EXTRAÇÃO DE DNA

Com base nas características estruturais dos ácidos nucléicos, algumas técnicas moleculares são utilizadas na manipulação do DNA dos organismos. A hibridização é a técnica que se baseia na complementaridade entre as fitas de DNA. Um fragmento de DNA marcado por uma substância radioativa é usado como sonda para determinar a presença da fita complementar em uma amostra específica. Essa técnica foi muito utilizada em testes de diagnóstico, porém, atualmente em conseqüência de sua baixa sensibilidade e de problemas advindos do uso de radioatividade, ela caiu em desuso (Oliveira et al 2007).

A clivagem é outra técnica que pode facilitar a manipulação do DNA. Para esse fim, existem as chamadas enzimas de restrição, que são capazes de cortar o DNA em sítios específicos, definidos geralmente pela seqüência de bases distribuídas ao longo da molécula, produzindo fragmentos de comprimento menor. As enzimas de restrição são sintetizadas naturalmente por muitas bactérias e centenas (com especificidade para diferentes sítios de restrição) estão disponíveis comercialmente. Outros tipos de manipulação de DNA incluem a amplificação (utilizando a técnica de PCR) e a eletroforese (Oliveira et al 2007)

Para o isolamento e purificação dos ácidos nucleicos, encontram-se disponíveis várias técnicas alternativas as quais originam DNA ou RNA com diferentes graus de pureza e de integridade física. Na maioria dos casos, estas técnicas iniciam-se com o processo de liberação dos ácidos nucleicos, o que envolve a lise das células a estudar, seguida de ataques enzimáticos e/ou químicos para destruir os componentes proteicos da mistura. Já no que diz respeito ao processo de purificação dos ácidos, várias alternativas se

encontram disponíveis (Rivero et al 2006, Baloglu et al 2008, Greer et al 1991, Gräntzdörffer et al 2009 e Duval et al 2010).

O processo de purificação mais económico e simples é denominado de Salting-Out e consiste na insolubilização dos longos filamentos de DNA por ação da concentração salina da solução. Neste método, o DNA obtido é de baixa pureza, sendo recolhido por suave enrolamento com uma vareta de vidro após adição de um sal. O DNA assim preparado necessita depois de ser submetido a um longo processo de ressolubilização, após o que se encontra pronto para ser estudado. Note-se que apesar do baixo custo envolvido, este é um processo muito ineficiente devido á baixa pureza do DNA obtido, ao elevado teor de mão de obra necessário, e ao longo tempo de preparação que envolve (Rivero et al 2006).

O processo tradicional de extração de DNA de elevada pureza e integridade física é denominado de fenol-clorofórmio. Este processo deve o seu nome ao fato de envolver o ataque químico de proteínas e outros compostos celulares por ação do fenol dissolvido em clorofórmio. Esta mistura contém ainda habitualmente d-hidroxiquinelona como corante (facultativo) e álcool isoamílico como regulador da densidade. Neste processo, após a libertação dos ácidos nucleicos, a solução aquosa é misturada com igual volume de solução de fenol/clorofórmio, e após homogeneização suave, é centrifugada. Como as soluções aquosas (contendo o DNA) e orgânicas (contendo o fenol) são imiscíveis, após a centrifugação podemos facilmente recolher a fase aquosa (no topo do tubo) e rejeitar a fase orgânica (no fundo do tubo) e a interfase contendo um anel esbranquiçado de proteínas e precipitados. A remoção da fase aquosa deve ser executada com muito cuidado, para que a alta viscosidade não acarrete o arrastamento de interfase proteica. O processo repete-se ciclicamente até não ser observável a presença de interfase protéica (Barcelos et al 2008, Oliveira et al 2007).

No final, a precipitação do DNA é feita por meio da utilização de etanol absoluto associado a uma solução com alta concentração de um sal catiônico. O etanol induz a transição estrutural nas moléculas de ácido, fazendo-as se agregarem, com conseqüente precipitação. A precipitação com etanol absoluto, além de concentrar o DNA, ajuda a remover resíduos de fenol e de clorofórmio presentes na amostra. O etanol a 70% é utilizado para remover

resíduos de sais. Embora tanto o cloreto de sódio como o acetato de sódio e o acetato de amônio sejam eficazes na precipitação do DNA, é mais difícil remover o cloreto de sódio, em razão da sua menor solubilidade (Barcelos et al 2008).

Este processo, apesar de permitir obter DNA de elevada pureza, concentração e integridade fisica, tem como o Salting-Out a desvantagem de ser exigente do ponto de vista da mão-de-obra e do tempo de execução, envolvendo ainda a manipulação de compostos tóxicos como o fenol e o clorofórmio (Oliveira et al 2007).

A solubilidade das proteínas depende, além de outros fatores, da concentração de sal na solução. Em baixas concentrações, a presença de sais estabiliza vários grupos de uma molécula de proteína, atraindo a mesma dentro da solução e reforçando a solubilidade. Este método é comumente conhecido como Salting-In. Entretanto, como a concentração de sal vai aumentando, o ponto de solubilidade máximo da proteína é alcançado. O aumento da concentração de sal implica na menor disponibilidade de água para solubilizar as proteínas. Desta maneira, a proteína começa a precipitar quando não há moléculas de água suficientes para interagir com as moléculas de proteínas. Este fenômeno de precipitação na presença de excesso de sal é conhecido como Salting-Out (Jakoby 1971).

