérebro (C) fixadas em formalina tamponada (T) e não tamponada (N) por 7 dias e processadas no banhos de xilol e etanol. (L) Ladder amelogenina (pGem = padrão de peso molecular, Neg = controle negativo - água e Pos = controle positivo, K562).
pGem BT BT BT BN BN BN CT CT CT CN CN CN Neg Pos pGem
216pb
212pb 222 179
126
pGem BT BT BN BN FT FT FN FN Neg Pos pGem
pGem L CT CT CN CN Neg Pos L pGem
216pb 212pb
5. DISCUSSÃO
Os dados obtidos neste estudo (tabela 2 e anexo 1) demonstram que as amostras de baço apresentaram uma maior concentração de DNA extraído, seguido pelas amostras de fígado e cérebro, respectivamente. Isso se deve ao fato do baço e o fígado possuírem maior celularidade e tipo de arquitetura celular diferenciado nestes tecidos (conforme figuras 4 e 5). O cérebro é composto por células da glia, que apresentam estrutura alongada, ocupam mais espaço no tecido e, apresentam menor quantidade de núcleos (conforme figura 6). Assim como afirma Carturan et al (2008) , cada tipo de tecido rende uma quantidade de DNA específica, mas esta quantidade também está associada ao método de extração e fixação da amostra. Dos três métodos testados, o fenol apresentou maior rendimento, seguido pelo kit e pelo Salting- out. Portanto, as amostras de cérebro extraídas pelo método Salting-out foi o que apresentou os menores índices de DNA extraído.
A ação do tempo de armazenamento das amostras foi analisado pela observação dos produtos de amplificação pela PCR do gene da β-actina humana. Foi observado, em gel de agarose 1%,que as amostras armazenadas por 1 ano e 5 anos apresentaram intensidade de banda menor (conforme figuras 10-15) quando comparadas com as amostras congeladas e as recentes parafinadas (conforme figuras 7-9), pelos três métodos de extração. Quanto ao rendimento e ao grau de pureza do material obtido, não houve diferença (conforme gráficos 1, 2 e 3) entre os tempos. Desta maneira, podemos obter quantidade suficiente de DNA para determinada análise, porém a qualidade pode estar comprometida se utilizarmos amostras parafinadas armazenadas por mais de 1 ano.
Diversos protocolos de extração têm sido descritos (Greer et al 1991, Gall et al 1993, Bonin et al 2003, Bonin et al 2005, O´Learly et al 1994, Sato et al 2001, De Lamballerie et al 1994, Diaz-Cano et al 1997, Bielawski et al 2001, Chan et al 2001, Andreassen et al 2004, Coombs et al 1999, Duval et al 2010) a fim de obter DNA de qualidade a partir destas amostras arquivadas. As variações dos protocolos podem focar em diferentes etapas do processamento, como a desparafinização, tempo e quantidade da digestão com proteinase K, purificação pós extração e amplificação pela PCR. O tempo de armazenamento
do bloco, a temperatura e a umidade do ambiente onde o bloco está armazenado podem influenciar na qualidade do DNA. De acordo com vários autores (Greer et al 1991, Bonin et al 2003, Baloglu et al 2008 ) a etapa mais crítica para a integridade do DNA é a fixação em formalina. Entretanto, no nosso estudo e no de Gillio-Tos et al (2007) o processo de inclusão em parafina tem também uma importante ação na obtenção de DNA amplificável (conforme demonstrado no estudo de avaliação da qualidade do DNA durante processo histológico, pág 42-44).
O método convencional utilizado para a purificação do DNA é a técnica do fenol-clorofórmio, que se baseia na diferença de solubilidade dos ácidos nucléicos, proteínas e lipídios. A vantagem deste método é que uma maior quantidade de DNA pode ser obtida, entretanto o procedimento é laborioso, devido ao número de centrifugações necessárias, manuseio dos reagentes e toxicidade dos mesmos. Já no método de extração com kit comercial, uma menor quantidade de DNA é obtida, porém há uma melhor qualidade da amostra em relação à amplificação. Essa diferença pode ser observada nas figuras 7 e 8, onde há nitidamente uma amplificação da PCR no kit comercial em relação à β-actina.
