Capítulo III. Resultados e Discussão
3.4. Análise do soro de queijo em condições otimizadas: com aquecimento
10h
De acordo com os estudos realizados por Veloso128,129, a condição de pré-tratamento ótima consiste no pré-aquecimento da amostra a 80ºC durante 1h, seguida do acerto do pH, a pH=7,codição de pré-tratamento (iv). No caso da reticulação enzimática das proteínas do soro de queijo pela TG, deve ser feita na presença de 100U de TG/g de proteína, durante 10h numa estufa a 50ºC.
3.4.1. Análise segundo a espectroscopia de Infravermelhos por
Transformada de Fourier
Inicialmente, recorreu-se à espectroscopia de FTIR, na região de amida I, para fazer uma primeira análise ao estudo da cinética do soro de queijo com 100U de TG/g de proteína em solução, na condição de pré-tratamento (iv) com aquecimento seguido de acerto de pH.
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350
(i) sem aquecimento sem acerto de pH
%
N
(g/100
g)
Condições da amostra
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Assim obtiveram-se os espectros, relativos aos diferentes pontos temporais do estudo cinético, apresentados na figura III.50. (tabela 0.51 em anexo)
Figura III.50: Espectros, obtido pela espetroscopia de FTIR na região da banda de amida I, do estudo cinético da reticulação de soro de queijo com 100U de TG/g de proteína na condição de pré- tratamento (iv) com aquecimento seguido de acerto de pH.
Fazendo uma análise inicial ao aspeto geral dos espectros, figura III.50, verificamos que todos apresentam o mesmo comportamento, sendo muito semelhantes entre si. Contudo, e a partir da hora seis, há o aparecimento de um pequeno ombro por volta dos 1660cm-1. Este
ombro surge na gama das folhas-β sendo um indicativo de reticulação.72
Não existe nenhum tipo de linearidade quanto ao aumento de horas de cinética e a intensidade, não podendo ser retiradas quaisquer tipo de conclusões, figura III.50. É de salientar que o espectro correspondente ao início da reação de reticulação, hora zero, é o que apresenta valores de intensidade mais baixos, e que o espectro que apresenta valores de intensidade mais elevados corresponde à amostra retirada com duas horas de reação, figura III.50. Verifica-se também que os espectros correspondentes à hora quatro e dez se encontram sobrepostos, figura III.50.
Realizou-se ainda a desconvolução dos espectros obtidos através da espectroscopia de FTIR, através da aplicação de tratamentos matemáticos, recorrendo ao programa PeakFit v4.12. (figura III.51 e tabela 0.51 em anexo) Desta forma, foi possível obter as bandas, e respetivas áreas relativas em percentagem, correspondestes às diferentes estruturas secundárias dos polímeros das proteínas presentes na solução de soro de queijo reticulada com TG. Sendo elas as folhas-β intermoleculares e intramoleculares e as hélices-α. (figura III.51 e tabela 0.51 em anexo)
De forma a obter-se uma análise mais concisa e direta, calculou-se o somatório das áreas analíticas relativas de todas as folhas-β em solução e das hélices-α, figura III.51 e tabela 0.51 em anexo. 0 0,02 0,04 1600 1620 1640 1660 1680 1700 A b sor v ân ci a Nº de onda (cm-1) 0h 2h 4h 6h 8h 10h
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Figura III.51: Percentagem das áreas analíticas das bandas obtidas da desconvolução dos espectros da espectroscopia de FTIR, através do programa PeakFit v4.12, correspondentes às estruturas secundárias das amostras do estudo cinético da reticulação de soro de queijo com 100U de TG/g de proteína na condição de pré-tratamento (iv) com aquecimento seguido de acerto de pH, na região de amida I.
Comparando os valores dos somatórios das áreas analíticas das folhas-β com as áreas analíticas das hélices-α, figura III.51, verifica-se que estas últimas são sempre bastantes inferiores, sendo um sinal de reticulação.39,72,95,97
A reticulação das proteínas do soro de queijo na presença de TG permite a observação de ligeiras diferenças, na região de amida I, quando comparadas com as alterações provocadas pela desnaturação térmica.72 Na reação de reticulação, o microambiente em torno
do grupo carbonilo da cadeia lateral da glutamina que vai reagir com a lisina é alterado, dando origem a alterações na região de amida I. Contudo, o número de novas ligações formadas, que interferem na cadeia central das proteínas, é baixo levando a poucas alterações no espectro.72
A TG, ao favorecendo a formação das ligações ε-(γ-glutamil)lisina, dá origem a novas ligações intermoleculares, quando a reação ocorre entre duas moléculas diferentes.105 Assim ocorre a formação de novas ligações de pontes de hidrogénio, que podem ser intermoleculares ou intramoleculares. Desta forma há uma reorganização das estruturas secundárias das proteínas provocando um aumento tanto da influência das folhas-β intermoleculares como das folhas-β intramoleculares.72,106,107
Analisando o aspeto geral consoante as horas da reação de reticulação, figura III.51, verifica-se que vai havendo um aumento das folhas-β até à hora seis, indicando um aumento da reticulação pela TG das proteínas do soro de queijo ao longo do tempo. 39,40,72,91,97 A partir da hora seis, figura III.51, há uma diminuição da influência das folhas-β em solução, indicando que a reação de reticulação atingiu o seu patamar de saturação.72,105–107 (tabela 0.51 em anexo)
Podemos concluir, que o melhor tempo de reação é até às 6h uma vez que é onde se regista o máximo de folhas-β e um mínimo de hélices-α em solução de soro de queijo (figura
0 20 40 60 80 0h 2h 4h 6h 8h 10h Folhas-β Hélices-α
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III.51 e tabela 0.51 em anexo) e consequentemente onde se regista maior reticulação das proteínas do soro de queijo em solução. 39,40,72,91,97
3.4.2. Análise segundo a eletroforese em gel de poliacrilamida: SDS-PAGE
De forma a complementar e confirmar os resultados obtidos pela espectroscopia de FTIR, recorreu-se à análise das mesmas amostras pela eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%. Para tal correram-se as amostras referentes às diferentes horas de cinética na presença e na ausência do agente redutor, β-Me, figura III.52 e figura III.53, respetivamente.3.4.2.1.
