O estudo cinético da reticulação da β-lactoglobulina realizou-se com a melhor condição de pré-tratamento, com aquecimento seguido do acerto de pH (iv), e com a melhor concentração de transglutaminase, 100U de TG/g de proteína (b).
A cinética da reação de reticulação da proteína com a enzima foi de 10h na estufa a 50°C (WTC binder, 7200). Retirou-se as amostras de duas em duas horas e colocou-se num banho de água e gelo a 4°C durante 10 minutos para parar a reação.
As amostras foram guardadas para analisar no FTIR e em eletroforese de proteínas em SDS-PAGE (pontos 4 e 5, respetivamente). As amostras analisadas na espectroscopia de FTIR foram utilizadas numa concentração a 5%, após um estudo onde se determinou a melhor concentração a utilizar, assim como as amostras resolvidas nos géis de poliacrilamidade em SDS foram diluídas para 30mg/m. A restante amostra foi congelada para os estudos posteriores.
Preparação do soro comercial
2.
O soro de leite comercial, ou whey comercial (Total Whey, com sabor a morango), foi fornecido pela Gold Nutrition. É preparada uma mistura de soro comercial e D2O a 10%. A
mistura é agitada durante 1h até o soro se dissolver por completo. São preparadas cinco condições de pré-tratamento (referidas no ponto 1, i a v).
Outubro de 2017
O aquecimento das amostras é feito num banho (memmert) a 80°C, previamente aquecido, durante 1h. As amostras são aquecidas com a finalidade de desnaturar a β-Lg, proteína dominante do soro, que apresenta uma estrutura terciária compacta.
O acerto de pH, a pH 7 (pH ótimo da transglutaminase) é feito uma vez que a mistura de soro comercial a 10% apresenta, na maioria dos casos, um pH inferior a 7. Para se atingir o pH desejado é adicionado à amostra uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0.1N (JMS, José Manuel Gomes dos Santos, 98,5%). Para se realizar o acerto de pH foi utilizado o medidor de pH Crison (micro pH 2001).
De cada condição retiraram-se três alíquotas para realizar a determinação das proteínas pelo método de Kuchroo e Fox (ponto 6) e analisar por FTIR e eletroforese de proteínas em SDS-PAGE (ponto 4 e 5, respetivamente). As amostras analisadas na espectroscopia de FTIR foram utilizadas numa concentração a 9%, após um estudo onde se determinou a melhor concentração a utilizar, assim como as amostras resolvidas nos géis de poliacrilamidade em SDS foram diluídas para 30mg/mL. A restante amostra foi congelada para os estudos posteriores.
2.1.
Adição de transglutaminase ao soro comercial
Numa primeira fase adicionou-se 50U de TG/g de proteína às cinco condições de pré- tratamento do soro comercial indicadas anteriormente. Após a adição de TG as amostras devem ser tapadas para evitar que a enzima reaja com o ar. As amostras são agitadas durante 20 minutos, à temperatura ambiente, para se misturar completamente e iniciar a reação. Posteriormente, as amostras são colocadas na estufa (WTC binder, 7200), previamente aquecida a 50°C durante 12h. Seguidamente, as amostras são colocadas num banho de água e gelo a 4°C para parar a reação.
Das alíquotas guardadas foi retirada a amostra em estudo para realizar a analise por FTIR, e eletroforese de proteínas em SDS-PAGE, (pontos 4 e 5, respetivamente). As amostras analisadas na espectroscopia de FTIR foram utilizadas numa concentração a 9%, após um estudo onde se determinou a melhor concentração a utilizar, assim como as amostras resolvidas nos géis de poliacrilamidade em SDS foram diluídas para 30mg/mL. A restante amostra foi congelada para os estudos posteriores.
2.2.
Estudos cinéticos de reticulação pela transglutaminase
O estudo cinético do soro comercial com a TG foi realizado nas duas melhores condições de pré-tratamento e de concentração de enzima.
Na condição de pré-tratamento com acerto de pH seguido de aquecimento (v), realizou- se uma cinética de 24h onde se foram retirando alíquotas de amostras em diferentes intervalos de tempo. Inicialmente dissolveu-se 50U de TG/g de proteína de soro comercial 10%. A mistura ficou a agitar durante 20 minutos até a enzima se dissolver completamente. Para iniciar a reação de reticulação as amostras foram para a estufa (WTC binder, 7200) a 50°C durante o
Outubro de 2017
tempo da cinética. A fim de parar a reação, as alíquotas foram colocadas num banho de água e gelo a 4°C durante 10 minutos.
Das alíquotas foram retiradas amostras para realizar a análise por FTIR, e por eletroforese de proteínas em SDS-PAGE (pontos 4 e 5, respetivamente). A restante amostra foi congelada para os estudos posteriores.
Na condição de pré-tratamento com aquecimento seguido de acerto de pH (iv), a cinética da reação com a transglutaminase realizou-se consoante o procedimento descrito na condição anterior mas neste caso, seguiu-se a cinética ao longo de 10h na presença de 100U de TG/g de proteína.
Preparação do Soro de Queijo
3.
O soro de queijo foi fornecido pela Lactovouga – lacticínios e derivados Lda. Mediu-se o pH (Crison, micro pH 2001), fez-se a determinação das proteínas pelo método de Kuchroo e Fox (ponto 7) e analisaram-se no FTIRe em eletroforese de proteínas em SDS-PAGE (pontos 4 e 5, respetivamente).
Preparou-se o soro de queijo na condição com aquecimento seguido de acerto de pH (iv). Para tal colocou-se a amostra de soro de queijo num banho de água a 80°C (memmert) durante 1h e posteriormente acertou-se o pH a 7 (Crison, micro pH 2001) com a adição de NaOH 0.1N (JMS, José Manuel Gomes dos Santos, 98,5%). A amostra foi congelada para análises posteriores.
3.1.
Estudos cinéticos de reticulação pela transglutaminase
O estudo cinético da reticulação do soro de queijo pela transglutaminase realizou-se com a condição de pré-tratamento com aquecimento seguido de acerto de pH (iv) com a adição de 100U de TG/g de proteína. Realizou-se uma cinética de 10h na estufa (WTC binder, 7200) a 50°C onde se foram retirando alíquotas de duas em duas horas. Posteriormente colocou-se as alíquotas num banho de água e gelo a 4°C a fim de parar a reação de reticulação.
As alíquotas foram guardadas para analisar no FTIR, e em eletroforese de proteínas em SDS-PAGE (pontos 4 e 5, respetivamente). As amostras analisadas na espectroscopia de FTIR foram utilizadas numa concentração a 1,7%, após um estudo onde se determinou a melhor concentração a utilizar. A restante amostra foi congelada para os estudos posteriores.