Esses resultados confirmam o estudo de Gilbert et al 2007, onde houve um maior número de DNA amplificável pela PCR através do kit do que usando a extração com fenol-clorofórmio. De acordo com o trabalho, supõe-se que os reagentes do kit possuem propriedades que revertem a ligação entre proteínas do tecido. Por outro lado, entende-se em nosso estudo e pelo principio da extração pela sílica que ocorre uma retenção de um DNA com melhor potencial de amplificação, mesmo em quantidades menores, liberando aqueles que estejam com as ligações cruzadas.
O DNA extraído através do kit comercial mostrou melhores resultados na amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina e amelogenina, (figuras 8, 11, 14 e nas figuras 16 e 17 em relação à amelogenina), mesmo havendo diferença quanto ao grau de pureza em relação aos outros métodos de extração. Desta maneira, pode-se afirmar que, apesar de se obter menor quantidade de DNA e purificação não tão eficiente quanto a extração com fenol, neste método há uma melhor qualidade em relação à amplificação, comparando-se aos outros tipos de extração.
Em amostras com o DNA extraído pelo método Salting-out, o grau de pureza apresentou resultados muito variados (conforme gráficos 1, 2 e 3). Surpreeendentemente, houve amplificação do gene da β-actina em 100% (conforme figuras 9, 12 e 15), porém não houve definição exata de intensidade de banda se comparado com o DNA extraído por fenol-clorofórmio e kit comercial (conforme figuras 7, 8, 10, 11, 13 e 15). Esse resultado pode ser justificado pelo processo de extração em si, em que não há etapas de purificação da amostra e, portanto, fragmentos inespecíficos podem persistir durante a reação de PCR. De acordo com Rivero et al 2006, utilizando tecido de carcinoma oral e tecido inflamatório oral fixadas em formalina 10% tamponada e os blocos armazenados por até 5 anos foi possível obter DNA de boa qualidade neste tipo de extração, tanto quanto no método orgânico e de sílica.
De acordo com os resultados apresentados, a extração de DNA pelo fenol-clorofórmio apresentou maior quantidade de ácidos nucleicos e maior grau de pureza. No entanto, trata-se de um método extremamente tóxico e laborioso, e com custo similar de um kit comercial.
A extração de DNA pelo kit comercial apresentou uma menor quantidade de ácidos nucleicos e grau de pureza, quando comparado ao método de fenol. Apesar de ter o mesmo custo que a extração com fenol-clorofórmio, pudemos obter melhor amplificação de produtos de PCR.
O método de Salting-Out apresentou quantidades de DNA variáveis e graus de pureza heterogêneos e baixos, porém houve amplificação dos produtos de PCR em todas as amostras. Trata-se de um método menos laborioso e com baixo custo, se comparado aos outros métodos estudados.
O laboratório de anatomia patológica do Departamento de Patologia recebe um grande número de biopsias e representa um importante centro de diagnósticos, responsável por 33.000 exames anuais (www.unifesp.br/dpato). Para os exames com finalidade diagnóstica, principalmente os de necropsia, não há a urgência de um centro cirúrgico. Nossas amostras provenientes dessas necropsias não apresentam um padrão de processamento histológico em relação ao tempo de fixação, o que poderia justificar nossos resultados. Em nosso estudo, a forma de processamento em parafina das amostras pode interferir nos resultados.
Em relação à condição do fixador, não há diferenças quanto à qualidade e quantidade de DNA em amostras recentes fixadas em formalina 10% tamponada e não-tamponada (conforme figuras 7-9), mesmo com a diferença de pH entre as soluções (formalina tamponada com pH 7.0 e formalina não- tamponada com pH 4.0).
Quanto à amplificação dos produtos de PCR, houve amplificação dos produtos de PCR pelo gene da amelogenina em todas as amostras utilizadas (conforme figura 17). Entretanto, nas amostras extraídas com fenol-clorofórmio, não houve amplificação (conforme figura 16). Os resultados obtidos sugerem que há uma “amarração” do DNA e ligações cruzadas entre proteínas durante o processo de fixação e inclusão em parafina, causando maior dificuldade no processo de amplificação do DNA. Diversos estudos apontam esse mesmo tipo de problema, onde a análise das amostras pela PCR é somente realizada em sequências curtas de DNA, raramente excedendo 300pb (Liu et al 1993, Pavelic et al 1996, Bonin et al 2005, Shi et al 2004, Rivero et al 2006, Ferrer et al 2007, Baloglu et al 2008, Coombs et al 1999).
O processo de fixação em formalina e a inclusão em parafina pode comprometer a qualidade do DNA, como mostra as figuras 18 e 19. Nas amostras que foram apenas fixadas e em seguida submetidas à extração,