Com adição de β-Mercaptoetanol
Figura III.52: Gel de poliacrilamida a 12% relativo à cinética da reação de reticulação do soro de queijo com 100U de TG/g de proteína, na condição de pré-tratamento (iv) com aquecimento seguido do acerto de pH, com o soro de queijo a 10% diluído para 30 mg/mL com adição de β-Me. Poço 1 Marcador de PM Low range da BioRad; Poço 2 a 7: soro de queijo com TG 100U/g de proteína no soro e tempos de incubação indicados.
Analisando o gel de SDS-PAGE onde as amostras correram sem adição do agente redutor, β-Me, figura III.52. A existência de polímeros de elevado peso molecular no topo do gel assim como a existência de retenção de amostra nos poços, figura III.52, é justificada pela formação de polímeros de elevado peso molecular, durante a reação de reticulação, que não conseguem entrar na rede do gel e ficam retidos nos poços. 35,105,108–110,116,123
É de notar uma ligeira diminuição da banda que aparece no fundo do gel, figura III.52, que corresponde aos monómeros das proteínas dominantes do soro comercial (β-Lg e α-La, 18,4kDa e 14kDa, respetivamente) e da banda que aprece por volta dos 36kDa que corresponde ao dímero da β-Lg. 33,35,73,109,110 As proteínas, sendo reticuladas pela TG, formam
agregados e polímeros de elevado peso molecular, deixando de aparecer na forma de monómeros ou dímeros e, consequentemente, diminuindo a sua banda correspondente. Desta forma é possível provar que a reação de reticulação efetivamente ocorreu.72,105,109,110,116,123
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3.4.2.2.
Sem adição de β-Mercaptoetanol
Figura III.53: Gel de poliacrilamida a 12% relativo à cinética da reação de reticulação do soro de queijo com 100U de TG/g de proteína, na condição de pré-tratamento (iv) com aquecimento seguido do acerto de pH, com o soro de queijo diluído para 30 mg/mL sem adição de β-Me. Poço 1: Marcador de PM Low range da BioRad; Poço 2 a 7: soro queijo com TG 100U/g de proteína no soro e tempos de incubação indicados.
Analisando agora o gel de poliacrilamida a 12%, com as mesmas amostras que o anterior mas sem a adição do β-Me, figura III.53, verifica-se a existência de arrastamento das amostras. Este arrastamento é justificado pela ausência do agente redutor que, não tendo reagido com os agregados, co-agregados, e polímeros formados pela reticulação, não os reduziu a agregados ou monómeros com pesos moleculares equivalentes. O arrastamento da amostra é essencialmente composto por polímeros, das proteínas do soro comercial que reagiram com a TG, com pesos moleculares intermédios.105,109,110,116
A diminuição da banda no fundo do poço correspondente aos monómeros da β-Lg e da α-La, 18,4kDa e 14kDa, respetivamente, assim como a diminuição da banda correspondente ao dímero da β-Lg, a 36kDa, figura III.53, vem provar a existência de reticulação. 33,35,73,109,110
Com a reticulação enzimática, são formados polímeros de elevado peso molecular que, na maioria das vezes, não conseguem ser pipetados e não chegar a entrar nos poços do gel, como é o caso da figura III.53, onde a ausência das bandas no topo do gel, nem sempre são sinónimo de falta de reticulação. 35,109,123
Devido à falta de informação relativa aos polímeros de elevado peso molecular no topo do gel e ao facto de não haver uma diminuição da intensidade da mancha correspondente aos monómeros das proteínas, β-Lg e α-La, é difícil averiguar, através da técnica de SDS-PAGE, qual a melhor hora de cinética. Contudo, consegue-se provar que ocorreu a reticulação da β- Lg, pela diminuição da banda correspondente ao seu dímero. 33,35,73,109,110
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