4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3. Análise dos lipídios diferenciais
Após o pré-tratamento, determinou-se também os lipídios diferenciais, que foram escolhidos por meio de análises como t-test e Jackknife, que diferentemente do t-test, faz uso de uma abordagem multivariada para determinar se um determinado feature é estatisticamente significativo [81]. Assim, determinaram-se os
features diferenciais por meio da análise do gráfico de loadings de PLS-DA, que se
baseia na contribuição das diferentes variáveis para a separação entre os grupos controle e bipolar. De acordo com os VIP scores e os resultados do t-test, Jackknife e da análise da relação sinal/ruído (S/N), obtiveram-se 63 features com níveis aumentados no grupo bipolar e 58 features com níveis aumentados nas amostras controle nas análises feitas no modo negativo, que contribuíram para o agrupamento dos grupos no modelo PLS-DA, após removermos os isotopólogos. No modo positivo, obtiveram-se 37 features com níveis aumentados nas amostras controle e 49 features aumentados nas amostras bipolares. Para ajudar a ilustrar a diferenciação dos features, calculou-se também o fold change, que mostra a razão da intensidade de cada feature em relação aos diferentes grupos, calculado utilizando a razão entre as intensidades não normalizadas médias dos metabólitos nas amostras teste e nas amostras controle, onde valores maiores que 1 indicam um aumento do metabólito nas amostras teste (em relação às amostras controle), e menores que 1 indicam uma diminuição do metabólito em questão. Para o modo negativo, obtiveram-se os features diferenciais por meio do gráfico de loadings do modelo PLS-DA, por não ser possível utilizar o S-plot do modelo OPLS-DA nesse caso, devido ao uso do escalamento UV nessas amostras. No modo positivo, utilizou-se o escalamento Pareto, sendo assim possível a utilização do S-plot do modelo OPLS-DA para identificar os features diferenciais. O gráfico dos loadings do modelo PLS-DA utilizado para identificar os features diferenciais no modo negativo é
apresentado na Figura 20, enquanto que o S-plot utilizado para identificar os
features diferenciais no modo positivo é apresentado na Figura 21.
Figura 20. Gráfico de loadings do modelo PLS-DA utilizado para encontrar os features diferenciais entre os grupos bipolar e controle, para o modo ESI negativo.
Figura 21. Gráfico S-plot do modelo OPLS-DA utilizado para encontrar os features diferenciais entre os grupos bipolar e controle, para o modo ESI positivo.
As m/z dos features diferenciais foram analisadas no banco de dados do LIPID MAPS (www.lipidmaps.com), utilizando os adutos [M-H]-, [M+OAc]- e [M+Cl]- para o modo negativo e os adutos [M+H]+, [M+K]+, [M+Na]+ e [M+NH4]+ para o modo positivo, onde o maior número de matches obtidos em relação à m/z inserida foi selecionado e em seguida classificados pelo Sistema de Classificação de Lipídios do LIPID MAPS. Após a classificação, os features com a mesma classe de lipídios em cada um dos grupos foram agrupados e um gráfico contendo estes lipídios e suas classes foi feito tanto para o grupo controle quanto para o grupo bipolar, estes representados pelas Figuras 22 e 23, respectivamente, para o modo negativo, e pelas Figuras 24 e 25, para o modo positivo.
Figura 22. Classes de lipídios do grupo controle obtidas usando o banco de dados do LIPID MAPS no modo ESI negativo.
Figura 23. Classes de lipídios do grupo bipolar obtidas usando o banco de dados do LIPID MAPS no modo ESI negativo.
26.53% 6.12% 63.27% 4.08%
Controle
Acil graxos Glicerolipídios Glicerofosfolipídios Esfingolipídios 27.87% 8.20% 52.46% 11.48%Bipolar
Acil graxos Glicerolipídios Glicerofosfolipídios EsfingolipídiosFigura 24. Classes de lipídios do grupo controle obtidas usando o banco de dados do LIPID MAPS no modo ESI positivo.
Figura 25. Classes de lipídios do grupo bipolar obtidas usando o banco de dados do LIPID MAPS no modo ESI positivo.
Analisando as Figuras 22 e 23, podemos ver a distribuição das classes de lipídios entre os grupos, assim, sendo possível observar uma diferença nos níveis de esfingolipídios e de glicerofosfolipídios. Essa diferença nos níveis de lipídios pode ser explicada pelas alterações bioquímicas causadas pelo transtorno bipolar. Analisando a literatura disponível, é citado que a desregulação do metabolismo das fosfatidilcolinas e ceramidas pode ser causada por fatores intrínsecos ao transtorno bipolar, onde níveis alterados de ceramidas podem não estar relacionados com a redução nos níveis de fosfatidilcolina, mas sim relacionado com algum tipo de
27.78% 5.56% 63.89% 2.78%
Controle
Acil-Graxos Glicerolipídios Glicerofosfolipídios Esfingolipídios 40.43% 8.51% 44.68% 6.38%Bipolar
Acil-graxos Glicerolipídios Glicerofosfolipídios Esfingolipídiosalteração na síntese de ceramidas, que possuem um papel importante na modulação da transdução de sinal de algumas vias metabólicas, como as responsáveis pela diferenciação e crescimento de células, apoptose e resposta ao estresse intracelular, levando a crer que tais mudanças no metabolismo refletem em mudanças no sistema nervoso central, tal como em tecidos periféricos, pelo fato de alterações nos lipídios no cérebro já terem sido relacionadas com outras doenças neurodegenerativas e neuropsiquiátricas [82]. Ainda, também foram obtidas informações em relação ao uso do valproato, outra droga utilizada para o tratamento do transtorno bipolar, que pode acarretar disfunções na biossíntese de fosfolipídios, devido à diminuição do inositol intracelular, que regula a biossíntese de fosfolipídios para as cardiolipinas, fosfatidilcolinas e fosfatidilinositóis. Na presença de inositol, a síntese de fosfatidilinositol é aumentada, entretanto, o custo para esse aumento é a diminuição da síntese de outros glicerofosfolipídios, como as fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas, fosfatidiletanolaminas e cardiolipinas, por haver uma quantidade maior da enzima que controla a síntese de fosfatidilinositóis.Neste caso, como todos estes glicerofosfolipídios utilizam em suas sínteses o mesmo tipo de precursor (CDP-diacilglicerol), há a diminuição da sua disponibilidade para as sínteses dos outros glicerofosfolipídios. [83].
Os resultados obtidos no modo positivo, mostrados nas Figuras 24 e 25, também sugerem esta disfunção nos glicerofosfolipídios, além de mostrar também uma desregulação nos níveis de acil-graxos. Estudos em animais mostram que o aumento da sinalização imune-inflamatória correspondente a um déficit nos ácidos graxos ômega-3 podem coincidir com o início da fase de mania do transtorno bipolar, e o uso crônico de estabilizadores de humor, assim como antipsicóticos de segunda geração podem levar a alterações nas cadeias dos ácidos graxos [84]. Resultados de outros grupos de pesquisa também corroboram com os resultados obtidos, onde os níveis dos acil-graxos apresentaram também desregulação em relação ao grupo controle, especialmente os ácidos linoléicos, ácidos araquidônicos e ácidos α- linoléicos [85], assim como os níveis de fosfatidilcolinas e ceramidas nos cérebros
post-mortem de pacientes com transtorno bipolar [82], sendo que estas alterações