C. MATERIAL SUPLEMENTAR: PARTE
C.1 Diagnostico de Consistência do Núcleo (CORCONDIA)
5.5 ANÁLISE DOS ESPECTROS DE FLUORESCÊNCIA COM OS MÉTODOS
Os dados de fluorescência podem ser organizados em uma matriz X, denominada de matriz de excitação e emissão, onde cada linha desta matriz é um espectro de emissão do comprimento de onda de excitação i e cada coluna é um espectro de excitação do comprimento de onda de emissão j. Para um conjunto de amostras, os dados podem ser organizados em um arranjo de três modos, como mostra a figura 5.4, onde os modos A, B e C são respectivamente os modos de excitação, emissão e das amostras.
Assumindo que a concentração de cada espécie fluorescente é proporcional à variação da intensidade de radiação, podemos usar um modelo trilinear como o da equação 5.1 para descrever a variação das medidas de fluorescência no arranjo X.
T )
(F S
K
XKxIJ = |⊗| 5.1
Na equação 5.1, o vetor coluna sr da matriz S é o espectro de excitação da substância r, o vetor coluna fr da matriz F é o espectro de emissão e o vetor coluna kr da matriz K informa a concentração da substância r nas amostras que compõe o arranjo X.
Figura 5.4. Arranjo em três modos X formado por um conjunto de matriz de excitação e emissão.
O modelo trilinear da equação 5.1 pode ser ajustado com o método PARAFAC para obter o modelo mostrado abaixo:
E A B C X = ( |⊗| )T + KxIJ 5.2
onde A, B e C são as respectivas estimativas dos parâmetros do modelo mecanístico K, F e S definido na equação 5.1 e a matriz E é a parte do arranjo X que não pode ser modelada pela estrutura trilinear do modelo 5.2.
O método PARAFAC é uma ferramenta extremamente importante para a análise de matrizes de excitação e emissão, entretanto, é necessário ter alguns cuidados quando este método é usado para a análise dos dados de fluorescência. Alguns elementos
X
Emissão B Excitação
A C
presentes na matriz de excitação e emissão podem não seguir o comportamento trilinear descrito pela equação 5.1, como os picos de espalhamento Rayleigh e Raman.144
Antes de decompor o arranjo X com o método PARAFAC é necessário fazer um pré- tratamento nos dados para eliminar os picos associados ao espalhamento Rayleigh e Raman. A forma mais usada é substituir estes picos por valores ausentes,160,161 onde os dados são simplesmente removidos, não sendo adicionado valor algum em seus lugares. Para análise de um arranjo contendo valores ausentes é necessário modificar o algoritmo ALS, pois além de uma estimativa dos parâmetros é necessário também fazer uma estimativa para os valores que faltam. Uma discussão sobre como tratar um conjunto de dados com valores ausentes é apresentada por Walczak e Massart.162,163
Outra forma de eliminar os dados da matriz de excitação e emissão que não seguem um modelo trilinear é substituir estes dados por valores iguais a zero.164,165 Este procedimento é prático e pode ser usado com o algoritmo ALS convencional, todavia, este procedimento deve ser executado com cautela visto que o procedimento de colocar valores iguais a zero pode alterar a estrutura de correlação das variáveis da matriz de excitação e emissão.160 Outra forma de resolver o problema é utilizar o método de ajuste
ponderado do PARAFAC, de modo que são adicionados pesos pequenos para a região da matriz de excitação e emissão que contém os picos de espalhamento Rayleigh enquanto que para a região contendo os espectros de fluorescência das substâncias é dado um peso maior no ajuste do modelo.166
5.6 PARTE EXPERIMENTAL
5.6.1 Experimentos conduzidos no bioreator para a produção de
violaceína pela Chromobacterium violaceum
A fermentação foi realizada em um bioreator BIOSTAT B2 (B. Braun Biotech). O meio de cultura foi preparado por dissolução de 7,5 g de glicose, 7,5 g de peptona bacterológica e 3.2 g de extrato de levedura em 1,5 L de água. O meio de cultura foi esterilizado em autocalave durante 30 minutos a uma temperatura de 121o C e 1 Kgf/cm2. Após a esterilização o reator foi mantido em repouso até atingir a temperatura de 30 o C.
Uma suspensão da C. violaceum, contendo aproximadamente 1,0 x 1011 bactérias por dm3 em uma solução salina de polifosfatos tamponada (PBS) 10 %, foi adicionada ao meio de cultura.
Durante a fermentação, a temperatura do bioreator foi mantida constante a 30o C através de um sistema de controle automático. O fluxo de ar comprimido foi mantido a 1, 5 L min-1 e a velocidade de agitação do meio de cultura em 200 rpm. O pH do meio de cultura não foi controlado. Durante as fermentações foram feitas medidas em tempo real do teor de oxigênio dissolvido e do pH do meio de cultura.