Diversos tipos de sais têm sido empregados para a separação e purificação de proteínas através do Salting-Out. O mais amplamente utilizado é o sulfato de amônio, pois possui alta solubilidade e baixo custo (Jakoby 1971).

A grande revolução nos processos de purificação de ácidos nucleicos foi a descoberta em meados dos anos 80 de que certas formulações de sílica possuíam a capacidade de adsorver os ácidos nucleicos, de modo dependente do pH e da concentração salina. A formulação da matriz de sílica variou desde suspensões a colunas de centrifugação, colunas ou matrizes de colunas de vácuo, sistemas de filtração e até partículas magnéticas revestidas a sílica. Em todos os casos, o processo melhorou muito em termos de rapidez, automatibilidade, reprodutibilidade, utilização de mão de obra, rendimento e até custo (Oliveira et al 2007 e Okello et al 2010).

1.6 ELETROFORESE

A eletroforese é um método simples e muito eficiente para separar, identificar e para purificar fragmentos de DNA e de proteínas. Este método consiste na separação de moléculas ionizadas (aminoácidos, peptídeos, proteínas - incluindo lipoproteínas e glicoproteínas, nucleotídeos, ácidos carboxílicos e outras substâncias de relevância biológica), de acordo com sua carga elétrica e seu peso molecular. Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (ânodo) e moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo (cátodo) (Sambrok et al 2001).

Para haver migração, é preciso desequilibrar eletricamente duas regiões extremas de um meio que contenha eletrólitos, no qual esteja dissolvida ou dispersa uma substância com potencial para migrar. Para tanto, é estabelecida a diferença de potencial entre dois eletrodos ligados aos terminais de uma fonte de corrente contínua e dispostos em dois compartimentos, catódico e anódico; ambos os compartimentos contém, em geral, uma solução-tampão. O meio físico de separação, igualmente tamponado, se comunica através de suas extremidades com as soluções- tampão dos eletrodos, fechando assim o circuito elétrico. A corrente elétrica, ao passar pelo meio, conduzida pelos pequenos íons presentes na solução, dá ensejo ao deslocamento, por exemplo, de partículas protéicas carregadas para determinado pólo (Oliveira et al 2007).

Pelo fato das proteínas serem substâncias anfóteras, ou seja, capazes de adquirirem carga positiva ou negativa de acordo com o pH, é indispensável manter constante o pH do meio durante a eletroforese, por meio do uso de soluções-tampão (Oliveira et al 2007).

Os ácidos nucléicos, por possuírem carga total negativa (em decorrência do grupamento fosfato), migram sempre em direção ao pólo positivo (ânodo). O sistema tampão usado consiste em duas partes: o tampão usado na preparação do gel e o tampão da cuba eletrolítica, na qual se encontram os eletrodos (ânodo e cátodo). Nos tampões das cubas e do gel, a corrente elétrica é conduzida por íons, e nos eletrodos, por elétrons. Na presença de um sistema tampão adequado, a hidrólise da água, que se dá na superfície dos eletrodos, permite a troca entre elétrons e íons. O sistema

tampão pode ser contínuo (o mesmo tampão é utilizado no gel e nos eletrodos) ou descontínuo (quando diferentes composições ou concentrações de tampão são utilizadas no gel e nos eletrodos) (Sambrok et al 2001).

O principal fator a ser considerado na escolha do tampão é a sua capacidade de tamponamento. Os dois tampões mais usados na separação eletroforética de moléculas de DNA são TAE (tampão tris-acetato-EDTA) e TBE (tampão tris-boratoEDTA). Esses dois tampões possuem efeito ligeiramente diferente na mobilidade do DNA. Apesar de o TAE ser mais utilizado, ele é mais facilmente exaurido durante reações longas ou com alta voltagem. O TBE tem melhor capacidade tamponante, mas deve ser evitado para purificação de DNA de géis. (Sambrok et al 2001).

A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de densidade ou em diferentes meios de suporte, tais como papel-filtro, sílica-gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida. O suporte deve ser química e fisicamente inerte, de modo a não interferir na mobilidade das moléculas e, em relação aos géis de agarose ou à poliacrilamida, a porosidade do gel determina o poder de resolução das bandas e este geralmente é decorrente do grau de polimerização entre os monômeros (Oliveira et al 2007).

Diante da problemática exposta, é importante conhecer e analisar cada etapa deste tipo de estudo, desde o armazenamento e processo de amostras parafinadas até a análise molecular. Em nosso estudo, pretendeu-se avaliar a qualidade do DNA por diferentes métodos de extração e analisar todo o processo histológico em amostras parafinadas. Além disso, com o intuito de avaliar a integridade do DNA, o gene da amelogenina foi utilizado na diferenciação do sexo.

2. OBJETIVOS:

Avaliar a influência da fixação e do tempo de armazenamento na integridade do DNA da amelogenina extraída de tecidos humanos incluídos em parafina.