5.6.2 Coleta das amostras
As amostras do meio de cultura foram retiradas com o auxílio de seringas plásticas. durante a fase exponencial de crescimento da bactéria em intervalos regulares de 2 horas, sendo que a primeira amostra foi coletada após 8 horas da inoculação e a última amostra foi retirada após 22 horas. No total foram coletadas 8 amostras com um volume de 10 mL.
Cada amostra foi centrifugada e a fração líquida separada da biomassa. Uma alíquota de 3 mL de etanol foi adicionada ao tubo de centrifuga contendo a biomassa (separada do sobrenadante), para dissolução dos metabólitos sob agitação vigorosa, com auxílio da própria seringa. Em seguida, a fase orgânica foi filtrada em um filtro de nitrocelulose com um tamanho de poro de 0,45 µm para a separação do material sólido. O filtrado foi usado para as medidas no espectrofluorimetro.
5.6.3 Aquisição dos espectros eletrônicos de excitação e emissão
Todos os espectros eletrônicos de excitação e emissão foram coletados com um espectrofotômetro de luminescência modelo LS 55 da Perkin Elmer. O espectro de excitação foi registrado entre 200 e 700 nm, em intervalos regulares de 10 nm. Os espectros de emissão foram coletados entre 200 e 800 nm em intervalos regulares de 0,5 nm. A velocidade de aquisição dos espectros foi 1500 nm min-1 e a largura da fenda usada
5.6.4 Tratamento matemático dos dados espectroscópicos
Todos os espectros de excitação e emissão foram gravados em arquivos de extensão ASCII para importação dos dados entre diferentes softwares. O software MATLAB 6.5 (Mathworks) foi utilizado para o tratamento matemático dos dados de espectroscopia.
O método PARAFAC foi usado para decompor o arranjo de matrizes de excitação e emissão (figura 5.4) em um modelo trilinear (equação 5.2). O programa usado neste trabalho é de autoria própria e utiliza o algoritmo ALS modificado para o tratamento dos valores ausentes adicionados na matriz de excitação e emissão. As funções utilizadas para incluir restrições de não negatividade nos modelos foram obtidas da página da internet mantida por Bro,167 e estas funções foram incorporadas no programa PARAFAC.
5.6.4.1 Análise das matrizes de excitação e emissão com o método
PARAFAC
Para cada matriz de emissão e excitação foram adicionados valores ausentes nas posições correspondentes aos picos de espalhamento Rayleigh e nos comprimentos de onda de emissão abaixo dos comprimentos de onda e excitação. Este procedimento foi executado pela substituição do dado de intensidade de radiação pelo valor “nan” que é o padrão adotado pelo software MATLAB. O método PARAFAC foi adaptado para o tratamento de dados ausentes de acordo com a metodologia proposta por Walczak.162
O número de componentes do modelo trilinear foi escolhido a partir da avaliação simultânea das funções CORCONDIA168 e porcentagem da variação explicada pelo modelo definida na equação abaixo:
(
)
( )
− − × =∑∑∑
∑∑∑
= = = = = = 2 1 1 1 2 1 1 1 ˆ 1 100 % I i J j K k ijk I i J j K k ijk ijk x x x VAR 5.3onde xijk é a medida de intensidade de radiação fluorescente no comprimento de onda de excitação i, emissão j na amostra k. O elemento xˆijk é o valor correspondente a xijk predito pelo modelo empírico trilinear (equação 5.2) ajustado com o método PARAFAC. Além disto, os resíduos do modelo foram inspecionados para verificar se há ou não algum tipo de variação sistemática não modelada pelo modelo trilinear.
5.6.5 Organização dos dados.
Os espectros de excitação e emissão das amostras foram divididos em diferentes arranjos em três modos. O arranjo X1 foi formado pelo conjunto de três amostras coletadas
8, 10 e 12 horas após o começo da reação e os espectros de excitação entre 240 e 300 nm com seus respectivos espectros de emissão entre 290,5 e 400 nm.
Um segundo arranjo denominado de X2 foi formado com as oito amostras coletadas
ao longo do experimento de fermentação e espectros de excitação e emissão iguais ao do arranjo X1. Um outro arranjo denominado de X3 foi formado com as oito amostras, mais os
espectros de excitação entre 240 e 290 nm com os respectivos espectros de emissão entre 290,5 e 490,5 nm. Por fim, um arranjo denominado deX4 foi formado pelos espectros
de excitação entre 240 e 410 nm e seus respectivos espectros de emissão entre 420 e 550 nm, com as oito amostras coletadas entre oito e vinte duas horas de fermentação.
Um modelo trilinear foi ajustado em cada caso usando o método PARAFAC com restrições de não-negatividade para os três modos de monitoramento. Todos os cálculos foram iniciados com valores aleatórios como uma primeira estimativa das matrizes Co e
Bo.